Overvågning kinase og fosfatasesæt aktiviteter gennem cellecyklus ved Ratiometrisk FRET

1. Introduktion sonden til celler

1. Co-transfect celler med en FRET-baseret sonde og et plasmid der giver resistens. Vælg et transfektion metode, der er effektiv i din celle-type af interesse. For U2OS celler, giver standarden calciumphosphat transfektion metoder tilfredsstillende resultater ^15.
2. Marker celler i passende antibiotika i mindst syv dage. Dette beriger mængden af ​​celler, der udtrykker sonden og begrænser mængden af ​​celler med giftige udtryk niveauer, eller udtryk niveauer, som er stærkt påvirke cellecyklus.
3. (Valgfrit) Vælg for stabil kloner.
4. Brug af faste eller levende celler, skal du kontrollere, at både den fælles fiskeripolitik og YFP er til stede i alle celler på omtrent samme forhold.
5. Hvis nogle celler kun indeholder den fælles fiskeripolitik eller YFP, har rekombination sandsynligvis fundet sted. Rekombination kan forekomme enten under bakteriel vækst eller efter transfektion af sonden og kan i sidstnævnte tilfælde afhænger af plasmid kvalitet. Gentag plasmid perstatning og linearisere plasmidet før transfektion, hvis problemet fortsætter.

2. Overvågning ratiometrisk FRET

1. Seed celler på glas bund retter, eller dækning glider til montering i et kammer. Sørg for, at tallerkener / dække sedler er ingen 1,5 (170 μm tyk).
2. Mount celler i vækst medie uden phenolrødt på en motoriseret epifluorescence mikroskop med temperaturen indstilles til 37 ° C. Sørg for pH-regulering af medier, enten ved CO ₂ eller ved hjælp af CO _{2-uafhængige} medier som Liebowitz-15.
3. Fokus på celler ved hjælp af transmitteret lys. Må ikke se på celler med fluorescerende lys.
4. Start med at erhverve en 12 eller 16 bit billedet ved hjælp af YFP magnetisering (YFPex) og YFP emission (YFPem) filtre og en passende dichroic spejl. Brug maksimal binning til rådighed, der stadig tillader den nødvendige subcellulære opløsning. Ved hjælp af en høj binning at reducere eksponeringen tid eller intensitet er afgørende at undgå fototoksicitet.
5. MigAsure eller estimere baggrunden intensiteten og den omtrentlige støj ved måling eller estimering af groft gennemsnit, minimum og maksimum pixelværdier i et område uden celler. Skift eksponeringstid og neutralfiltre således at den gennemsnitlige signalet i cellen er ca baggrunden intensiteten plus fem til ti gange forskellen mellem max og min baggrund intensiteter.
6. Kontroller, at billeder er ikke tæt på at være mættet. Den maksimale intensitet i billedet bør være mindre end halvdelen af ​​det dynamiske område (f.eks max 2000 i en 12 bit billede) at give mulighed for intensiteten forskelle, når celler ind mitose.
7. Gentag trin fra 2,4 til 2,6 ved hjælp af den fælles fiskeripolitik excitation og YFP emission filtre og en passende dichroic spejl.
8. Vælg flere regioner med transfekterede celler, bortset fra regionerne, der anvendes for punkt 2,4 til 2,7, og sikre, at maksimal intensitet er mindre end halvdelen af ​​det dynamiske område i alle celler.
9. Start en gang-lapse eksperiment erhverve to billeder hver 45 min hjælp YFPex - YFPem og CFPex - YFPem filter sæt.

