पता लगाने और गैस चरण मुख्यधारा सिगरेट के धुएँ में फ्री रेडिकल्स की सफाई के लिए एक प्रोटोकॉल

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

सिगरेट धूम्रपान मानव कैंसर के साथ जुड़ा हुआ है. यह बताया गया है कि फेफड़ों के कैंसर मौतों के सबसे अधिक सिगरेट ^{धूम्रपान} 5,6,7,12 द्वारा कारण हैं . हालांकि तंबाकू और सिगरेट के धुएं के कण चरण में tars संबंधित उत्पादों कासीनजन और mutagenic संबंधित रोगों के प्रमुख कारण होते हैं, सिगरेट का धुआँ मुक्त कण है कि ^9,10 carcinogens की एक महत्वपूर्ण समूह के रूप में भी माना जाता है के महत्वपूर्ण मात्रा में होता है है. मुक्त कण हानिकारक प्रोटीन संरचना, lipids और डीएनए दृश्यों के द्वारा सेल घटक का दौरा और कैंसर के विभिन्न प्रकार के विकास के जोखिम में वृद्धि. साँस कण adducts है ^कि 3 फेफड़ों में तम्बाकू धूम्रपान के नकारात्मक प्रभाव स्वास्थ्य के कई करने के लिए योगदान का उत्पादन. अध्ययन करने के लिए सिगरेट के धुएं में मुक्त कण को ​​कम करने के लिए धूम्रपान प्रेरित क्षति के जोखिम में कमी करने के लिए आयोजित किया गया है. यह बताया गया है कि हीमोग्लोबिन और heme युक्त यौगिकों आंशिक रूप से नाइट्रिक ऑक्साइड, प्रतिक्रियाशील मांजना सकताoxidants और सिगरेट का धुआँ ⁴ के कासीनजन अस्थिर nitrosocompounds. ए 'जैव फिल्टर शामिल की हीमोग्लोबिन और सक्रिय कार्बन मुक्त कण मांजना और मुक्त कण के 90% सिगरेट धूम्रपान ¹⁴ से हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, लागत नालायकी के कारण, इसे सफलतापूर्वक नहीं किया गया commercialized है. एक अन्य अध्ययन shikonin, चीनी हर्बल दवा ⁸ के एक घटक की अच्छी सफाई दक्षता दिखाया. वर्तमान अध्ययन में, हम फिल्टर सिगरेट में सिगरेट के धुएं और गैस चरण मुक्त कण पर मुख्यधारा सिगरेट के धुएँ में मांजना प्रभाव (एमसीएस) माप में गैस चरण मुक्त कण सफाई स्पिन फँसाने का उपयोग करने के लिए आम प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट के अर्क को शुरू करने के लिए एक प्रोटोकॉल रिपोर्ट इलेक्ट्रॉन स्पिन गूंज (ESR) ^1,2,14 स्पेक्ट्रोस्कोपी. हम लाइकोपीन और अंगूर बीज निकालने जो सिगरेट के फिल्टर में उनके भविष्य के आवेदन करने के लिए बात कर सकता के उच्च सफाई क्षमता से पता चला है. इन पेशेवरों का एक महत्वपूर्ण लाभpective मैला ढोने वालों कि वे टमाटर या वाइन उद्योग के byproducts क्रमशः ^11,13 से बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है

1. सामग्री

सभी इस काम में इस्तेमाल किया सॉल्वैंट्स अभिकर्मक ग्रेड थे. (PBN) एन tert - butyl-α-phenylnitrone और मानक स्पिन लेबल सहित स्पिन जाल, 2,2,6,6 tetramethyl 1 piperinyoxyl (गति) सिग्मा से प्राप्त किया गया और इस्तेमाल किया गया के रूप में आपूर्ति. संयंत्र एंटीऑक्सिडेंट वाणिज्यिक Swanson, Inc संयुक्त राज्य अमेरिका से प्राप्त किया गया.

