Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hindi was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

, , ,

Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.242.233.11, User IP: 54.242.233.11, User IP Hex: 921889035

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

Hukasova, E., Silva Cascales, H., Kumar, S. R., Lindqvist, A. Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET. J. Vis. Exp. (59), e3410, doi:10.3791/3410 (2012).

Abstract: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा (झल्लाहट) स्थानांतरण आधारित संवाददाताओं 1 जीवित कोशिकाओं में अंतर्जात kinase और फॉस्फेट गतिविधियों के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं. इस तरह की जांच आमतौर पर CFP और YFP के वेरिएंट, एक phosphorylatable अनुक्रम और एक phospho बाध्यकारी डोमेन द्वारा हस्तक्षेप से मिलकर बनता है. Phosphorylation पर, जांच परिवर्तन रचना, या CFP और YFP के बीच दूरी उन्मुखीकरण के एक परिवर्तन में जो परिणाम में एक परिवर्तन के लिए अग्रणी दक्षता झल्लाहट (चित्र 1). कई जांच पिछले दशक के दौरान प्रकाशित किया गया है, कई kinases और phosphatases की गतिविधि संतुलन PKA 2, PKB 3, 4, PKC PKD 5, 6 ERK, JNK 7, 18 CDK अरोड़ा 9 बी के संवाददाताओं और Plk1 9 सहित निगरानी . मॉड्यूलर डिजाइन को देखते हुए अतिरिक्त जांच के लिए निकट भविष्य में 10 उभरने की संभावना हैं.

कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति signali तनाव से प्रभावित हैएनजी रास्ते 11. विशेष रूप से, कोशिका चक्र जब कोशिकाओं को तनाव से 12 उबर रहे हैं तुलना में वृद्धि से बेफिक्र दौरान अलग नियंत्रित किया जाता है समय चूक कोशिका चक्र के माध्यम से कोशिकाओं की इमेजिंग इसलिए विशेष सावधानी की आवश्यकता है.. यह एक समस्या बन जाता है विशेष रूप से जब ratiometric इमेजिंग रोजगार, के बाद से शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत के साथ दो छवियों को सही ढंग से परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हैं. Ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट गतिविधियों में सेल चक्र निर्भर परिवर्तन के इमेजिंग predominately सेल चक्र 8,9,13,14 के उप वर्गों के लिए प्रतिबंधित किया गया है है.

यहाँ, हम एक विधि झल्लाहट - आधारित मानव कोशिका चक्र के दौरान ratiometric इमेजिंग का उपयोग कर जांच की निगरानी पर चर्चा की. विधि उपकरण है कि जीवन विज्ञान में कई शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध है और माइक्रोस्कोपी या छवि प्रसंस्करण के विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता नहीं है पर निर्भर करता है.

Protocol: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

1. कोशिकाओं के लिए जांच का परिचय

  1. झल्लाहट आधारित एक जांच और एक प्लाज्मिड प्रदान प्रतिरोध के साथ सह - transfect कोशिकाओं. चुनें एक अभिकर्मक तरीका है कि अपने हित के सेल प्रकार में कुशल है. U2OS कोशिकाओं के लिए, मानक कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक तरीकों पर्याप्त परिणाम 15 दे.
  2. कम से कम सात दिनों के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक में कक्षों का चयन करें. यह enriches विषाक्त अभिव्यक्ति के स्तर, या अभिव्यक्ति के स्तर है कि गंभीर रूप से कोशिका चक्र को प्रभावित के साथ कोशिकाओं की जांच और राशि की सीमा व्यक्त कोशिकाओं की राशि.
  3. (वैकल्पिक) स्थिर क्लोन के लिए चयन करें.
  4. निश्चित या जीवित कोशिकाओं का उपयोग सत्यापित करने के लिए, है कि दोनों CFP और YFP लगभग एक ही अनुपात में सभी कोशिकाओं में मौजूद हैं.
  5. मामले में कुछ कोशिकाओं को केवल CFP या YFP होते हैं, पुनर्संयोजन की संभावना हुई है. पुनर्संयोजन या तो बैक्टीरियल वृद्धि के दौरान या जांच के अभिकर्मक के बाद होते हैं और बाद मामले में प्लाज्मिड गुणवत्ता पर निर्भर हो सकता है सकते हैं. प्लाज्मिड पी दोहराएँमरम्मत और अभिकर्मक पहले प्लाज्मिड linearize यदि समस्या बनी रहती है.