3. Kontrol og optimering af betingelser

1. Åbn den erhvervede billeder og overvåge cellecyklus tid fra mitose til mitose for celler, der udtrykker transfekteret sonden.
2. Sammenlign den målte cellecyklus tid til offentliggjorte data for cellen anvendte type. Alternativt, film untransfected celler ved at erhverve et billede af transmitteret lys kun (f.eks DIC eller fase-kontrast) hver time for at få reference celle cyklustider.
3. I tilfælde af tiden fra mitose til mitose svarer til reference celle cyklus tider, skal du fortsætte til trin 4. Alternativt kan generhverve billeder ved hjælp af hårdere eksponering, mere tid-point eller flere Z-niveauer, og gentag trin 3.
4. I tilfælde af tiden fra mitose til mitose ikke svarer til reference celle cyklus tider, film transfekterede celler ved at erhverve et billede af transmitteret lys kun (f.eks DIC eller fase-kontrast) hver time efterfulgt af et billede i slutningenaf forsøget på at identificere transfekterede celler.
5. Hvis transfekterede celler viser stadig længere cellecyklus gange, skal du gentage trin 1, men transfect mindre sonde, eller vælg for stabile kloner, der indeholder meget små mængder af sonden.
6. Hvis transfekterede celler vise normale cellecyklus gange i mangel af fluorescerende lys, skal du gentage trin 2, men lavere eksponering ved at ændre binning, neutralfiltre, eksponeringstid, og tiden mellem billeder.

4. Analyse FRET

1. Analysen kan udføres af de fleste software dedikeret til mikroskopi. Her beskriver vi, hvordan du udfører analysen ved hjælp af freeware ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) at udnytte de plugin Ratio Plus ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html ).
2. Åbn billeder i ImageJ. Hvis dine billeder er i formatet af et flerfarvet stack (f.eks Deltavision), adskilte de enkelte kanaler ved først at konvertere dem til en hyperstack: Image-hyperstack-stack til hyperstack og efterfølgende dele dem til enkelt kanal stakke med: Image-hyperstack-reducerer dimensionalitet
3. Multiplicer YFPex - YFPem stak med 3 ved hjælp af: Proces-Matematik-Multiply Dette trin er valgfrit, da det kun er hensigten at øge den visuelle klarhed i de billeder ved at sikre, at nøgletallene ikke er i intervallet mellem 0 og 1.
4. I YFPex - YFPem stack, tegne en region of interest (ROI) i et område, der er blottet for celler, men det er tæt på en celle, der skal måles. Forskellige celler i det samme billede kan kræve forskellige regioner, som både baggrund og signal intensitet typisk er stærkest i centrum af et billede.
5. Tilføj ROI til ROI Manager: Analyser-tools-ROI manager.
6. Mål den gennemsnitlige intensitet af ROI i både YFPex - YFPem og CFPex - YFPem stack: Analyser-Mål
7. Gentag på forskellige tidspunkter, og kontrollere, at baggrunden intensiteter tæt på cellen af ​​interesse bliver ens i hele filmen.
8. Indstil målinger til også at omfatte minimal intensitet: Analyser-Set målinger-Min og Max grå værdi.
9. Tegn et område af interesse, der dækker det meste af en celle og måle den minimale intensitet i både YFPex - YFPem og CFPex - YFPem stakken. Tag forskellen mellem den målte minimale intensitet og baggrunden intensitet fra 4,6 og dividere det med to. Dette giver et udgangspunkt estimat for en klipning værdi.
10. Åbn Ratio Plus. Vælg YFPex - YFPem og CFPex - YFPem stakken. For FRET ratio, skal du vælge CFPex - YFPem som stak 1 for inverteret FRET forholdet visualisere sonder, hvor FRET effektiviteten falder på fosforylering, vælg YFPex - YFPem som stak 1.
11. Indsæt den målte baggrunden intensiteter og klipning værdier.
12. Indstil skalering af den resulterende forholdet stakken og anvende et passende udseende up tabel (LUT) til at visualisere forholdet ændringer.

