Een protocol voor het opsporen en opruiming Gas-fase vrije radicalen in Mainstream Cigarette Smoke

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

Het roken van sigaretten wordt geassocieerd met menselijke kankers. Het is gemeld dat het merendeel van de sterfte aan longkanker wordt veroorzaakt door het roken van sigaretten ^5,6,7,12. Hoewel tabak teer en aanverwante producten in het deeltje fase van sigarettenrook zijn belangrijke oorzaken van carcinogene en mutagene gerelateerde ziekten, sigarettenrook bevat aanzienlijke hoeveelheden vrije radicalen die ook worden beschouwd als een belangrijke groep van kankerverwekkende stoffen ^9,10. Vrije radicalen vallen cel bestanddelen door het beschadigen van eiwitstructuur, lipiden en DNA-sequenties en verhoging van de risico's van de ontwikkeling van verschillende vormen van kanker. Ingeademd radicalen produceren adducten die bijdragen aan veel van de negatieve gezondheidseffecten van tabaksrook in de longen ^3. Er zijn studies uitgevoerd om vrije radicalen te verminderen in sigarettenrook de risico's van het roken veroorzaakte schade te verminderen. Het is gemeld dat de hemoglobine-en heem-bevattende verbindingen gedeeltelijk zou kunnen stikstofmonoxide, reactieve vangenoxidanten en kankerverwekkende vluchtige nitrosocompounds van sigarettenrook ^4. Een 'bio-filter' bestond uit hemoglobine en actieve kool werd gebruikt om de vrije radicalen scharrelen en te verwijderen tot 90% van de vrije radicalen van sigarettenrook ^14. Echter, vanwege de kosten-ineffectiviteit, is het niet succesvol gecommercialiseerd. Een andere studie toonde aan een goede wegvangen efficiëntie van shikonin, een onderdeel van de Chinese kruidengeneeskunde ^8. In de huidige studie hebben we verslag van een protocol voor de invoering van gemeenschappelijke natuurlijke antioxidant extracten in de sigaret filter voor het spoelen van gasfase vrije radicalen in sigarettenrook en het meten van het scharrelen effect op de gasfase van vrije radicalen in het reguliere sigarettenrook (MCS) met behulp van spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) spectroscopie ^1,2,14. We toonden een hoge capaciteit wegvangen van lycopeen en druivenpit extract, die zouden kunnen wijzen op hun toekomstige toepassing in sigarettenfilters. Een belangrijk voordeel van deze pro'smend aaseters is dat ze kunnen worden verkregen in grote hoeveelheden van bijproducten van tomaten-of wijn-industrie respectievelijk ^11,13

1. Materialen

Alle oplosmiddelen gebruikt in dit werk werden reagens rang. De spin trap, inclusief N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN) en de standaard spin label 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) werden verkregen van Sigma en werden gebruikt als geleverd. De plant anti-oxidanten werden commercieel verkregen van Swanson, Inc USA.

