JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

Serbest Radikaller Mainstream Sigara Duman algılama ve gaz faz Atma Protokolü

1, 2, 2

1CDCF-AOX Lab, 2National Biomedical Center for Advanced ESR Technology (ACERT), Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Spin-yakalama ESR spektroskopi, bitki antioksidan likopen, sigara dumanı, gaz-faz, serbest radikallerin temizlenmesi Pycnogenol ve üzüm çekirdeği ekstresi etkisini araştırmak için kullanılmıştır.

    Date Published: 1/02/2012, Issue 59; doi: 10.3791/3406

    Cite this Article

    Yu, L. X., Dzikovski, B. G., Freed, J. H. A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (59), e3406, doi:10.3791/3406 (2012).

    Abstract

    Sigara içmek insan kanseri ile ilişkilidir. Akciğer kanseri ölümlerinin çoğu sigara 5,6,7,12 neden olduğu bildirilmiştir. , Sigara dumanı, partikül aşamasında tütün katran ve ilgili ürünlerin karsinojenik ve mutajenik ilgili hastalıkların başlıca nedenleri olmasına rağmen, sigara dumanı, serbest radikallerin de önemli bir grup 9,10 kanserojen olarak kabul edilen önemli miktarda içerir. Serbest radikallerin zararlı protein yapısı, lipidler ve DNA dizilerinin hücre bileşenleri saldırı ve çeşitli kanser türlerine yakalanma riski artar. İnhale radikaller, tütün dumanının akciğer 3 olumsuz sağlık etkileri pek çok katkıda adducts üretir . Çalışmalar, sigara kaynaklı hasar riskleri azaltmak için sigara dumanı serbest radikaller azaltmak için yapılmıştır. Hemoglobin ve heme içeren bileşikler kısmen nitrik oksit, reaktif scavenge olabilir bildirilmiştiroksidanlar ve sigara dumanı 4 kanserojen uçucu nitrosocompounds. Hemoglobin ve aktif karbon, serbest radikallerin scavenge ve serbest radikaller, sigara dumanı 14% 90 yukarı kaldırmak için kullanılan bir 'biyo-filtre' oluşuyordu. Ancak, maliyet etkisizliği nedeniyle, başarılı bir şekilde ticari hale değildir. Başka bir çalışmada, Çin bitkisel ilaç 8 bir bileşeni shikonin iyi bir süpürücü verimliliği gösterdi . Bu çalışmada, sigara filtresi spin-yakalama kullanarak ana sigara dumanı, gaz fazında serbest radikallerin scavenge etkisi (MCS) sigara dumanı ve ölçüm gaz fazı, serbest radikallerin temizlenmesi için ortak doğal antioksidan özleri tanıtmak için bir protokol rapor Elektron Spin Rezonans (ESR) Spektroskopisi 1,2,14. Biz likopen ve sigara filtrelerinde gelecekteki uygulama noktası olabilecek üzüm çekirdeği ekstresi yüksek süpürücü kapasitesi gösterdi. Bu profesyonellerin önemli bir avantajpective temizleyiciler sırasıyla domates ya da şarap endüstrisi yan 11,13 büyük miktarlarda elde edilebilir.

    Protocol

    1. Malzemeler

    Bu çalışmada kullanılan tüm çözücüler saflıkta. Spin N-tert-butil-α-phenylnitrone (PBN) ve standart spin etiketi dahil olmak üzere, tuzak, 2,2,6,6-tetramethyl-1 piperinyoxyl (TEMPO) Sigma firmasından temin ve tedarik edildiği şekliyle kullanılmıştır. Bitki antioksidanlar Swanson, Inc USA ticari olarak elde edilmiştir.