5. Repræsentative resultater

Plk1 aktivitet er første synlige i kernen i G2 fase og topper under mitosen. Figur 3 viser et eksperiment ved hjælp minimal fototoksicitet indstillingerne som beskrevet i afsnit 2. Bemærk, at dette er et repræsentativt første resultat, og at forhold eller tid mellem billeder kan ændres for at øge signal støjforhold eller tidsmæssige opløsning. Figur 3D viser, at et flertal af de celler, der udtrykker sonden formere sig med en celle cyklus på mellem 20 og 25 timer, der angiver, at de billeddiagnostiske betingelser og udtryk niveauer af sonden ikke påvirker cellecyklus tider. Selv om der er betydelig støj, tendensen til Plk1 aktivitet stiger i G2 og toppede i mitosen ¹⁴ er klart synlige (fig. 3A). Behandling af rå data, her ved betyder filtrering præsenteret som en kymograph (fig. 3B), eller kvantificering af den gennemsnitlige omvendt ra Tio (fig. 3C) kan forbedre klarhed.

Figur 1. Princip af en FRET-baseret sonde til at overvåge kinase og phosphatase aktiviteter. To fluorophores, typisk den fælles fiskeripolitik (blå) og YFP (grøn), der er forbundet med en fosfor-bindende domæne (orange) og en phosphorylatable sekvens (gul). Fosforylering (rød) medierer binding til fosfor-bindende domæne, hvilket forårsager en konformationelle ændring i sonden. Den konformationelle ændring medfører en forskel i den afstand eller orientering mellem de to fluorophores, som påvirker FRET effektivitet mellem fælles fiskeripolitik og YFP. FRET kan visualiseres af spændende fælles fiskeripolitik og overvågning YFP emission (stiplede linjer).

Figur 2. Skematisk oversigt over den eksperimentelle procedure.

p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
Figur 3. Plk1 aktivitet er første synlige i kernen i G2 fase og topper under mitosen. U2OS celler udtrykker en FRET-baseret sonde overvågning Plk1 aktivitet ^9,14 blev filmet i 60 timers hjælp af en Deltavision Spectris Imaging systemet er udstyret med en 20x NA 0,7 luften mål og en kviksølvlampe. Imaging betingelser var udvalgt til at forårsage minimal fototoksicitet, som skitseret i afsnit 2, ved hjælp af 4x binning og neutral tæthed filtre, der blokerer 99% af den indkommende lys. A, falske farver repræsentation af omvendt FRET-ratio, efter en celle med 4 divisioner. B, kymograph af cellen er vist i A efter anvendelse af en gennemsnitlig filter. C, kvantificering af den omvendte FRET forholdet mellem cellen vist i A. D, kumulative mitotiske optagelse af 50 FRET-sonde udtrykker celler, herunder afdelinger af datterceller.

Overvågning FRET hele cellecyklus kræver overvejelser, der er mindre afgørende ved vurderingen af ​​kortfristede reaktioner på eksterne stimuli. Først er cellecyklus progression nemt forstyrres af stress signalering, der kræver, at fototoksicitet holdes på et minimum. For det andet kan alle journalister potentielt påvirke cellulære processer ved titrering ud kinaser, fosfataser eller interaktion domæner. Den nok mest ligefremme måde at vurdere, om de eksperimentelle betingelser er passende, er, at måle cellecyklus længde fra mitose til mitose og sammenligne det med eksperimenter uafhængigt af fluorescens billedbehandling og udtryk for en sonde.

En afgørende faktor i forbindelse med overvågningen FRET nøgletal gennem hele cellecyklus er til at modstå fristelsen til at erhverve flotte billeder med høj opløsning. Selv om de nøjagtige indstillinger afhænger af følsomheden af ​​mikroskopet systemet og udtryk omfanget og arten af ​​den pågældende sonde, er det vigtigt at brugeet niveau af binning, der svarer til, hvad der er absolut nødvendigt at se. Selv om tiden mellem CFPex - YFPem og YFPex - YFPem billeder skal være kort for at undgå ændringer i celle morfologi, i vores hænder er det bedre at holde eksponering gange på mere end 0,1 sekunder og reducerer intensiteten af ​​det fluorescerende lys fra neutralfiltre .