2. Voorbereiding van de sigarettenrook en de analyse van vrije radicalen

1. Ter introductie van anti-oxidanten in het filter, werden de anti-oxidanten pycnogenol en druivenpit extract eerst opgelost in 95% ethanol, terwijl de lycopeen werd opgelost in aceton. Het oplosmiddel volumes waren verschillend, afhankelijk van de oplosbaarheid antioxidant.
2. De hoeveelheid anti-oxidanten van 0,4 mg / filter werd gebruikt. Ze werden vervolgens bedekt met 10 mg van de actieve kool. Voor dit doel actieve kool werd geroerd gedurende ~ 12 uur met de anti-oxidant oplossing in anaërobe omstandigheden, gefilterd en gedroogd onder vacuüm. Antioxidanten zijn vervolgens ingevoerd in de conventionele acetaat filter (CA filter). Voor dit doel werd de filter in twee stukken gesneden. De gecoate plantaardige antioxidanten werden ingevoegd tussen de twee stukken van het filter en omwikkeld met een stukje plakband om een ​​filter te vormen - antioxidant-filter sandwich (Fig. 1A). Deze gecombineerde filter werd vervolgens bevestigd aan sigaretten, tabak bevattend staven. De controle filter is gemaakt in de dezelfde manier als de anti-oxidant filter, behalve geen antioxidant werd toegevoegd.
3. Voorafgaand aan de simulatie roken, werden de onderzoeks-sigaretten uitgepakt en bewaard in een constant vochtige omgeving (20 ° C, 60% relatieve vochtigheid) met behulp van een verzadigde NaBr oplossing voor een minimum van 2 dagen.
4. Roken simulatie voor routine-analyse werd uitgevoerd bij omgevingstemperatuur met behulp van een single-port roken apparaat dat, zoals weergegeven in figuur 1, bestaat uit een water aspirator of GAST DOA-P104-BN Vacuum Pomp / Air Compressor (Benton Harbor, Mich) aangesloten naar de spin-trappingmontage door middel van een T-splitsing met een kant open. Puffs werden uitgevoerd door het inpluggen van de open einde, die open gebleven tussen de trekjes. De gasstroom werd gecontroleerd door de debietmeter en ingesteld op ~ 2,2 SCFH = 17,5 ml / s door het aanpassen van een klep geplaatst tussen de pomp en de opening.
5. Het onderzoek sigaretten werden gerookt onder de voorwaarde van bladerdeeg volume van 35 ml voor een duur van 2 seconden herhaald om de 60 seconden, vergelijkbaar met ^een. Roken simulatie voor kwantitatieve schatting van de gas-fase vrije radicalen werd uitgevoerd in samenwerking met de spin trapping systeem zoals getoond in Fig. 1.
6. Tien intense inhalaties (35 ml / puff) werden genomen voor elke sigaret. Gasfase vrije radicalen werden verzameld door het passeren van de MCS door een Cambridge filterkussen en vervolgens in de spin trapping-oplossing (0,05 M PBN in benzeen, 2,0 ml).
7. Na de laatste bladerdeeg, het borrelde trapping oplossing was aangepast aan zijn oorspronkelijke volume (2,0 ml) met dezelfde benzeen. Een hoeveelheid werd overgebracht in een ~ 250 mm lang, 3 mm ID glazen buis afgedicht aan een eind.
8. De trapping oplossing was zuurstofarme met behulp van een vries-dooi-pump procedure. Het was bevroren onder vloeibare stikstof, en een vacuum werd toegepast. Toen was het ontdooid onder argon atmosfeer, waardoor ingesloten gasbellen om te ontsnappen, en weer bevroren. Na deze cyclus werd drie keer herhaald, de buis werd vlam afgesloten onder vacuüm en worden gebruikt in de verdere ESR metingen. Deze stap is nodig omdat zuurstof, dat is goed oplosbaar in benzeen, verbreedt ESR lijnen van organische radicalen. Deoxygenatie verbetert drastisch de signaal-ruisverhouding.
9. X-Band ESR spectra werden opgenomen op een Bruker EMX spectrometer op een frequentie van 9,34 GHz onder standaard omstandigheden. De spectrometer instellingen gebruikt in de meeste experimenten zijn: center veld 3312.5G, scanbreedte 80G, modulatie amplitude 0.5G, de tijd constant 82 microseconden, scan-tijd 40 sec.
10. De spin trap adducten zijn relatief stabiel op de experimentele omstandigheden, die in sommige gevallen required 25 opeenhopingen, die doorgaans nam ~ 20 minuten. Echter, na 12 uur de intensiteit van de ESR-signalen in benzeen oplossing daalde met een factor van ~ 5.
11. Het kwantificeren van de concentratie van de vangst adduct, was zijn eerste eerste afgeleide ESR spectrum geïntegreerd. De resulterende absorptiespectrum toont een brede singlet achtergrond, waarschijnlijk door roet / teer producten in de rook.
    
    Na aftrek van deze achtergrond heeft de gescheiden triplet van de vangst adduct geïntegreerd was nog een keer (afb. 2).

3. Representatieve resultaten

Het merendeel van de vrije radicalen in de brandende sigaret-geproduceerde rook (gas fase) zijn onmiddellijk en instabiel. Om deze radicalen zich aan een spin-trap-techniek is toegepast. Het vangt gas-fase vrije radicalen door ze te transformeren tot een spin adduct dat is stabieler en kan worden gedetecteerd door ESR (Fig.1). In de huidige studie, de spin-trap-oplossing van 0,05M PBN werd gebruikt om de rook-gas te verzamelen fase vrije radicalen, die een mengsel van zuurstof-en koolstof-gecentreerde radicalen die moeilijk te scheiden ^15. In ons geval, echter, de waargenomen hyperfijne splitsing constanten een _N = 13.7G en een _H = 1.95G zijn zeer vergelijkbaar met de overeenkomstige waarden voor het vangen van adducten van alkoxygroepen vrije radicalen (Romeinen) ^2, wat suggereert dat ze het belangrijkste product. We toonden aan dat zwakke ESR-signalen en een lage reproduceerbaarheid waargenomen in onze eerste metingen (afb. 2) waren het gevolg van het vocht in de rook flow. U lost dit probleem, voegden we een vloeibare stikstof (LN2) trap tussen de Cambridge filter en de spin val oplossing. De LN ₂ val verwijderd water uit de MCS stroom door snelvriezen en het vastleggen van het op de binnenwand van de glazen buis. Deze sterk verbeterde ESR-signalen en toegestaan ​​voor zeer reproduceerbare resultaten (afb. 3).

De hoeveelheid gevangen vrije radicalen werd bepaald met behulp van eenreferentiemonster. Voor controle monsters zonder anti-oxidanten, de typische adduct concentratie in benzeen geschat door vergelijking van zijn dubbele integraal spectrum met een dubbele integraal spectrum voor bekende concentratie van TEMPO was 1,24 uM (Fig.2). Omdat de hoeveelheid lucht die doorlopen elke sigaret tijdens het roken was ~ 350 ml, dit geeft een schatting voor de vrije radicalen concentratie in de gasfase van MCS van ~ 7.1X10 ⁹ M, en een totaal aantal radicalen gevangen uit de gasfase van een hele sigaret van ~ 1.5X10 ^15. Een schatting voor de totale hoeveelheid vrije radicalen in de rook van een hele sigaret, met inbegrip van zowel gas-en deeltjes-fase, was ~ 10 ¹⁶ vrije radicalen ^9.

