En protokoll for å oppdage og scavenging Gass-fase frie radikaler i Mainstream sigarettrøyk

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

Sigarettrøyking er assosiert med kreft hos mennesker. Det har blitt rapportert at de fleste av lungekreft dødsfall er forårsaket av sigarettrøyking ^5,6,7,12. Selv om tobakk tjære og beslektede produkter i partikkel fase av sigarettrøyk er viktige årsaker til kreftfremkallende og mutagene relaterte sykdommer, inneholder sigarettrøyk betydelige mengder av frie radikaler som anses også som en viktig gruppe kreftfremkallende ^9,10. Frie radikaler angriper celler bestanddeler ved å skade proteinstruktur, lipider og DNA-sekvenser og øke risikoen for å utvikle ulike typer kreft. Inhalert radikaler produsere addukter som bidrar til mange av de negative helseeffektene av tobakksrøyk i lungene ^3. Studier har vært gjennomført for å redusere frie radikaler i sigarettrøyk å redusere risiko for røyking-indusert skade. Det har blitt rapportert at hemoglobin og heme som inneholder stoffene kan delvis scavenge nitrogenoksid, reaktiveoksidanter og kreftfremkallende flyktige nitrosocompounds av sigarettrøyk ^fire. A 'bio-filter "besto av hemoglobin og aktivert karbon ble brukt til skattekart frie radikaler og for å fjerne opp til 90% av frie radikaler fra sigarettrøyk ^14. Men på grunn av kostnads-ineffektivitet, har det ikke blitt kommersialisert. En annen studie viste god scavenging effektivitet shikonin, en komponent av kinesisk urtemedisin ^8. I den foreliggende undersøkelsen, rapporterer vi en protokoll for å innføre felles naturlig antioksidant ekstrakter inn i sigarett filter for scavenging gassfase frie radikaler i sigarettrøyk og måling av skattekart effekt på gassfase frie radikaler i mainstream sigarettrøyk (MCS) med spin-fangst Electron Spin Resonans (ESR) spektroskopi ^1,2,14. Vi viste høy scavenging kapasitet på lykopen og druekjerne ekstrakt som kunne peke på sine fremtidige anvendelse i sigarett-filtre. En viktig fordel med disse proffenepective scavengers er at de kan fås i store mengder fra biprodukter av tomat eller vinindustrien henholdsvis ^11,13

1. Materialer

Alle løsemidler som brukes i dette arbeidet var reagensen karakter. Den spin trap, inkludert N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN) og standard spin label 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) ble hentet fra Sigma og ble brukt som leveres. Anlegget antioksidanter ble hentet kommersielt fra Swanson, Inc. USA.