2. सिगरेट के धुएं और मुक्त कण विश्लेषण की तैयारी

1. फिल्टर में एंटीऑक्सीडेंट परिचय करने के लिए, एंटीऑक्सीडेंट Pycnogenol और अंगूर बीज निकालने के पहले 95% इथेनॉल में भंग थे, जबकि लाइकोपीन एसीटोन में भंग कर दिया गया था. विलायक मात्रा एंटीऑक्सीडेंट विलेयता के आधार पर अलग थे.
2. 0.4 के antioxidants की राशि मिलीग्राम / फिल्टर का इस्तेमाल किया गया था. वे तो सक्रिय कार्बन के 10 मिलीग्राम के साथ लेपित रहे थे. इस प्रयोजन के लिए सक्रिय कार्बन ~ anaerobic परिस्थितियों में एंटीऑक्सीडेंट समाधान के साथ 12 घंटे, वैक्यूम के अंतर्गत फ़िल्टर और सूखे के लिए हड़कंप मच गया था. एंटी तो पारंपरिक एसीटेट फिल्टर (सीए फिल्टर) में शुरू किए गए थे. इस प्रयोजन के लिए, फ़िल्टर दो टुकड़ों में काट दिया गया. लेपित संयंत्र antioxidants फिल्टर और टेप का एक टुकड़ा के साथ लिपटे के दो टुकड़े के बीच डाला गया के लिए एक फिल्टर के रूप में - सैंडविच एंटीऑक्सीडेंट फिल्टर (छवि 1A). इस संयुक्त फिल्टर बाद सिगरेट तम्बाकू युक्त छड़ से जुड़ा था. नियंत्रण फिल्टर कोई एंटीऑक्सीडेंट छोड़कर एंटीऑक्सीडेंट फिल्टर के रूप में एक ही रास्ते में बनाया गया था जोड़ा गया है.
3. धूम्रपान अनुकरण से पहले, अनुसंधान सिगरेट unpacked थे और एक निरंतर नमी वातावरण 2 दिनों की एक न्यूनतम के लिए एक संतृप्त NaBr समाधान का उपयोग कर (20 डिग्री सेल्सियस, 60% सापेक्ष आर्द्रता) में रखा.
4. दिनचर्या विश्लेषण के लिए धूम्रपान अनुकरण के परिवेश के तापमान पर प्रदर्शन किया गया था धूम्रपान एकल पोर्ट डिवाइस है, जो के रूप में Fig.1 में दिखाया का उपयोग, एक पानी चूषित्र या GAST DOA-P104-बी.एन. वैक्यूम पम्प / एयर (Benton Harbor, Mich) कंप्रेसर जुड़ा होते हैं स्पिन फँसानेएक खुले अंत के साथ टी जंक्शन के माध्यम से विधानसभा. Puffs खुले अंत जो कश के बीच खुला रहा plugging द्वारा प्रदर्शन किया गया. गैस प्रवाह प्रवाह मीटर से जाँच की थी और 2.2 ~ पर सेट SCFH = 17.5 / एमएल एक पंप और वेंट के बीच रखा वाल्व समायोजन द्वारा.
5. अनुसंधान सिगरेट के कश मात्रा में 35 एमएल की शर्त के तहत 2 सेकंड की अवधि के लिए धूम्रपान थे हर ⁶⁰ सेकंड, 1 करने के लिए इसी तरह दोहराया. गैस चरण मुक्त कण के आकलन मात्रात्मक के लिए धूम्रपान अनुकार स्पिन फँसाने के रूप में चित्र में दिखाया गया है प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में प्रदर्शन किया गया था. 1.
6. दस तीव्र कश (35 एमएल / कश) प्रत्येक सिगरेट के लिए ले जाया गया. गैस चरण मुक्त कण कैम्ब्रिज फिल्टर पैड के माध्यम से एमसीएस गुजर द्वारा एकत्र किए गए थे और फिर स्पिन फँसाने समाधान (बेंजीन, 2.0 एमएल में 0.05 एम PBN) में पेश किया.
7. आखिरी कश के बाद, bubbled फँसाने समाधान ही बेंजीन साथ अपनी प्रारंभिक मात्रा (2.0 एमएल) के लिए पुनः समायोजन किया गया था. एक विभाज्य एक ~ 25 में स्थानांतरित किया गया था0 लंबे मिमी, 3 मिमी आईडी गिलास एक अंत में बंद ट्यूब.
8. फँसाने समाधान एक फ्रीज पंप पिघलना प्रक्रिया का उपयोग कर deoxygenated था. यह तरल नाइट्रोजन के तहत जमे हुए किया गया था, और एक निर्वात लागू किया गया था. तो यह argon माहौल के तहत thawed गया था, फंस गैस बुलबुले से बचने के लिए अनुमति देता है, और फिर से जमी. इस चक्र के बाद तीन बार दोहराया गया था, ट्यूब था लौ सील वैक्यूम के अंतर्गत और आगे ESR माप में प्रयोग किया जाता है. इस कदम है क्योंकि ऑक्सीजन, जो अच्छी तरह से बेंजीन में घुलनशील है जैविक कण के ESR लाइनों broadens की आवश्यकता है. Deoxygenation नाटकीय रूप से संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार.
9. एक्स बैंड ESR स्पेक्ट्रा मानक शर्तों के तहत 9.34 गीगा की आवृत्ति पर एक Bruker EMX स्पेक्ट्रोमीटर पर दर्ज किए गए. स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स ज्यादातर प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया: केंद्र क्षेत्र 3312.5G, स्कैन चौड़ाई 80G, मॉडुलन आयाम 0.5g, समय लगातार 82 microseconds, स्कैन समय 40 सेकंड.
10. स्पिन जाल adducts प्रयोग शर्तों, जो कुछ मामलों में अनुरोध पर अपेक्षाकृत स्थिर रहे हैं25 राशि है, जो आमतौर पर ~ 20 मिनट लिया uired. हालांकि 12 बजे के बाद बेंजीन समाधान में ESR संकेतों की तीव्रता 5 ~ का एक पहलू से कम.
11. फँसाने अभिवर्तन की एकाग्रता यों के लिए, अपने प्रारंभिक ESR पहली व्युत्पन्न स्पेक्ट्रम एकीकृत किया गया. परिणामस्वरूप अवशोषण स्पेक्ट्रम एक व्यापक स्वेटर पृष्ठभूमि, सबसे अधिक संभावना कालिख / टार धुएं में निहित उत्पादों के कारण दिखाता है.
    