    2. Serbest radikaller, sigara dumanı ve analiz hazırlanması

    1. Antioksidanlar filtre içine tanıtmak için, likopen aseton içinde çözünmüş iken, antioksidanlar Pycnogenol ve üzüm çekirdeği ekstresi,% 95 etanol içinde çözülür. Çözücü hacimleri antioksidan çözünürlük bağlı olarak farklı idi.
    2. Antioksidan miktarı 0.4 mg / filtre kullanılmıştır. Daha sonra 10 mg aktif karbon ile kaplanmıştır. Bu amaçla aktif karbon filtre edilir ve vakum altında kurutulur anaerobik koşullarda antioksidan çözümü ile ~ 12 saat, karıştırıldı. Antioksidanlar sonra geleneksel asetat filtre (CA filtre) haline getirilmiştir. Bu amaçla, filtre, iki parça halinde kesilmiş oldu. Antioksidan filtre sandviç (Şekil 1A) - kaplı bitki antioksidanlar filtresi ve bir parça bant ile sarılmış iki adet arasında bir filtre oluşturmak için yerleştirildi. Bu kombine filtre daha sonra tütün içeren sigara çubuklar bağlanmıştır. Filtre, herhangi bir antioksidandır dışında antioksidan filtre olarak aynı şekilde yapıldı kontrolü eklendi.
    3. Önce sigara simülasyon, araştırma sigara ambalajsız ve 2 gün en az doymuş bir NaBr çözümü kullanarak sabit nem ortamında (20 ° C,% 60 bağıl nem) tutuldu.
    4. Rutin analiz için tütsüleme simülasyonu Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir tek portlu sigara cihazı kullanılarak ortam sıcaklığında yapıldı, su aspiratör veya GAST DOA-P104-BN Vakum Pompa / Kompresör (Benton Harbor, Mich) bağlı oluşur spin-yakalamabir ucunu açık bir T-kavşak ile montaj. Puflar ponponları arasında açık kaldı açık ucuna takarak yapıldı. Gaz akış debimetre tarafından kontrol edilir ve ~ 2.2 SCFH = 17.5 mL / s pompa ve havalandırma arasına yerleştirilen bir vana ayarlayarak.
    5. 2 saniyelik bir süre için 1 'e benzer her 60 saniyede tekrarlanan araştırma sigara puf hacmi 35 mL koşul altında tüketilmiştir. Şekil gösterildiği gibi spin yakalama sistemi ile birlikte gaz faz serbest radikallerin kantitatif tahmini için sigara simülasyonu yapıldı. 1.
    6. On yoğun puf (35 ml / puf) her sigara için alınmıştır. Gaz-faz, serbest radikaller Cambridge filtresi pad aracılığıyla MCS geçen tarafından toplanan ve daha sonra spin yakalama çözüm (benzen, 2.0 ml 0.05 M PBN) haline getirilmiştir.
    7. Son puf sonra, kabarmış yakalama çözüm aynı benzen ile ilk hacmi (2.0 mL) için yeniden düzenlenebilir. Bir kısım ~ 25 aktarılır.0 mm uzunluğunda, bir ucu kapatılmış 3 mm ID cam tüp.
    8. Yakalama çözüm donma-pompa-çözülme yordamı kullanarak deoxygenated oldu. Sıvı azot altında dondurulmuş ve bir vakum uygulandı. Sonra, argon atmosferi altında hapsolmuş gaz kabarcıkları kaçmak için izin çözülmüş oldu ve tekrar dondurulmuş. Bu döngü üç kez tekrar edildikten sonra, tüpün alev sızdırmaz, vakum altında ve daha fazla ESR ölçümleri kullanılır. Benzen iyi çözünür oksijen, organik radikallerin ESR hatları genişletiyor çünkü bu adım gereklidir. Deoxygenation sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde geliştirir.
    9. X-Band ESR spektrumları Bruker EMX spektrometre, 9.34 GHz standart koşullar altında bir frekansında kaydedildi. Çoğu deneylerde kullanılan spektrometre ayarlarını merkezi alanında 3312.5G, tarama genişliği 80G, modülasyon genliği 0.5G, zaman sabiti 82 mikrosaniye, tarama süresi 40 sn.
    10. Spin trap adducts bazı durumlarda req deney koşulları, nispeten istikrarlı bir25 birikimleri, genelde ~ 20 dakika aldı uired. Ancak, 12 saat sonra benzen çözüm ESR sinyalleri ~ 5 faktör yoğunluğu azalmıştır.
    11. Yakalama adduct konsantrasyonunu ölçmek için, ilk birinci türev ESR spektrumu entegre edildi. Absorbsiyon spektrumunun duman bulunan kurum / katranlı ürünler nedeniyle büyük olasılıkla geniş bir tekli arka plan gösterir.

      Bu arka plana çıkarma sonra yakalama adduct ayrılmış üçlü bir kez daha entegre edilmiştir (Şekil 2).