2. Utarbeidelse av sigarettrøyk og analyse av frie radikaler

1. For å introdusere antioksidanter i filteret ble antioksidanter Pycnogenol og druefrøekstrakt første oppløst i 95% etanol, mens lykopen ble oppløst i aceton. Løsemiddelet volumene var forskjellig avhengig av antioksidant oppløselighet.
2. Mengden av antioksidanter på 0,4 mg / filter ble brukt. De ble deretter belagt med 10 mg av aktivt karbon. For dette formålet aktivkull ble rørt for ~ 12 timer med antioksidant løsningen i anaerobe forhold, filtrert og tørket under vakuum. Antioksidanter ble deretter introdusert i den konvensjonelle acetate filter (CA filter). For dette formålet, ble filteret kuttet i to deler. Den bestrøkne anlegget antioksidanter ble satt inn mellom to stykker av filteret og innpakket med et stykke tape for å danne et filter - antioksidant-filter Sandwich (Fig. 1A). Dette kombinert filter ble senere festet til sigarett stenger som inneholder tobakk. Kontrollen filter ble gjort på samme måte som antioksidant filter unntatt ingen antioksidant ble lagt til.
3. Før røyking simulering, ble forskningen sigaretter pakket og oppbevart i en konstant fuktig miljø (20 ° C, 60% relativ luftfuktighet) ved hjelp av en mettet NaBr løsning for minimum 2 dager.
4. Røyking simulering for rutinemessig analyse ble utført ved romtemperatur med en single-port røyking enhet som, som vist i figur 1, består av en vann aspirator eller Gast DOA-P104-BN Vacuum Pump / Air Compressor (Benton Harbor, Mich) tilkoblet til spin-fangstforsamlingen gjennom et T-kryss med den ene enden åpen. Puff ble utført ved å plugge den åpne enden som forble åpen mellom puffs. Gasstrømmen ble sjekket av flow meter og satt på ~ 2,2 SCFH = 17,5 ml / s ved å justere en ventil plassert mellom pumpen og vent.
5. Forskningen sigaretter ble røyket under forutsetning av puff volum på 35 ml for en varighet på 2 sekunder gjentas hvert 60. sekund, tilsvarende ^1. Røyking simulering for kvantitativ estimering av gass-fase frie radikaler ble utført i forbindelse med spin fangst system som vist i fig. 1.
6. Ten intense puffs (35 ml / puff) ble tatt for hver sigarett. Gass-fase frie radikaler ble samlet av bestått MCS gjennom et Cambridge filter pad og deretter innført i spinn trapping løsningen (0,05 M PBN i benzen, 2,0 ml).
7. Etter siste puff, var boblet fangst løsningen justeres til sin opprinnelige volum (2,0 ml) med samme benzen. En delmengde ble overført til en ~ 250 mm lange, 3 mm ID glassrør forseglet i den ene enden.
8. Fangst Løsningen ble deoxygenated hjelp av en fryse-pumpe-tine prosedyre. Det var frosset i henhold til flytende nitrogen, og et vakuum ble brukt. Da var det tinte i henhold argon atmosfære, slik at fanget gassbobler å flykte, og frosset igjen. Etter denne syklusen ble gjentatt tre ganger, ble røret flamme-forseglet under vakuum og brukes i videre ESR målinger. Dette trinnet er nødvendig fordi oksygen, som er godt løselig i benzen, utvider ESR linjer av organiske radikaler. Deoxygenation forbedrer dramatisk signal-til-støy-forhold.
9. X-Band ESR spektra ble registrert på en Bruker EMX spektrometer med en frekvens på 9,34 GHz under standard forhold. Spektrometeret innstillingene som brukes i de fleste forsøkene var: sentrum feltet 3312.5G, skannebredde 80G, modulering amplitude 0,5 g, tidskonstant 82 mikrosekunder, søketiden 40 sek.
10. Den spin trap addukter er relativt stabil på eksperimentet forhold, som i noen tilfeller required 25 ansamlinger, som typisk tok ~ 20 min. Men etter 12 timer intensiteten av ESR signaler i benzen løsning redusert med en faktor ~ 5.
11. For å kvantifisere konsentrasjonen av fangst addukt, var dens første første-derivative ESR spektrum integrert. Den resulterende absorpsjon spekteret viser en bred singlet bakgrunn, mest sannsynlig på grunn av sot / tjære produkter som finnes i røyken.
    
    Etter fratrekk av denne bakgrunn skilt trilling av fangst addukt ble integrert en gang (fig 2).

3. Representant Resultater

Mesteparten av frie radikaler i brennende sigarett-produserte røyk (gassfase) er øyeblikkelig og ustabil. For å observere disse radikale en spin felle teknikk er ansatt. Den fanger opp gass-fase frie radikaler ved å transformere dem inn i en spinn addukt som er mer stabil og kan påvises ved ESR (Fig.1). I den aktuelle studien, spin-trap løsning på 0,05M PBN ble brukt til å samle røyk gassfase frie radikaler, som er en blanding av oksygen og karbon-sentrert radikaler som er vanskelig å skille ^15. I vårt tilfelle, men de observerte hyperfine splitting konstantene a _N = 13.7G og en _H = 1.95G er svært lik de tilsvarende verdiene for fangst addukter av alkoxyl frie radikaler (RO.) ^2, som tyder på at de er de viktigste produktet. Vi viste at svake ESR signaler og lav reproduserbarhet observert i vår innledende målinger (Fig. 2) ble på grunn av fuktigheten i røyken flyt. For å løse dette problemet, la vi til en flytende nitrogen (LN2) trap mellom Cambridge filteret og spin felle løsningen. LN ₂ felle fjernet vann fra MCS flyten av rask frysing og fange den på den indre veggen i glassrør. Denne kraftig forbedret ESR signaler og tillatt for svært reproduserbare resultater (Fig. 3).

Mengden fanget frie radikaler ble fastsatt ved hjelp av enreferanseprøve. For kontrollprøver uten antioksidanter, var den typiske addukt konsentrasjonen i benzen estimeres ved sammenligning av sin doble integrert spektrum med en dobbel integrert spektrum for kjent konsentrasjon av TEMPO 1,24 mM (Fig.2). Siden mengden luft passerer gjennom hver sigarett under røyking var ~ 350 ml, gir dette et anslag for frie radikaler konsentrasjonen i gassfase av MCS av ~ 7.1X10 ^-9 M, og et totalt antall radikaler fanget fra gassfase av en hel sigarett av ~ 1.5X10 ^15. Et estimat for den totale mengden av frie radikaler i røyken fra en hel sigarett, inkludert både gass og partikler fase, var ~ 10 ¹⁶ frie radikaler ^9.