    इस पृष्ठभूमि के घटाव के बाद फँसाने अभिवर्तन के अलग triplet एक अधिक समय (छवि 2) एकीकृत किया गया.

3. प्रतिनिधि परिणाम

सिगरेट के उत्पादन धूम्रपान (गैस चरण) जल में मुक्त कण के अधिकांश तात्कालिक और अस्थिर कर रहे हैं. आदेश में इन कण का निरीक्षण करने के लिए एक स्पिन जाल तकनीक कार्यरत है. यह उन्हें एक स्पिन अभिवर्तन है जो और अधिक स्थिर है और ESR (Fig.1) के द्वारा पाया जा सकता में बदलने गैस चरण मुक्त कण कब्जा. वर्तमान अध्ययन में, 0.05 के समाधान के स्पिन जालएम PBN मुक्त कण, जो ऑक्सीजन और कार्बन केंद्रित कण जो ¹⁵ अलग करने के लिए मुश्किल हैं की एक मिश्रण चरण धूम्रपान गैस जमा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमारे मामले में, तथापि, मनाया hyperfine बंटवारे स्थिरांक _एन = 13.7G और एक _एच = 1.95G बहुत alkoxyl मुक्त कण (RO.) ² के adducts फँसाने, सुझाव है कि वे प्रमुख उत्पाद कर रहे हैं के लिए इसी मूल्यों के समान हैं. हम कि कमजोर ESR संकेतों और कम हमारे प्रारंभिक माप में मनाया reproducibility (छवि 2) से पता चला धूम्रपान प्रवाह में नमी के कारण थे. इस समस्या को हल करने के लिए, हम कैम्ब्रिज फिल्टर और स्पिन जाल समाधान के बीच एक तरल नाइट्रोजन जाल (LN2) जोड़ा गया. एल.एन. ₂ जाल जल्दी ठंड से एमसीएस प्रवाह से पानी हटा दिया है और यह ग्लास ट्यूब के भीतर दीवार पर कब्जा. यह बहुत ESR संकेतों में सुधार हुआ है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम (छवि 3) के लिए अनुमति दी.

फंस मुक्त कण की राशि एक का उपयोग कर निर्धारित किया गया थासंदर्भ नमूना. नियंत्रण नमूने के लिए एंटीऑक्सिडेंट बिना, बेंजीन में ठेठ अभिवर्तन एकाग्रता अपनी डबल अभिन्न स्पेक्ट्रम की गति की एकाग्रता के लिए जाना जाता है एक डबल अभिन्न स्पेक्ट्रम के साथ तुलना द्वारा अनुमान 1.24 सुक्ष्ममापी (Fig.2) था. के बाद से धूम्रपान के दौरान हवा की मात्रा प्रत्येक सिगरेट के माध्यम से पारित कर दिया ~ 350 मिलीलीटर, इस ~ 7.1X10 एम ^-9 के एमसीएस के गैस चरण में मुक्त कट्टरपंथी एकाग्रता के लिए एक अनुमान देता है, और कण की कुल संख्या गैस चरण से फंस 1.5X10 ~ ¹⁵ की एक पूरी सिगरेट की. दोनों गैस और कण चरण सहित एक पूरी सिगरेट के धुएं में मुक्त कण की कुल राशि के लिए अनुमान, ~ 10 ^{16 9} मुक्त कण था.

संयंत्र antioxidants के मुख्य धारा सिगरेट के धुएं में गैस चरण मुक्त कण पर सफाई प्रभाव के विभिन्न स्तरों पर मनाया गया. उनकी सफाई दर छवि में प्रस्तुत किए गए. 4. लाइकोपीन और अंगूर बीज निकालने के उच्चतम दर दिखाया कम, जबकिएर दर Pycnogenol (Fig.4) के लिए मनाया गया.