2. निगरानी ratiometric झल्लाहट

  1. गिलास नीचे बर्तन, या एक कक्ष में बढ़ते के लिए कवर फिसल जाता है पर बीज कोशिकाओं. सुनिश्चित करें कि बर्तन / कवर फिसल जाता है 1.5 नहीं (170 सुक्ष्ममापी मोटी).
  2. Phenol के लाल के बिना तापमान नियंत्रण के साथ एक motorized epifluorescence खुर्दबीन 37 सी. सेंटीग्रेड के सेट पर मध्यम विकास में कोशिकाओं पर्वत मीडिया के पीएच सीओ 2 या 2 स्वतंत्र मीडिया ऐसे Liebowitz 15 के रूप में सीओ का उपयोग करके, विनियमन सुनिश्चित करें.
  3. पारेषित प्रकाश का उपयोग कोशिकाओं पर ध्यान दें. फ्लोरोसेंट रोशनी का उपयोग कोशिकाओं पर मत देखो.
  4. एक 12 या 16 बिट YFP (YFPex) उत्तेजना और YFP उत्सर्जन फिल्टर (YFPem) और एक उपयुक्त dichroic दर्पण का उपयोग कर छवि प्राप्त द्वारा शुरू करो. अधिक से अधिक उपलब्ध binning है कि अभी भी आवश्यक subcellular संकल्प परमिट का प्रयोग करें. का उपयोग करने के लिए एक उच्च जोखिम समय या तीव्रता में कमी binning phototoxicity से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. मुझेasure या पृष्ठभूमि तीव्रता और लगभग शोर को मापने या किसी न किसी औसत, एक कोशिकाओं के रहित क्षेत्र में न्यूनतम और अधिकतम पिक्सेल मूल्यों का आकलन द्वारा अनुमान है. बदलें जोखिम समय और तटस्थ घनत्व फिल्टर इतना है कि सेल में औसत संकेत लगभग पृष्ठभूमि तीव्रता अधिक पांच को दस बार अधिकतम और न्यूनतम पृष्ठभूमि तीव्रता के बीच का अंतर है.
  6. सत्यापित करें छवियाँ है कि संतृप्त नहीं किया जा रहा है करीब हैं. छवि में अधिकतम तीव्रता गतिशील रेंज (जैसे एक 12 बिट छवि में अधिकतम 2000) तीव्रता मतभेद के लिए अनुमति देने के लिए जब कोशिकाओं पिंजरे का बँटवारा दर्ज की तुलना में आधे से भी कम किया जाना चाहिए.
  7. 2,4 2,6 कदम CFP उत्तेजना और YFP उत्सर्जन फिल्टर और एक उपयुक्त dichroic दर्पण का उपयोग दोहराएँ.
  8. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ कई क्षेत्रों का चयन करने के लिए, 2.4 बिंदु के लिए 2.7 के लिए इस्तेमाल किया क्षेत्रों को छोड़कर, और है कि अधिकतम तीव्रता सुनिश्चित सभी कोशिकाओं में गतिशील रेंज के आधे से भी कम है.
  9. एक समय चूक प्रयोग दो 4 हर छवियों प्राप्त प्रारंभ करें5 मिनट - YFPex का उपयोग YFPem और CFPex - YFPem फिल्टर सेट.

