Ett protokoll för att upptäcka och rensning gasfas fria radikaler i Mainstream cigarettrök

Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

Cigarettrökning är förknippad med cancer hos människa. Det har rapporterats att de flesta dödsfall i lungcancer orsakas av cigarettrökning ^5,6,7,12. Även tobak tjära och relaterade produkter i partikel fasen av cigarettrök är viktiga orsaker till cancerogena och mutagena sjukdomar, innehåller cigarettrök betydande mängder av fria radikaler som även betraktas som en viktig grupp av cancerframkallande ^9,10. Fria radikaler angriper cellen väljare genom att skada proteinstruktur, lipider och DNA-sekvenser och öka risken för att utveckla olika typer av cancer. Inhalerat radikaler producera addukter som bidrar till många av de negativa hälsoeffekterna av tobaksrök i lungorna ^3. Studier har gjorts för att minska fria radikaler i cigarettrök för att minska riskerna för tobaksrelaterade skador. Det har rapporterats att hemoglobin och häm-innehållande föreningar delvis kunde rensar kväveoxid, reaktivaoxidanter och cancerframkallande flyktiga nitrosocompounds av cigarettrök ^4. En "bio-filter" bestod av hemoglobin och aktivt kol har använts för att rensar fria radikaler och för att ta bort upp till 90% av fria radikaler från cigarettrök ^14. Men på grund av kostnaden, ineffektivitet, har det inte varit framgångsrikt kommersialiserat. En annan studie visade god sophantering effektivitet shikonin, en del av kinesisk örtmedicin ^8. I den aktuella studien rapporterar vi ett protokoll för införande av gemensamma naturlig antioxidant extrakt in i cigarett-filter för sophantering gasfas fria radikaler i cigarettrök och mätning av rensar effekten på fri gas fas radikaler i vanliga cigarettrök (MCS) med hjälp av spin-svällning Electron Spin Resonance (ESR)-spektroskopi ^1,2,14. Vi visade hög sophantering kapacitet av lykopen och druvkärneextrakt som kan peka på deras framtida tillämpning i cigarettfilter. En viktig fördel med dessa proffssett vilken asätare är att de kan erhållas i stora mängder från biprodukter av tomat eller vinindustrin respektive ^11,13

1. Material

Alla lösningsmedel som används i detta arbete var reagenskvalitet. Spin fällan, inklusive N-tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN) och standardavvikelsen spin etiketten 2,2,6,6-tetrametyl-1-piperinyoxyl (tempo) erhölls från Sigma och användes som levereras. Anläggningen antioxidanter erhölls kommersiellt från Swanson, Inc. USA.