चित्रा 1. मुख्यधारा सिगरेट का धुआँ (MCS) में गैस चरण मुक्त कण का संग्रह स्पिन जाल का उपयोग करने के लिए बेहतर रहित अनुकार डिजाइन की एक आरेख. एमसीएस पानी चूषित्र द्वारा सीए फिल्टर, तो कैम्ब्रिज फ़िल्टर (पीला फिल्टर) के माध्यम से तैयार किया गया था और एक तरल नाइट्रोजन _जाल के माध्यम से पारित करने के लिए एच 2 ओ हटायें गैस चरण उत्पादों के अंत में जाल स्पिन करने के लिए चला गया और स्पिन जाल समाधान के माध्यम से bubbled. संयंत्र एंटीऑक्सिडेंट पारंपरिक एसीटेट फिल्टर के दो टुकड़ों के बीच रखा गया था (एक सर्कल में बढ़े) सिगरेट से जुड़ी एमसीएस में मुक्त कण मांजना.

चित्रा 2. स्पिन फँसाने बेंजीन में अभिवर्तन एकाग्रता के लिए एक मात्रात्मक अनुमान पहली एकीकरण से घटाकर आवश्यकता है एक व्यापक पृष्ठभूमि संकेतएल स्पेक्ट्रम. अभिवर्तन स्पिन फँसाने के लिए hyperfine बंटवारे _{मापदंडों} एच 1.95 = _जी, एन = 13.7G हैं .

चित्रा 3 LN2 जाल के माध्यम से पासिंग. ESR MCS की स्पिन को फँसाने द्वारा प्राप्त संकेतों की गुणवत्ता में काफी सुधार .

चित्रा 4. प्राकृतिक antioxidants के एमसीएस में मुक्त कण की एकाग्रता पर प्रभाव. - 100%, Pycnogenol - 55%, अंगूर बीज निकालने - 12%, लाइकोपीन - 10% नियंत्रण: रिश्तेदार संकेत तीव्रता.

तंबाकू के धुएं में विभिन्न मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने वालों के प्रभाव का एक विश्वसनीय अनुमान मुक्त कण के मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक की आवश्यकता है. ¹ इससे पहले, यह दिखाया गया है कि गैर ध्रुवीय सॉल्वैंट्स में उच्च एकाग्रता स्पिन जाल समाधान की छोटी मात्रा में तंबाकू के धुएं से मुक्त कण को फँसाने में सबसे प्रभावी हैं. सिगरेट के धुएं हमेशा से जल वाष्प कार्बनिक यौगिकों के दहन और तम्बाकू में अवशिष्ट नमी जो विलायक फँसाने में खत्म कर सकते हैं शामिल हैं. PBN स्पिन जाल समाधान में पानी का यह मिश्रण काफी स्पिन फँसाने adducts के जीवन और उनके ESR संकेतों की तीव्रता कम हो जाती है. इस नमी को हटाना एक U-आकार की ट्यूब के माध्यम से तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा सरल गुजर MCS द्वारा नाटकीय रूप से हमारे प्रयोगों में ESR स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में सुधार, भले ही गैस चरण कण के कुछ अंश भी जमे हुए सतह पर फंसे हो सकते है.

टी का उपयोगउनकी तकनीक हम विभिन्न प्राकृतिक यौगिकों सिगरेट फिल्टर में शुरू कट्टरपंथी सफाई के सापेक्ष दक्षता की तुलना में. हमने पाया है कि लाइकोपीन और अंगूर बीज निकालने के तुरंत सिगरेट फिल्टर में शामिल करने के बाद गैस चरण एमएससी से मुक्त कण के 90% अप करने के लिए मांजना कर रहे हैं. इस तरह उच्च क्षमता सफाई सबसे कुशल रिपोर्ट हीमोग्लोबिन और shikonine ^8,14 की तरह मुफ्त कट्टरपंथी संरक्षक के बीच इन सस्ते आसानी से उपलब्ध प्राकृतिक यौगिकों स्थान है. फिर भी, हमारे प्रयोगों की सिगरेट फिल्टर अध्ययन प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट के साथ लोड में उनके कमरे के तापमान पर भंडारण की एक सप्ताह के बाद सफाई क्षमता का एक महत्त्वपूर्ण हिस्सा खो दिया है. इस समस्या का हल लाइकोपीन और वाणिज्यिक सिगरेट फिल्टर में अंगूर बीज निकालने के भविष्य के आवेदन को प्रोत्साहित कर सकते हैं.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, अनुदान सं NIH / NCRR 016292 P41-RR (ACERT के लिए) द्वारा समर्थित किया गया.

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