Hvordan fototoksicitet påvirker cellecyklus afhænger i høj grad udtryk niveauer og lokalisering af sonden. En sonde, der er lokaliseret til kromatin, for eksempel ved fusion med en histon, gør cellerne mere følsomme over for fluorescerende lys, formentlig fordi fototoksisk biprodukter er skabt i nærheden af ​​DNA. Det er derfor afgørende at overvåge celler, der udtrykker relativt lave niveauer af reportere og at re-check celle-cycle timings hvis lokalisere sondens forskellige subcellulære strukturer.

Adskillige kontrol eksperimenter er nødvendige for at kontrollere, at FRET er til stede ieksperimentel opstilling, og at forholdet mellem ændringer afspejler faktiske fosforylering af en sonde. Bortset funktionelle kontroller, såsom hæmning eller udtømning af en kinase, er det tilrådeligt at udføre biokemiske eksperimenter for at kontrollere, at sonden er fosforyleret, mutation af den forventede fosfor-acceptor websted inden sonden til en ikke-phosphorylatable rester, og acceptor fotoblegning til bevise forekomsten af ​​FRET. For et eksempel på en omfattende validering, se supplerende figur 3 i ref 14.

Selvom det er teoretisk at foretrække at vurdere FRET ændringer ved at overvåge både den fælles fiskeripolitik og YFP emission, er sådanne setups meget følsomme over for at fokusere ændringer og belysning betingelser og kan let føre til artefakter. Følsomhed for at fokusere ændringer skyldes kromatisk aberration, hvor den fælles fiskeripolitik og YFP emission ikke fokuserer på det samme punkt. Illumination ændringer afhænger i vid udstrækning på forskellige tilpasning af lyset stien. Dette er særligt fremtrædende, når du bruger filter kuber indeholderEn dichroic spejl. Fokus og belysning forandringer kan reduceres ved hjælp korrigeres mål og omhyggeligt tilpasset filter terninger. Men i vores erfaring, giver holde emission filterkonstant overlegne resultater, helst ved hjælp af en opsætning med separat styring af excitation og emission filtre.

Omfanget af de observerede FRET-change er reduceret med bleedthrough fra fælles fiskeripolitik fluorescens til YFP emission filter. I tilfælde bleedthrough er betydelig, en ekstra CFPex - CFPem billede kan erhverves for at rette bleedthrough i CFPex - YFPem billede. Men sådanne rettelser er meget følsomme over til at fokusere forskelle og kan indføre artefakter. Desuden kræver de et ekstra billede, som kan producere fototoksicitet.

Selvom mindre af et problem, når der kun overvågning YFP emission, holder cellerne i fokus i løbet af et 24 + time-lapse eksperiment kan være udfordrende. For at undgå fokus driver, skal du sørge for, at mikroskopetog parabol er forvarmet, og at temperaturen i rummet ikke svinge. Alternativt kan du bruge et autofokus system, der ikke er baseret på billeder af transfekteret sonden.

Valget af hvilket mål at bruge, afhænger af den enkelte ansøgning. En olie-baserede high NA objektiv samler mere lys og giver højere opløsning, men er mere følsomme over for fokus forandringer og er upraktisk i høj-indhold opsætninger. Vi foretrækker at bruge en luft mål med en relativ høj NA for at studere cytoplasmisk eller nukleare FRET-nøgletal, og bruge en høj NA olie mål kun når højere subcellulære opløsning er påkrævet.

Denne artikel diskuterer en enkel metode til at filme FRET-baseret sonder gennem cellecyklus, der bruger udstyr, der er almindeligt tilgængelige for mange life science forskere og kræver kun en basal viden om mikroskopi og billedbehandling. Mere specialiserede alternativer omfatter brugen af ​​beam-splittere, Fluorescens Lifetime Microscopy (Flim) ¹ og software til at automatisere objekt segmentering ¹⁶ og beregning af FRET forholdet ^17.