Ulike nivåer av scavenging effekten av anlegget antioksidanter på gass-fase frie radikaler i main stream sigarettrøyk ble observert. Deres scavenging priser ble presentert i fig. Fire. Lykopen og druefrøekstrakt viste de høyeste prisene mens laver satsen ble observert for Pycnogenol (Fig.4).

Figur 1. Et diagram av bedre røyking simulering design for innsamling av gass-fase frie radikaler i mainstream sigarettrøyk (MCS) med spin felle. MCS ble trukket av en vann aspirator gjennom CA filter, da Cambridge filter (gul filter) og passerte gjennom et flytende nitrogen felle for å fjerne H ₂ O. Gass-fase produkter til slutt gikk til spinne felle og boblet gjennom spin felle løsningen. Plant antioksidant ble plassert mellom to stykker av konvensjonelle acetat filtre (Forstørret i sirkel A) festet til sigarett til skattekart frie radikaler i MCS.

Figur 2. Et kvantitativt estimat for spin-fanger addukt konsentrasjonen i benzen krever trekke en bred bakgrunn signal fra første Integral spektrum. Den hyperfine splitting parametrene for spin-fangst addukt er en _H = 1,95 G, en _N = 13.7G.

Figur 3. Passerer gjennom LN2 felle forbedrer vesentlig kvaliteten på ESR signaler innhentet av spin-fangst av MCS.

Figur 4. Effekt av naturlige antioksidanter på konsentrasjonen av frie radikaler i MCS. Den relative signal intensitet er: kontroll - 100%, Pycnogenol - 55%, grape seed extract - 12%, lykopen - 10%.

En pålitelig estimat av effekten av forskjellige frie radikaler scavengers i tobakksrøyk krever en reproduserbar teknikk for kvantitativ påvisning av frie radikaler. Tidligere ^1, har det vist seg at små mengder høyere konsentrasjon spin felle løsninger i ikke-polare løsemidler er mest effektiv på fangst frie radikaler fra tobakksrøyk. Sigarettrøyk inneholder alltid vanndamp fra forbrenning av organiske forbindelser og restfuktighet i tobakk som kan ende opp i fangst løsemiddel. Denne blanding av vann i PBN spin fellen løsning minsker vesentlig levetiden til spin fangst addukter og intensiteten av deres ESR signaler. Fjerning av denne fuktigheten ved enkle passerer MCS gjennom en U-formet rør kjøles med flytende nitrogen dramatisk forbedret kvaliteten på ESR spektra i våre eksperimenter, selv om noen brøkdel av gass-fase radikaler kan også fanget på den frosne overflaten.

Bruk thans teknikk vi sammenlignet relative effektiviteten av forskjellige radikale-scavenging naturlige forbindelser introdusert i sigarett filtre. Vi fant at lycopene og druefrøekstrakt umiddelbart etter å innlemme i sigarett filter er i stand til skattekart opptil 90% av frie radikaler fra gassfase MSC. Slike høye scavenging kapasitet rangerer disse billige lett tilgjengelig naturlige forbindelser blant de mest effektive rapporterte frie radikaler beskyttere som hemoglobin og shikonine ^8,14. Likevel, i våre eksperimenter sigarett filter lastet med studert naturlige antioksidanter mistet en merkbar del av deres scavenging kapasitet etter en uke med oppbevaring ved romtemperatur. Løse dette problemet kan stimulere framtidig anvendelse av lykopen og druekjerne ekstrakt i kommersielle sigarett filtre.

Ingen interessekonflikter erklært.

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health, stipend Nei NIH / NCRR P41-RR 016 292 (for ACERT).

1. Baum, S.L., Anderson, I.G.M., Baker, R.R, Murphy, D.M., & C.C., Rowlands. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
2. Bluhm, A.L., Weinstein, J., & Sousa, J.A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500 (1971).
3. Church, D.F. & Pryor W.A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., & Stavrides, J.C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
5. Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., & Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
7. Nair, A.K. & Brandt, E.N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., & Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
9. Pryor, W.A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
10. Pryor, W.A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
11. Rozzi, N.I., Singh, R.K., Vierling, R.A., & Watkins, B.A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
12. Shopland, D.R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
13. Shrikhandle, A.J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
14. Valavanidis, A. & Haralambous, E.A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.