3. सत्यापित और शर्तों अनुकूलन

  1. अधिग्रहीत छवियों को खोलें और समसूत्री विभाजन से कोशिकाओं है कि ट्रांसफ़ेक्ट जांच व्यक्त लिए पिंजरे का बँटवारा सेल चक्र समय की निगरानी.
  2. सेल इस्तेमाल किया प्रकार के लिए प्रकाशित डेटा को मापा सेल चक्र समय की तुलना करें. वैकल्पिक रूप से, फिल्म प्रेषित केवल प्रकाश की एक छवि (जैसे डीआईसी या चरण विपरीत) हर घंटे प्राप्त करने के संदर्भ में कोशिका चक्र बार मिल द्वारा कोशिकाओं untransfected.
  3. मामले में समसूत्री विभाजन से पिंजरे का बँटवारा करने के लिए समय सेल चक्र समय संदर्भ मेल खाती है, तो चरण 4 पर जाएँ. वैकल्पिक रूप से, फिर से कठिन जोखिम के अधिग्रहण का उपयोग छवियों, और अधिक समय अंक या एकाधिक z - स्तर और दोहराने चरण 3.
  4. मामला समसूत्री विभाजन से पिंजरे का बँटवारा करने के लिए समय में सेल चक्र समय संदर्भ के अनुरूप नहीं है, फिल्म के अंत में प्रेषित केवल प्रकाश की एक छवि (जैसे डीआईसी या चरण विपरीत) हर घंटे एक छवि से पीछा द्वारा प्राप्त कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्टट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान के लिए प्रयोग की.
  5. यदि ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं अभी भी अब सेल चक्र समय दिखाने के लिए, चरण 1 दोहराएँ, किंतु जांच transfect कम या स्थिर क्लोन है कि जांच की बहुत कम मात्रा में होते हैं के लिए चुनें.
  6. यदि ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं फ्लोरोसेंट रोशनी के अभाव में सामान्य कोशिका चक्र बार दिखाने के लिए, binning, तटस्थ घनत्व फिल्टर, जोखिम समय, और छवियों के बीच समय को संशोधित करने के चरण 2 के द्वारा, लेकिन कम जोखिम दोहराएँ.

4. झल्लाहट विश्लेषण

  1. विश्लेषण सबसे माइक्रोस्कोपी के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर के द्वारा किया जा सकता है. यहाँ हम वर्णन कैसे फ्रीवेयर ImageJ (का उपयोग कर विश्लेषण करने के लिए http://rsb.info.nih.gov/ij) प्लगइन अनुपात (प्लस का उपयोग http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html ).
  2. ImageJ में छवियों को खोलें. मामले में आपकी छवियों एक बहुरंगा STAC के प्रारूप में हैंकश्मीर (जैसे Deltavision), पहली बार उन्हें एक hyperstack कनवर्ट करके अलग व्यक्तिगत चैनल: hyperstack छवि hyperstack ढेर और बाद में उन्हें एकल चैनल का उपयोग ढेर विभाजन: छवि hyperstack dimensionality कम
  3. प्रक्रिया मठ - गुणा यह कदम वैकल्पिक है, के रूप में यह केवल करने के लिए सुनिश्चित करना है कि अनुपात 0 और 1 के बीच सीमा में नहीं कर रहे हैं छवियों के दृश्य स्पष्टता बढ़ाने का इरादा है: 3 का उपयोग कर के साथ YFPem ढेर - YFPex गुणा.
  4. YFPex - YFPem ढेर, एक क्षेत्र है कि कोशिकाओं से रहित है (आरओआई) में ब्याज की एक क्षेत्र को आकर्षित है, लेकिन है कि एक सेल करने के लिए मापा जा के लिए करीब है. एक ही छवि में विभिन्न कोशिकाओं के विभिन्न क्षेत्रों की आवश्यकता होती है, के रूप में दोनों पृष्ठभूमि और संकेत तीव्रता आम तौर पर एक छवि के केंद्र में मजबूत हो सकता है.
  5. आरओआई प्रबंधक आरओआई जोड़ें: प्रबंधक विश्लेषण उपकरण आरओआई.
  6. विश्लेषण के उपाय: - YFPem और CFPex YFPem ढेर दोनों YFPex में रॉय की औसत तीव्रता उपाय
  7. एकाधिक timepoints पर दोहराएँ और सत्यापित पृष्ठभूमि ब्याज की सेल करने के लिए करीब तीव्रता फिल्म भर में समान हैं.
  8. माप सेट शामिल हैं: कम से कम तीव्रता का विश्लेषण सेट माप - न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य.
  9. किसी कक्ष का सबसे को कवर ब्याज की एक क्षेत्र ड्रा और दोनों YFPex में कम से कम तीव्रता को मापने - YFPem और CFPex - YFPem ढेर. 4.6 से मापा कम से कम तीव्रता और पृष्ठभूमि की तीव्रता के बीच का अंतर ले लो और यह दो से विभाजित. यह एक कतरन मूल्य के लिए एक प्रारंभिक अनुमान प्रदान करती है.
  10. ओपन अनुपात प्लस. YFPem और CFPex - YFPem ढेर YFPex का चयन करें. अनुपात, का चयन करें CFPex झल्लाहट - धुआँरा 1 के रूप में YFPem के लिए, उल्टे अनुपात झल्लाहट जांच की phosphorylation पर दक्षता कम हो जाती है जहां झल्लाहट, का चयन करें YFPex visualizing - धुआँरा 1 के रूप YFPem.
  11. मापा पृष्ठभूमि तीव्रता और क्लिपिंग मान सम्मिलित करें.
  12. परिणामी अनुपात स्टैक की स्केलिंग सेट और एक उपयुक्त लग यू लागूपी (LUT) तालिका के अनुपात में परिवर्तन की कल्पना कर सकते हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