    3. Temsilcisi Sonuçlar

    Yanan sigara duman (gaz fazı) serbest radikallerin çoğu anlık ve istikrarsız. Bu radikallerin gözlemlemek için bir spin tuzak tekniği kullanılmaktadır. Bu daha istikrarlı ve ESR (Şekil 1) tarafından tespit edilebilir bir spin adduct dönüştürerek gaz faz serbest radikalleri yakalar. 0.05 Bu çalışmada, spin-trap çözümM PBN duman gazı, oksijen ve karbon merkezli radikallerin 15 ayrı zor bir karışımı olan serbest radikaller, faz toplamak için kullanıldı . Bizim durumumuzda ise, gözlenen aşırı ince bölme sabitleri N = 13.7G ve H = 1.95G alkoxyl serbest radikaller (RO.) 2 ana ürün olduğunu öne sürerek, yakalama adducts karşılık gelen değerler birbirine çok benzer. Biz duman akış nem nedeniyle bu zayıf ESR sinyalleri (Şekil 2) bizim ilk ölçümlerde gözlenen düşük tekrarlanabilirlik gösterdi. Bu sorunu gidermek için, Cambridge filtresi ve spin trap çözümü arasında bir sıvı nitrojen (LN2) tuzak ekledi. LN 2 tuzak, hızlı dondurma, MCS akış su kaldırılır ve cam tüp iç duvara yakalamak. Bu ESR sinyalleri büyük ölçüde geliştirilmiş ve yüksek tekrarlanabilir sonuçları (Şekil 3) için izin.

    Sıkışıp serbest radikallerin miktarını tespit edildireferans örnek. Kontrol örnekleri için antioksidanlar olmadan, çift ayrılmaz spektrum TEMPO bilinen konsantrasyon için bir çift integral spektrumu ile karşılaştırılması tahmin tipik adduct benzen konsantrasyonu 1.24 mcM (Şekil 2). ~ 350 ml hava miktarı sigara boyunca her sigara geçti bu yana, bu ~ 7.1X10 -9 M MCS gaz fazında serbest radikal konsantrasyonu için bir tahmin sağlar ve gaz fazı sıkışıp radikallerin toplam sayısı bir bütün 1.5X10 15 ~ sigara. Gaz ve partikül faz de dahil olmak üzere bütün bir sigara, duman serbest radikallerin toplam tutarı için bir tahmin, ~ 10 16 serbest radikallerin 9 oldu.

    Gaz-faz ana akım sigara dumanı serbest radikaller üzerinde bitki antioksidan süpürücü etkisi farklı düzeylerde gözlendi. Onların süpürücü oranları Şekil sunuldu. 4. Likopen ve üzüm çekirdeği ekstresi, en yüksek oranları düşük ikener oranı Pycnogenol gözlenmiştir (Şekil 4).

    Şekil 1
    Şekil 1. Dönüş tuzağı kullanarak ana sigara dumanı (MCS) gaz faz serbest radikalleri toplayarak sigara simülasyon tasarımı için geliştirilmiş bir diyagram. MCS sonra CA filtresi, Cambridge filtresi (sarı filtre) ile su aspiratör tarafından çekilen ve H 2 O kaldırmak için sıvı azot tuzağı ile geçti Gaz faz ürünleri nihayet tuzak spin gitti ve spin trap çözüm yoluyla kabarmış. Bitki antioksidan MCS serbest radikalleri temizleyebileceği sigaraya bağlı iki adet konvansiyonel asetat filtreler (daire bir Genişlemiş) arasına yerleştirilir.

    Şekil 2
    Şekil 2 benzen spin-yakalama adduct konsantrasyon için bir ilk integra kantitatif tahmin çıkarılarak geniş bir arka plan sinyali gerektirirl spektrum. Spin-yakalama adduct aşırı ince bölme parametreleri H = 1.95 G, N = 13.7G.

    Şekil 3
    Şekil 3 LN2 tuzak geçerek MCS spin-yakalama ile elde edilen ESR sinyalleri kalitesini önemli ölçüde geliştirir .

    Şekil 4
    Şekil 4. Doğal antioksidanlar serbest radikallerin MCS konsantrasyonuna etkisi. Göreceli sinyal şiddetleri vardır: Kontrol -% 100, Pycnogenol -% 55, üzüm çekirdeği ekstresi -% 12, likopen -% 10.