2. Beredning av cigarettrök och analys av fria radikaler

1. Att införa antioxidanter i filtret var antioxidanter Pycnogenol och vindruvskärnextrakt först upp i 95% etanol, medan lykopen upplöstes i aceton. Lösningsmedlet volymerna var olika beroende på antioxidant löslighet.
2. Mängden antioxidanter av 0,4 mg / filter användes. De var då täckt med 10 mg av aktivt kol. För detta ändamål aktivt kol rördes för ~ 12 timmar med antioxidant lösning i anaeroba förhållanden, filtreras och torkas under vakuum. Antioxidanter har sedan införts i konventionella acetat filtret (CA-filter). För detta ändamål var det filtret skär i två bitar. Den bestrukna Anläggningen antioxidanter sattes in mellan två bitar av filtret och svepte med en bit tejp för att bilda ett filter - antioxidant-filter smörgås (Fig. 1A). Denna kombinerade filtret senare bifogas cigarett stavar innehållande tobak. Kontrollen filtret gjordes på samma sätt som antioxidant filtret utom ingen antioxidant lades till.
3. Före rökning simuleringen var forskningen cigaretter packas upp och förvaras i en konstant luftfuktighet (20 ° C, 60% relativ fuktighet) med hjälp av en mättad NaBr lösning för minst 2 dagar.
4. Rökning simulering för rutinanalys utfördes vid rumstemperatur med en enda port rökning anordning som, som visas i figur 1, består av en vatten aspirator eller GAST DOA-P104-BN Vakuumpump / Kompressor (Benton Harbor, Michigan) ansluten till spin-svällningmontering genom en T-korsning med ena änden öppen. Puffs utfördes genom att koppla den öppna delen som är öppen mellan blossen. Gasflödet kontrollerades av flödesmätare och satt till ~ 2,2 SCFH = 17,5 ml / s genom att justera en ventil placeras mellan pump och ventil.
5. Forskningen cigaretter röktes under förutsättning av puff volym 35 ml för en varaktighet på 2 sekunder upprepas var 60 sekunder, ungefär som ^1. Rökning simulering för kvantitativ bedömning av gasfas fria radikaler utfördes i samband med spin fällor som visas i figur. 1.
6. Tio intensiva puffar (35 ml / puff) togs för varje cigarett. Gasfas fria radikaler samlades in genom att skicka MCS genom ett Cambridge filter pad och sedan förs in i spinn fångst lösning (0,05 M PBN i bensen, 2,0 ml).
7. Efter sista puff var bubblade fångst lösningen återanpassas till sin ursprungliga volym (2,0 ml) med samma bensen. En delmängd överfördes till en ~ 250 mm lång, 3 mm innerdiameter glasrör sluten i ena änden.
8. Den fångst Lösningen blev syrefattigt med en freeze-pump-tina förfarande. Det var fruset i flytande kväve, och ett vakuum har tillämpats. Då var det tinas i argon atmosfär, så fångade gasbubblor att fly, och frusen igen. Efter denna cykel upprepades tre gånger, var röret lågan förslutna under vakuum och används i ytterligare ESR mätningar. Detta steg är nödvändigt på grund syre, vilket är väl löslig i bensen, breddar ESR rader av organiska radikaler. Deoxygenation förbättrar dramatiskt signal-brusförhållande.
9. X-Band ESR spektra är inspelade på en Bruker EMX spektrometer med en frekvens på 9,34 GHz under normala förhållanden. Spektrometern inställningar som används i de flesta experiment var: mittfält 3312.5G, skanna bredd 80G, modulering amplitud 0,5 g, tidskonstant 82 mikrosekunder, skanna tid 40 sek.
10. Den spin fällan addukter är relativt stabilt på experimentet villkor, som i vissa fall required 25 ansamlingar, som normalt tog ~ 20 min. Men efter 12 timmar intensiteten i ESR signaler i bensen lösning minskat med en faktor på ~ 5.
11. För att kvantifiera koncentration av fångst addukten, var den ursprungliga första derivat ESR spektrum integrerade. Den resulterande absorptionsspektrum visar en bred singlet bakgrund, sannolikt på grund av sot / tjära produkter som finns i röken.
    
    Efter subtraktion av denna bakgrund separerade triplett av fångst addukten integrerades en gång till (Fig. 2).

3. Representativa resultat

De flesta av de fria radikaler i brinnande cigarett-producerade rök (gasfas) är momentan och instabila. För att följa dessa radikaler en spin fälla teknik är anställd. Den fångar gasfas fria radikaler genom att förvandla dem till en spin addukt som är mer stabil och kan upptäckas genom ESR (figur 1). I den aktuella studien, spin-fällan lösning av 0,05M PBN användes för att samla in rök gasfas fria radikaler, som är en blandning av syre-och kol-centrerade radikaler som är svåra att separera ^15. I vårt fall är dock den observerade hyperfinnivåerna dela konstanterna a _N = 13.7G och en _H = 1.95G är mycket lika motsvarande värden för att fånga addukter av alkoxyl fria radikaler (RO.) ^2, vilket tyder på att de är den viktigaste produkten. Vi visade att svaga ESR signaler och låg reproducerbarhet som observerats i vår initiala mätningar (Fig. 2) berodde på fukt i röken flödet. Att lösa detta problem har vi lagt ett flytande kväve (LN2) fälla mellan Cambridge filtret och spin fällan lösningen. LN ₂ fälla bort vatten från MCS flödet genom snabb frysning och fånga den på den inre väggen i glasrör. Denna förbättrade avsevärt ESR signaler och får för mycket reproducerbara resultat (Fig. 3).

Mängden fångad fria radikaler bestämdes med hjälp av enreferensprov. För kontrollprov utan antioxidanter, var den typiska addukten koncentrationen i bensen uppskattas genom jämförelse av dess dubbla integrerad spektrum med dubbel integrerad spektrum för känd koncentration av TEMPO 1,24 mikroM (Fig.2). Eftersom den mängd luft som passerade varje cigarett under rökning var ~ 350 ml, ger en uppskattning av fria radikaler koncentration i gasfas för MCS på ~ 7.1X10 ^-9 MSEK och det totala antalet radikaler fångade från gasfas av en hel cigarett på ~ 1.5X10 ^15. En uppskattning av den totala mängden fria radikaler i röken från en hel cigarett, inklusive både gas-och partikelformiga fas, var ~ 10 ¹⁶ fria radikaler ^9.