Plk1 गतिविधि G2 चरण और पिंजरे का बँटवारा दौरान चोटियों में नाभिक में पहली बार दिखाई देता है. चित्रा 3 एक न्यूनतम phototoxicity सेटिंग्स का उपयोग कर धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रयोग से पता चलता है. कृपया ध्यान दें कि यह एक प्रतिनिधि प्रारंभिक परिणाम है और छवियों के बीच जोखिम स्थितियों या समय के लिए शोर अनुपात या अस्थायी समाधान के लिए संकेत में वृद्धि करने के लिए संशोधित किया जा सकता है कि. चित्रा 3 डी पता चलता है कि जांच व्यक्त कोशिकाओं के बहुमत के बीच 20 और 25 घंटे की एक कोशिका चक्र समय के साथ पैदा करना, यह दर्शाता है कि इमेजिंग शर्तों और जांच की अभिव्यक्ति के स्तर सेल चक्र समय को प्रभावित नहीं करते. यद्यपि वहाँ काफी शोर है, G2 में Plk1 गतिविधि की प्रवृत्ति बढ़ रही है और पिंजरे का बँटवारा में 14 peaking (अंजीर 3A) स्पष्ट रूप से दिखाई है. कच्चे डेटा प्रसंस्करण, यहाँ द्वारा मतलब है (3B अंजीर) kymograph, या औसत उल्टे आर ए की मात्रा का ठहराव के रूप में प्रस्तुत फ़िल्टरिंग tio (अंजीर 3C) स्पष्टता में वृद्धि कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 झल्लाहट आधारित जांच के सिद्धांत kinase और फॉस्फेट गतिविधियों पर नजर रखने के. दो fluorophores, आमतौर पर (नीला) CFP और YFP (हरा), एक phospho बाध्यकारी (नारंगी) डोमेन और एक phosphorylatable अनुक्रम (पीला) से जुड़े हुए हैं. Phosphorylation (लाल) phospho - बाध्यकारी डोमेन के लिए बाध्य mediates, जिससे जांच में एक गठनात्मक परिवर्तन उत्प्रेरण. दो fluorophores, जो प्रभावित करता है CFP और YFP के बीच दक्षता झल्लाहट के बीच की दूरी या अभिविन्यास में एक अंतर में गठनात्मक परिवर्तन का परिणाम है. झल्लाहट रोमांचक CFP और निगरानी YFP उत्सर्जन (बिंदीदार लाइनों) के द्वारा visualized किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध रूपरेखा.