Verschillende niveaus van de wegvangen effect van plantaardige anti-oxidanten op gas-fase vrije radicalen in de main stream sigarettenrook waargenomen. Hun wegvangen tarieven werden gepresenteerd in Fig. 4. Lycopeen en druivenpitten extract bleek dat de hoogste tarieven, terwijl een lageER werd waargenomen bij pycnogenol (Fig.4).

Figuur 1. Een diagram van een verbeterde roken simulatie ontwerp voor het verzamelen van gasfase-vrije radicalen in het reguliere sigarettenrook (MCS) met behulp van spin-val. MCS werd getrokken door een water aspirator door CA filter, dan Cambridge filter (geel filter) en door een vloeibare stikstof trap naar H ₂ O. verwijderen De gas-fase producten ging uiteindelijk te vangen draaien en wordt geleid door de spin trap oplossing. Plant antioxidant werd geplaatst tussen de twee stukken van conventionele acetaat filters (Vergrote in een cirkel A) aan sigaretten om vrije radicalen te scharrelen in het MCS.

Figuur 2. Een kwantitatieve raming voor de spin-trapping adduct concentratie in benzeen vereist aftrekken van een brede achtergrond signaal van de eerste integratiel spectrum. De hyperfijne splitsen parameters voor de spin-trapping adduct zijn een _H = 1,95 G, een _N = 13.7G.

Figuur 3. Doorheen LN2 val verbetert de kwaliteit van de ESR-signalen verkregen door spin-vangen van MCS.

Figuur 4. Effect van natuurlijke anti-oxidanten op de concentratie van vrije radicalen in MCS. De relatieve signaal intensiteiten zijn: controle - 100%, pycnogenol - 55%, druivenpitten extract - 12%, lycopeen - 10%.

Een betrouwbare schatting van het effect van verschillende vrije radicalen in tabaksrook vereist een reproduceerbare techniek voor kwantitatieve detectie van vrije radicalen. Eerder ^een, is aangetoond dat kleine hoeveelheden van de hogere concentratie spin-val-oplossingen in niet-polaire oplosmiddelen zijn het meest effectief in het vangen van vrije radicalen tegen tabaksrook. Sigarettenrook bevat altijd waterdamp uit de verbranding van organische verbindingen en de resterende vocht in tabak, die kunnen eindigen in het vangen oplosmiddel. Deze vermenging van water in de PBN spin-val-oplossing verlaagt aanzienlijk de levensduur van de spin vangen adducten en de intensiteit van de ESR-signalen. Het verwijderen van dit vocht door een eenvoudige passeren MCS door middel van een U-vormige buis gekoeld met vloeibare stikstof sterk verbeterde de kwaliteit van het ESR spectra in onze experimenten, ook al zijn sommige fractie van gasfase-radicalen kunnen ook worden gevangen op de bevroren ondergrond.

Met behulp van tzijn techniek vergeleken we de relatieve efficiëntie van verschillende radicaal-scavenging natuurlijke verbindingen geïntroduceerd in sigarettenfilters. We vonden dat de lycopeen en druivenpitten extract onmiddellijk na de omzetting in sigarettenfilters zijn in staat om maximaal vangen tot 90% van de vrije radicalen uit de gasfase MSC. Dergelijke hoge wegvangen capaciteit gelederen deze goedkope gemakkelijk beschikbaar natuurlijke verbindingen behoren tot de meest efficiënte gemelde vrije radicalen beschermers, zoals hemoglobine-en shikonine ^8,14. Maar in onze experimenten sigarettenfilters geladen met studeerde natuurlijke anti-oxidanten verloor een merkbaar deel van hun wegvangen capaciteit na een week van opslag bij kamertemperatuur. Oplossen van dit probleem kunnen stimuleren toekomstige toepassing van lycopeen en druivenpit extract in de commerciële sigarettenfilters.

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health, subsidie ​​No NIH / NCRR P41-RR 016.292 (voor ACERT).

1. Baum, S.L., Anderson, I.G.M., Baker, R.R, Murphy, D.M., & C.C., Rowlands. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
2. Bluhm, A.L., Weinstein, J., & Sousa, J.A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500 (1971).
3. Church, D.F. & Pryor W.A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., & Stavrides, J.C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
5. Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., & Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
7. Nair, A.K. & Brandt, E.N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., & Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
9. Pryor, W.A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
10. Pryor, W.A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
11. Rozzi, N.I., Singh, R.K., Vierling, R.A., & Watkins, B.A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
12. Shopland, D.R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
13. Shrikhandle, A.J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
14. Valavanidis, A. & Haralambous, E.A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.