Olika nivåer av sophantering effekten av växt antioxidanter på gasfas fria radikaler i main stream cigarettrök observerades. Deras sophantering priser presenterades i bild. 4. Lykopen och druvkärneextrakt visade de högsta siffrorna medan lågER kurs observerades för Pycnogenol (Fig. 4).

Figur 1. Ett diagram av förbättrade rökning simulering konstruktion för insamling gasfas fria radikaler i vanliga cigarettrök (MCS) med hjälp av spin fälla. MCS drogs av en vatten aspirator via CA-filter, sedan Cambridge filter (gult filter) och leds genom en flytande kväve fälla för att ta bort H ₂ O. Den gasfas produkter gick till slut att snurra fälla och bubblas genom spinn fällan lösningen. Plantera antioxidant placerades mellan två bitar av konventionella acetat filter (Förstorad i cirkel A) bifogas cigarett att rensar ut fria radikaler i MCS.

Figur 2. En kvantitativ uppskattning för spin-svällning addukt koncentration i bensen kräver subtrahera en bred bakgrund signal från den första integrationenl spektrum. Den hyperfinnivåerna dela parametrarna för spin-svällning addukt är en _H = 1,95 G, en _N = 13.7G.

Figur 3. Passerar genom LN2 fälla förbättrar avsevärt kvaliteten på ESR signaler erhålls genom spin-fångst av MCS.

Figur 4. Effekt av naturliga antioxidanter på koncentrationen av fria radikaler i MCS. Den relativa signalen intensitet är: kontroll - 100%, Pycnogenol - 55%, druvkärneextrakt - 12%, lykopen - 10%.

En tillförlitlig uppskattning av effekten av olika fria radikaler i tobaksrök kräver en reproducerbar metod för kvantitativ detektion av fria radikaler. Tidigare ^1, har det visat sig att små volymer av högre fälla koncentration spin lösningar i opolära lösningsmedel är mest effektiva på att fånga fria radikaler från tobaksrök. Cigarettrök innehåller alltid vattenånga från förbränning av organiska föreningar och kvarvarande fukt i tobak som kan hamna i fällor lösningsmedel. Denna inblandning av vatten i PBN spin fällan lösning minskar avsevärt livslängden på addukter spin fånga och intensiteten i deras ESR signaler. Ta bort denna fukt genom en enkel passerar MCS genom en U-formad röret kyls med flytande kväve dramatiskt förbättrat kvaliteten på ESR spektra i våra experiment, även om vissa bråkdel av gasfas radikaler kan också fastna på den frusna ytan.

Med Thans teknik vi jämförde den relativa effektiviteten hos olika radikala sophantering naturliga föreningar infördes i cigarettfilter. Vi fann att lykopen och vindruvskärnextrakt omedelbart efter införliva cigarettfilter kan rengöra upp till 90% av fria radikaler från gasfas MSC. Så höga sophantering kapacitet rangordnar dessa billiga lättillgängliga naturliga föreningar bland de rapporterade mest effektiva fria radikaler beskyddare som hemoglobin och shikonine ^8,14. Men i våra experiment cigarettfilter laddad med studerat naturliga antioxidanter förlorade en märkbar del av sin sophantering kapacitet efter en veckas förvaring i rumstemperatur. Lösa detta problem kan stimulera framtida tillämpningen av lykopen och druvkärneextrakt i kommersiella cigarettfilter.

Inga intressekonflikter deklareras.

Detta arbete stöddes av National Institute of Health, bidrag nr NIH / NCRR P41-RR 016.292 (för ACERT).

1. Baum, S.L., Anderson, I.G.M., Baker, R.R, Murphy, D.M., & C.C., Rowlands. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
2. Bluhm, A.L., Weinstein, J., & Sousa, J.A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500 (1971).
3. Church, D.F. & Pryor W.A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., & Stavrides, J.C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
5. Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., & Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
7. Nair, A.K. & Brandt, E.N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., & Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
9. Pryor, W.A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
10. Pryor, W.A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
11. Rozzi, N.I., Singh, R.K., Vierling, R.A., & Watkins, B.A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
12. Shopland, D.R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
13. Shrikhandle, A.J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
14. Valavanidis, A. & Haralambous, E.A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.