    Discussion

    Güvenilir bir tahminin, tütün dumanı, farklı serbest radikalleri yok eden enzimleri etkisi serbest radikallere kantitatif tespiti için tekrarlanabilir bir teknik gerektirir. Daha önce 1, non-polar çözücüler içinde yüksek konsantrasyonda spin trap çözümleri küçük miktarlarda tütün dumanı serbest radikalleri yakalama en etkili olduğu kanıtlanmıştır. Sigara dumanı her zaman organik bileşiklerin yanma ve bindirme çözücü sonuna kadar tütün kalan nem ve su buharı içerir. PBN spin trap çözüm su bu karışıma spin yakalama adducts ömrü ve kendi ESR sinyalleri yoğunluğu önemli ölçüde azalır. Gaz-faz radikallerin bazı fraksiyon da donmuş yüzeyinde kapana kısılmış olsa bile, sıvı nitrojen ile soğutulan bir U-şekilli bir tüp aracılığıyla basit geçen MCS bu nem çıkarma dramatik deneylerde ESR spektrumları kalitesi artar.

    T Kullanımıonun tekniği, sigara filtreleri haline getirilen doğal bileşikler farklı radikal süpürücü göreceli etkinliği karşılaştırıldı. Biz likopen ve üzüm çekirdeği, sigara filtreleri içine içeren sonra serbest radikallerin% 90 kadar gaz fazı MSC scavenge hemen ayıklamak bulundu. Bu tür yüksek süpürücü kapasitesi bu ucuz hazır doğal bileşikler, hemoglobin ve shikonine 8,14 gibi en etkili serbest radikal koruyucuları arasında sırada yer alıyor . Ancak, çalışılan doğal antioksidanlar ile yüklenen deneyler, sigara filtreleri, depolama oda sıcaklığında bir hafta sonra atma kapasitesi gözle görülür bir bölümünü kaybetti. Bu problem çözme, likopen ve ticari sigara filtrelerinde üzüm çekirdeği ekstresi gelecekteki uygulama uyarabilir.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgements

    Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe No NIH / NCRR P41-RR 016.292 (ACERT) tarafından desteklenmiştir.

    References

    1. Baum, S.L., Anderson, I.G.M., Baker, R.R, Murphy, D.M., & C.C., Rowlands. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
    2. Bluhm, A.L., Weinstein, J., & Sousa, J.A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500 (1971).
    3. Church, D.F. & Pryor W.A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
    4. Deliconstantinos, G., Villiotou, V., & Stavrides, J.C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
    5. Hecht, S.S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
    6. Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., & Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
    7. Nair, A.K. & Brandt, E.N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
    8. Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., & Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
    9. Pryor, W.A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
    10. Pryor, W.A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
    11. Rozzi, N.I., Singh, R.K., Vierling, R.A., & Watkins, B.A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
    12. Shopland, D.R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
    13. Shrikhandle, A.J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
    14. Valavanidis, A. & Haralambous, E.A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
    15. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., & Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).

    Comments

    6 Comments

    Fantastic, well done. Everybody gains here, the smoker, non-smoker and the environment.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 3, 2012, 1:28 PM

    Actually, nobody gains. If cancer were the only health concern, I could possibly get enthused. But, what about cardiovascular and respiratory concerns. Plus, most of the smoke generated by a burning cigarette is sidestream, not mainstream. The sidestream smoke is not passing through any filter, so the carcinogens are still abundantly present to the non-smoker and smoker alike.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 4, 2012, 4:31 PM

    This work was previously published, but you do no cite the paper.
    Scavenging Effects of Plant Antioxidants on Gas-Phase Free Radicals in
    Mainstream Cigarette Smoke
    Xin Shen a; Kejun Zhong b; Xianjun Sun b; Hongbing Lu b; Yu Shen c;Long-Xi Yu ac
    a Department of Plant Breeding and Genetics, Cornell University, Ithaca, New York, USA b Technical
    Center of China Tobacco Hunan Industrial Corp. Ltd., Changde, China c Hunan Agricultural
    University, Changsha, China Analytical Letters, 43: 446²11;454, ²010
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 16, 2012, 8:12 PM

    To the editors

    The author Long-Xi Yu is affiliated with the Changde Cigarette Factory (CDCF). He clearly has a potential conflict of interest. Why is he allowed not to declare this conflict?

    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 30, 2012, 6:22 AM

    Thank you for your comment. Since the authors do not recommend smoking, nor promote any one additive CDFC produces, we felt listing the affiliation was sufficient.

    Beth Hovey (Editorial Director)
    Reply

    Posted by: Beth H.January 31, 2012, 4:36 PM

    Muy bien excelente, yo soy estudiante de ingeniería industrial y tengo como proyecto hacer un purificador para autos así evitar la contaminación ambiental y personal que tenemos al inalar tanto humo en las calles. ¿ alguien me podría ayudar con la parte química? gracias
    Reply

    Posted by: Oscar yovanny p.August 28, 2013, 11:56 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter