卷烟主流烟气中检测和清除气相自由基议定书

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

吸烟是与人类癌症有关。据报道，大多数的肺癌死亡是由抽烟^5,6,7,12引起的。虽然烟草在香烟烟雾中的颗粒相的焦油和相关产品致癌，致突变有关的疾病的主要成因，香烟烟雾中含有大量自由基，也作为一个重要^的致癌物质9,10组的考虑。自由基攻击破坏蛋白质的结构，脂类和DNA序列的细胞成分，并增加发展各类癌症的风险。吸入的自由基会产生许多的烟草烟雾^在肺3对健康的负面影响，有助于加合物。已进行研究，以减少香烟烟​​雾中的自由基，减少吸烟引起的损伤风险。据报道，血红蛋白和血红素的化合物可部分清除一氧化氮，无功氧化剂和⁴香烟烟雾致癌的挥发性nitrosocompounds 。一个“生物过滤器”组成的血红蛋白和活性炭是用于清除自由基和消除香烟烟雾¹⁴至90％的自由基。然而，由于成本的无效，它有没有被成功地商业化。另一项研究表明紫草，中国草药⁸的一个组成部分良好的清除效率。在本研究中，我们报告一个协议，用于香烟过滤嘴引入气相自由基清除香烟烟雾和卷烟主流烟气气相自由基的清除效果（MCS）的测量，使用自旋捕获常见的天然抗氧化剂提取物电子自旋共振（ESR）光谱^1,2,14。我们表现​​出较高的番茄红素和葡萄籽提取物可能指向未来应用在香烟过滤嘴的清除能力。这些利弊的一个重要优势pective拾荒者，他们可以在获得大量番茄或葡萄酒行业的副产品分别^为 11,13

1。材料

在这项工作中使用的所有溶剂，试剂级。自旋陷阱，包括N -叔丁基-α- phenylnitrone（PBN）和标准的自旋标签2,2,6,6 - 四甲基- 1 - piperinyoxyl（TEMPO）购自Sigma公司，并使用所提供的。植物抗氧化剂获得商业斯旺森，美国公司。

2。香烟烟雾中的制备和自由基的分析

1. 要引入过滤器的抗氧化剂，抗氧化剂碧萝芷和葡萄籽提取物首先被溶解在95％的乙醇，而番茄红素溶于丙酮。溶剂抗氧化剂的溶解度不同而有所不同。
2. 抗氧化剂的量为0.4毫克/过滤器使用。然后，他们被涂有10毫克的活性炭。为此，活性炭，搅拌〜12小时过滤和真空干燥，在厌氧条件下的抗氧化解决方案。 抗氧化剂，然后引入到传统的醋酸纤维过滤器（CA过滤器）。为此，过滤器被切割成两块。涂植物抗氧化剂之间插入两片过滤器，并用一块胶带包裹，形成一个过滤器 - 过滤器抗氧化剂的三明治（图1A）。后来这个组合过滤器连接到含有烟草的卷烟棒。过滤器除了没有抗氧化剂的抗氧化过滤器相同的方式控制。
3. 前吸烟模拟，研究香烟的解，并保持在一个恒定的湿度环境中使用2天的最低饱和溴化钠溶液（20℃，相对湿度60％）。
4. 常规分析吸烟模拟使用一个单端口的吸烟装置，如图1所示，在室温下进行，由水抽吸或GAST真空泵DOA - P104 - BN /空气压缩机（Benton Harbor的，MICH）连接自旋捕获大会通过的一端开一个丁字路口。泡芙被堵塞的开口端保持开放之间喷。检查流量计和气体流量设置2.2〜SCFH = 17.5毫升/ S通过调整泵和发泄之间放置一个阀。
5. 噗量35毫升的条件下，每隔60秒^，类似1 2秒的时间反复研究香烟被熏。吸烟气相自由基的定量估计的模拟图所示的自旋捕集系统的结合。 1。
6. 每个卷烟激烈的喷10（35毫升/粉扑）。气相自由基的MCS通过剑桥过滤垫，然后引入到自旋捕集溶液（0.05 mol PBN的苯，2.0毫升）。
7. 最后粉扑后，冒泡诱捕的解决办法是重新调整其初始体积相同的苯（2.0毫升）。一个等份转入了〜250毫米长，3 mm内径的玻璃管一端密封。
8. 捕获的解决方案是使用一个冷冻泵解冻过程无氧。它被冷冻在液氮下，真空应用。接着是氩气气氛下解冻，让被困气泡逃脱，并再次冻结。管是这个周期重复三次后，火焰在真空状态下密封，并在进一步的ESR测量。这一步是必需的，因为氧气，这是很易溶于苯，拓宽有机自由基的ESR线。脱氧显着提高信号的信噪比。
9. 在标准条件下的9.34 GHz的频率为X波段的ESR光谱在Bruker EMX谱仪上记录。在大多数实验中使用的光谱仪设置为：中心领域3312.5G，扫描宽度80G，0.5G调制幅度，时间常数82微秒，扫描时间40秒。
10. 自旋陷阱加合物相对稳定的实验条件下，在某些情况下REQuired 25的积累，这通常〜20分钟。然而，12小时后在苯溶液中的ESR信号强度下降〜5倍。
11. 为了量化诱捕加合物的浓度，其最初的一阶导数的ESR谱进行了整合。由此产生的吸收光谱显示了广阔的单背景下，最有可能是由于烟雾中的烟尘/焦油产品。
    
    后加减此背景下，诱捕加合物的分离三重集成了一个更多的时间（图2）。

3。代表性的成果

在燃烧香烟产生的烟雾（气相）的自由基，大部分是瞬时和不稳定。为了观察这些自由基自旋捕集技术是就业。它能够捕捉到他们转化为一个更稳定的自旋加合物ESR（图1）可以通过检测气相自由基。在本研究中，0.05自旋捕获解决方案中号PBN的是用来收集烟气相自由基，这是一个氧和碳中心自由基，这是难以^分开 15的混合物。然而，在我们的案例中，所观察到的超精细分裂常数_为 N = 13.7G和_一个 H = 1.95G捕获的烷氧自由基^（RO.）2加合物，这说明它们的主要产品相应的值非常相似。我们发现，ESR信号弱和低的重复性，在我们的初步测量观察（图2）由于烟气流动的水分。要解决这个问题，我们之间的剑桥过滤和自旋捕集溶液液氮（LN2）陷阱。从₂号法律公告陷阱速冻MCS流玻璃管内壁上的水和捕捉。这大大提高ESR信号，并允许高度可重复性的结果（图3）。

被困的自由基的数量确定使用参考样本。对于对照样品无抗氧化剂，双积分频谱的比较与节奏的已知浓度的组成双频谱估计典型的加合物在苯浓度为1.24μM（图2）。由于通过每根香烟在吸烟通过的空气量是350毫升，这给自由〜7.1X10 ^-9中号的MCS气相自由基浓度的估计，和一个自由基的总数从气相被困整个卷烟的^{15〜1.5X10。}总额估计在整个香烟的烟雾，包括气体和颗粒相的自由基，〜10月^16日 9自由基。

观察了不同层次的植物抗氧化剂干流香烟烟雾气相自由基的清除作用。他们的清除率分别为图。 4。番茄红素和葡萄籽提取物显示率最高，而低ER率为碧萝芷（图4）。

图1。改善吸烟收集卷烟主流烟雾（MCS）使用自旋捕集气相自由基的仿真设计图。 MCS是制定水抽吸通过CA过滤器，然后剑桥过滤器（黄色滤波器），并通过液氮陷阱传递_给删除H 2 O气相产品终于自旋陷阱，并通过自旋捕集溶液起泡。植物抗氧化剂之间放置两片常规的醋酸纤维过滤器（扩大）在圆一个香烟清除自由基在MCS。

图2。自旋捕获加合物在苯浓度的定量估计，需要减去一个广阔的背景信号从第一INTEGRA升谱。自旋捕获加合物的超精细_分裂参数为H = 1.95 _克，N = 13.7G。

图3通过液氮陷阱的显着提高的MCS自旋捕获获得的ESR信号的质量。

图4。天然抗氧化剂在MCS自由基浓度的影响。相对信号强度：控制 - 100％，碧萝芷 - 55％，葡萄籽提取物 - 12％，番茄红素 - 10％。

一个可靠的估计不同的烟草烟雾中的自由基清道夫的作用，需要一个自由基的定量检测的重复性技术。此前^1，它已被证明，小体积浓度较高自旋陷阱的解决方案，在非极性溶剂被困免受烟草烟雾危害的自由基最有效的。香烟烟雾中始终包含水蒸气从燃烧的有机化合物和烟草中的残留水分，可以在诱捕溶剂。这在PBN自旋捕集溶液中的掺加水，大大降低了自旋捕集加合物的寿命和其ESR信号强度。通过简单的通过用液氮冷却的U形管的MCS​​取出水分显着提高ESR谱的质量，在我们的实验中，即使一些气相自由基的一小部分，也可能会陷入冰冻的表面上。

采用t他的技术，我们比较不同的自由基清除引入到香烟过滤嘴的天然化合物的相对效率。我们发现，番茄红素和葡萄籽提取物合并成香烟过滤嘴后，立即能够清除90％的自由基气相MSC。如此高的清除能力跻身最有效的报告，如血红蛋白和^shikonine 8,14激进保护这些廉价的现成的天然化合物。然而，失去了我们的实验与研究的天然抗氧化剂的卷烟装载过滤器清除一周后在室温下的存储能力的一个显着的一部分。要解决这个问题，可以刺激商业香烟过滤嘴中的番茄红素和葡萄籽提取物未来的应用。

没有利益冲突的声明。

这项工作是支持的授予国家卫生研究院，美国国立卫生研究院/ NCRR号P41 - RR 016292（ACERT）。

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