p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
चित्रा 3. Plk1 गतिविधि G2 चरण और पिंजरे का बँटवारा दौरान चोटियों में नाभिक में पहली बार दिखाई देता है. U2OS जांच झल्लाहट आधारित निगरानी Plk1 9,14 गतिविधि व्यक्त कोशिकाओं 60 घंटा Deltavision Spectris इमेजिंग एक 20x NA 0.7 हवा उद्देश्य और एक पारा दीपक के साथ सुसज्जित प्रणाली का उपयोग कर के लिए फिल्माया गया. इमेजिंग शर्तों को न्यूनतम phototoxicity कारण चयन किया गया था, के रूप में धारा 2 में उल्लिखित, 4x binning और तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करते हुए कि ब्लॉक आने वाली प्रकाश की 99%. ए, उल्टे झल्लाहट अनुपात की झूठी रंग प्रतिनिधित्व, 4 डिवीजनों के माध्यम से एक कोशिका के बाद. बी, एक मतलब फिल्टर लागू करने के बाद एक में दिखाया गया है सेल के kymograph. उल्टे की मात्रा का ठहराव, सी ए डी में दिखाया सेल, 50 की संचयी mitotic प्रविष्टि के अनुपात झल्लाहट बेटी कोशिकाओं के विभाजन सहित व्यक्त कोशिकाओं, जांच झल्लाहट.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

मॉनिटरिंग सेल चक्र के दौरान झल्लाहट विचार है कि कम महत्वपूर्ण हैं जब बाह्य stimuli करने के लिए अल्पकालिक प्रतिक्रियाओं का आकलन की आवश्यकता है. सबसे पहले, कोशिका चक्र प्रगति को आसानी से तनाव संकेतन द्वारा परेशान है, की आवश्यकता होती है कि phototoxicity एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाता है. दूसरा, सभी संवाददाताओं संभावित kinases, phosphatases, या बातचीत डोमेन titrating द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं. आकलन अगर प्रयोगात्मक शर्तों पर्याप्त हैं शायद सबसे सरल तरीका समसूत्री विभाजन से पिंजरे का बँटवारा करने के लिए कोशिका चक्र लंबाई को मापने के लिए और यह प्रतिदीप्ति और एक जांच की इमेजिंग अभिव्यक्ति की स्वतंत्र प्रयोगों के लिए तुलना है.

निगरानी में एक महत्वपूर्ण कारक झल्लाहट सेल चक्र के दौरान अनुपात उच्च संकल्प के साथ सुंदर चित्र प्राप्त करने का प्रलोभन का सामना है. हालांकि सटीक सेटिंग्स खुर्दबीन प्रणाली की संवेदनशीलता और अभिव्यक्ति के स्तर पर और विशेष रूप से जांच की प्रकृति पर निर्भर है, यह महत्वपूर्ण है उपयोग करने के लिएbinning का एक स्तर है कि क्या संगत बिल्कुल देखने के लिए आवश्यक है. हालांकि CFPex के बीच समय - YFPem और YFPex - YFPem छवियों के लिए कम करने की आवश्यकता है सेल आकारिकी में हमारे हाथ में परिवर्तन से बचने के बेहतर है अधिक से अधिक 0.1 सेकंड में जोखिम बार रखने के लिए और तटस्थ घनत्व फिल्टर द्वारा फ्लोरोसेंट रोशनी की तीव्रता को कम करने .

कैसे phototoxicity कोशिका चक्र को प्रभावित करता है अभिव्यक्ति के स्तर और जांच के स्थानीयकरण पर काफी हद तक निर्भर करता है. एक जांच है कि chromatin के लिए स्थानीय है, उदाहरण के लिए एक histone के साथ विलय द्वारा अधिक फ्लोरोसेंट रोशनी के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं, संभाव्यतः के बाद से phototoxic byproducts के डीएनए के आसपास के क्षेत्र में बनाया जाता है renders. यह इसलिए महत्वपूर्ण है कोशिकाओं है कि पत्रकारों की अपेक्षाकृत कम स्तर व्यक्त की निगरानी और फिर जांच सेल चक्र समय अगर अलग subcellular संरचनाओं को जांच स्थानीयकृत.

कई नियंत्रण प्रयोगों कि झल्लाहट में मौजूद है सत्यापित करने के लिए आवश्यक हैंप्रयोगात्मक सेटअप और उस अनुपात में परिवर्तन एक जांच की वास्तविक phosphorylation दर्शाते हैं. कार्यात्मक नियंत्रण, जैसे निषेध या एक kinase के रिक्तीकरण के अलावा, यह सलाह दी जाती है करने के लिए जैव रासायनिक प्रयोगों के लिए सत्यापित करें कि जांच phosphorylated है, उम्मीद phospho - स्वीकर्ता जांच के भीतर एक गैर phosphorylatable अवशेषों साइट के उत्परिवर्तन, और photobleaching स्वीकर्ता प्रदर्शन झल्लाहट की घटना साबित होते हैं. एक व्यापक मान्यता का एक उदाहरण के लिए, रेफरी 14 में अनुपूरक 3 आंकड़ा देखें.

हालांकि यह सैद्धांतिक दोनों CFP और YFP उत्सर्जन की निगरानी, ​​ऐसी setups के बहुत संवेदनशील परिवर्तन और रोशनी की स्थिति को ध्यान केंद्रित करने और आसानी से कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कर रहे हैं झल्लाहट परिवर्तन का आकलन करने के लिए बेहतर है. परिवर्तन को ध्यान केंद्रित संवेदनशीलता रंगीन विपथन, जहां CFP और YFP उत्सर्जन एक ही बिंदु पर ध्यान केंद्रित नहीं करने के लिए कारण है. रोशनी परिवर्तन प्रकाश पथ के विभिन्न संरेखण पर काफी हद तक निर्भर करते हैं. यह विशेष रूप से प्रमुख है जब फिल्टर युक्त cubes का उपयोगएक dichroic दर्पण. फोकस और रोशनी में परिवर्तन को सही उद्देश्यों और ध्यान से गठबंधन फिल्टर क्यूब्स का उपयोग कम किया जा सकता है. हालांकि, हमारे अनुभव में, उत्सर्जन फिल्टर निरंतर रखने उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर के अलग नियंत्रण के साथ एक सेटअप का उपयोग करके अधिमानतः बेहतर परिणाम देता है.

मनाया झल्लाहट परिवर्तन के परिमाण CFP प्रतिदीप्ति से YFP उत्सर्जन फिल्टर bleedthrough से कम है. मामले में पर्याप्त bleedthrough है, एक अतिरिक्त CFPex YFPem छवि - CFPem छवि में CFPex bleedthrough सही हासिल किया जा सकता है. हालांकि, इस तरह के सुधार बहुत ही संवेदनशील हैं मतभेद ध्यान केंद्रित करने और कलाकृतियों को पेश हो सकता है. इसके अलावा, वे एक अतिरिक्त छवि है, जो phototoxicity उत्पादन हो सकता है की आवश्यकता होती है.

एक मुद्दे के कम जब केवल निगरानी YFP उत्सर्जन, ध्यान में 24 भर कोशिकाओं रखने + समय चूक प्रयोग चुनौतीपूर्ण हो सकता है यद्यपि. ध्यान केंद्रित drifts से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि खुर्दबीनऔर पकवान पूर्व गरम है और कमरे में तापमान में उतार - चढ़ाव नहीं है. वैकल्पिक रूप से, एक autofocus प्रणाली है कि ट्रांसफ़ेक्ट जांच की इमेजिंग पर आधारित नहीं है का उपयोग करें.

पसंद है जो उद्देश्य का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से आवेदन पर निर्भर करता है. एक तेल आधारित उच्च एनए उद्देश्य इकट्ठा और अधिक प्रकाश देता वृद्धि हुई है संकल्प, लेकिन और अधिक संवेदनशील है परिवर्तनों को ध्यान केंद्रित करने और उच्च सामग्री setups में अव्यावहारिक है. हम एक अपेक्षाकृत उच्च एनए के साथ एक हवा उद्देश्य का उपयोग करने के लिए cytoplasmic या परमाणु झल्लाहट के अनुपात का अध्ययन करना पसंद करते हैं, और तेल उद्देश्यों NA उच्च का उपयोग केवल जब उच्च subcellular संकल्प की आवश्यकता है.

इस कागज फिल्म कोशिका चक्र है कि उपकरणों कि आमतौर पर कई जीवन विज्ञान शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं और केवल माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण के एक बेसल ज्ञान की आवश्यकता है का उपयोग करता है के माध्यम से झल्लाहट आधारित जांच करने के लिए एक सरल तरीका चर्चा है. अधिक विशेष विकल्प का उपयोग बीम splitters, प्रतिदीप्ति आजीवन एम शामिलicroscopy (Flim) 1 और सॉफ्टवेयर वस्तु विभाजन और 16 की गणना को स्वचालित 17 अनुपात झल्लाहट .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

लेखक स्वीडिश अनुसंधान परिषद, सामरिक अनुसंधान, स्वीडिश कैंसर समाज, स्वीडिश बच्चे कैंसर समाज, AKE Wibergs नींव और Jeanssons नींव के लिए स्वीडिश नींव द्वारा समर्थित हैं.

Materials: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz L-15, no phenol red GIBCO, by Life Technologies 21083-027
DMEM+Glutamax-I GIBCO, by Life Technologies 31966
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SV30160.03
0.05% Trypsin EDTA Hyclone SH30236.01
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14287
Puromycin Sigma-Aldrich P8833

References: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

  1. Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S.A., & Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474, (2011).
  2. Allen, M.D. & Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721, (2006).
  3. Kunkel, M.T., Ni, Q., Tsien, R.Y., Zhang, J., & Newton, A.C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
  4. Violin, J.D., Zhang, J., Tsien, R.Y., & Newton, A.C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J. Cell. Biol. 161, 899-909, (2003).
  5. Kunkel, M.T., Toker, A., Tsien, R.Y., & Newton, A.C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742, (2007).
  6. Harvey, C.D., et al. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269, (2008).
  7. Fosbrink, M., Aye-Han, N.N., Cheong, R., Levchenko, A., & Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464, (2010).
  8. Gavet, O. & Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543, (2010).
  9. Fuller, B.G., et al. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136, (2008).
  10. Ni, Q., Titov, D.V., & Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286,(2006).
  11. Morgan, D.O. The cell cycle : principles of control. Published by New Science Press in association with Oxford University Press, (2007).
  12. Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., & Medema, R.H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202, (2009).
  13. Gavet, O. & Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259, (2010).
  14. Macurek, L., et al. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123, (2008).
  15. van der Eb, A.J. & Graham, F.L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
  16. Lamprecht, M.R., Sabatini, D.M., & Carpenter, A.E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75, (2007).
  17. Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., & Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767, (2009).

Ask the Author: निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ

1 Comment

wheres reference 18 gone?

2

Reply

Posted by: chris kimberleyFebruary 8, 2012, 10:58 AM

The probe for Cdk1 activity is described in ref 8. The 1 from Cdk1 has jumped up by mistake. Sorry for missing this in the proofreading.

Arne

2.1

Reply

Posted by: Arne L.February 8, 2012, 4:14 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter