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 JoVE Biology

Scale-Up de la culture des cellules de mammifères en utilisant un nouveau flacon multicouches

1, 1, 1, 1, 1, 1

1BD Biosciences

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Cellules jouent un rôle déterminant et croissant dans la recherche et la découverte et le développement de nouvelles thérapeutiques. Avec ce besoin croissant de plus grand nombre de cellules, nous devons trouver des moyens plus efficaces et plus efficace pour cultiver et récolter les cellules de fixation à charge. Un flacon multicouche avec les bonnes caractéristiques peuvent servir à cette fin.

    Date Published: 12/05/2011, Issue 58; doi: 10.3791/3418

    Cite this Article

    Abraham, E. J., Slater, K. A., Sanyal, S., Linehan, K., Flaherty, P. M., Qian, S. Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask. J. Vis. Exp. (58), e3418, doi:10.3791/3418 (2011).

    Abstract

    Un nombre croissant d'applications basées sur les cellules nécessitent un grand nombre de cellules. L'utilisation de simple couche t-flacons, qui sont adéquates lors de l'expansion à petite échelle, peut devenir lourd, laborieux et fastidieux lorsque de grands nombres de cellules sont nécessaires. Pour répondre à ce besoin, la performance d'un nouveau multi-couches récipient de culture cellulaire afin de faciliter l'échelle facile de cellules à partir couches simples flacons T sera discutée. Les flacons testés sont disponibles en 3 - et 5-couche de format et de permettre la récupération complète de la culture et de trois à cinq fois le nombre de cellules, respectivement, par rapport à T-175 flacons. Une caractéristique clé de la BD Multi-Ballon est un port de mix / équilibration qui permet rapidement en cuve de mélange ainsi que la distribution uniforme des cellules et des réactifs au sein et entre les couches de chaque navire et produire constamment des cellules qui peuvent être cultivées dans un milieu qui est congru à T-175 flacons.

    La conception de ces flacons multi-c permet également del'accès pipette onvenient pour l'ajout de réactifs et de cellules directement dans les flacons ainsi que la récupération efficace des cellules précieuses et des réactifs et réduit les risques de contamination due à la coulée. Pour les applications où versant est préféré au pipetage, la conception permet de rétention de liquide résiduelle minimale afin de réduire le gaspillage de précieuses cellules et des réactifs.

    Protocol

    1. Protocole d'utilisation multi-Flacons pour culture cellulaire

    1. Préparation des bateaux et l'ajout de suspension cellulaire
      1. Préparer le milieu de croissance cellulaire, au besoin.
      2. Line up multi-Flacon verticalement sur le côté avec le bouchon vers le haut sur la surface de travail (stérile hotte à flux laminaire).
        1. Ces flacons sont disponibles en 3 et 5 couches de formats et d'utiliser un même modèle de flux de travail comme un flacon T-175.
      3. Desserrer et enlever les bouchons. Ajouter la quantité requise de pré-chauffé moyennes dans la fiole à l'aide d'une pipette de 50 ou 100 ml ou en versant.
        1. Pipettes qui sont ≤ 10 ml peut atteindre le fond de la cuve lorsque Multi-flacons sont placés verticalement avec bouchon vers le haut. Pipettes ≥ 10 ml peut atteindre dans le navire immédiatement passé le logo sur le flacon multi-, fournissant ainsi un portail pratique pour ajouter de plus grands volumes de médias à la cuve.
      4. Pour éviter des bulles moyennes, permettent flux de liquide vers le FLomment le long de la paroi intérieure du couvercle multi-Flacon (logo-côté).
      5. Ajouter suspension cellulaire provenant d'un stock de cellules concentrées dans un milieu de croissance à travers la couche supérieure en utilisant une pipette de 10 ml et flacons en casquette.

        Conseils:

        - Transport multi-flacons sur un panier sur le site incubateur et effectuez les étapes restantes.
        - La densité de semis de cellules varie en fonction du type cellulaire, le milieu et la nécessité durée de culture. Commencez avec la densité de semis et de volume de support à celle utilisée dans la norme T-175 flacons et multiplier par 3 ou 5 selon le Flacon multi-format utilisé.

    2. Le mélange des cellules
      1. Mélanger position: tenir le ballon multi-debout avec le logo en face de vous et tournez dans le sens antihoraire à un angle de 45 ° avec le port en face de vous mélanger.
      2. Tenir le même angle, doucement basculer Multi-Ballon d'avant en arrière (cou loin de vous) jusqu'à ce liquide dans la couche supérieure draine entièrement downwarDS via le port mix. Pivot sur le mix à bâbord.
      3. De même, secouez légèrement Multi-Ballon d'arrière en avant (cou vers vous) jusqu'au support des drains pleinement de la couche du bas vers le haut à travers le port mix. Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 une fois de plus pour assurer un mélange adéquat.
      4. Apportez Multi-Flacon en position mélanger (étape 1.2.1) et passez à l'étape 1.3
      5. Alternativement, la suspension de cellules peuvent être préparés à l'extérieur du flacon multi-et la suspension cellulaire peut être ajouté dans la cuve à l'aide d'une pipette ou par douce coulée.
        1. Port de Mix permet en cuve de mélange de cellules avec les médias et élimine le besoin de faire de gros volumes de suspensions cellulaires à l'extérieur.
        2. Il permet également d'égalisation des médias à travers les couches de la fiole multi-
    3. L'équilibrage des fluides
      1. Après le mélange / ajout de la suspension cellulaire, lieu multi-Flacon verticalement sur une surface plane pour égaliser le volume de liquide équationlly dans toutes les couches.
    4. Partition de liquide dans chaque couche
      1. Tenir le ballon multi-avec le logo en face de vous et tournez à un angle de 45 ° à la partition du liquide dans chacune des couches.

        Astuce:

        - Pour de meilleurs résultats, il est important d'utiliser une surface de travail plane pour les étapes 1.3 à 1.4

    5. Transport
      1. Une fois que les médias contenant des cellules en suspension est partitionné, le transport multi-ballon à 45 ° d'angle mêmes (sens horaire) comme à l'étape 1.4.1 avec les médias loin du port mélanger dans l'incubateur. Cette position est également adapté pour retirer des flacons de l'incubateur pour une visualisation sur un microscope.
    6. Placer Multi-Flask sur incubateur étagères
      1. Tenir Multi-ballon à l'angle de 45 ° (sens horaire, loin de mix-port), doucement pivoter à l'horizontale sur la surface incubateur (en utilisant le coin loin du port comme un mélange depivot). Lay Multi-Ballon avec le logo vers le haut.
        1. Falcon multi-Flacon de conception permet aux navires d'être empilés et les maintient en place par une nervure robustes empilage.
    7. Distribution des cellules et des réactifs
      1. Après avoir placé multi-Flacon à plat sur une surface de travail, doucement d'avant en arrière et de côté à côté pour distribuer uniformément sur les surfaces des cellules de culture en prenant soin de ne pas renverser de liquide de chaque couche. Pile flacons.
        1. Ce flacon est faite d'un matériau optiquement clair et cellules sur la dernière couche peut être facilement visualisées sur un microscope.
    8. Media Exchange
      1. Aspirer tout en inclinant le flacon multi-vers la gauche (mix à bâbord) avec le logo en face de vous.
      2. Puis tilt, le ballon multi-vers la droite, en continuant d'aspirer tous les médias résiduelle.
      3. Ajouter la quantité appropriée de médias et de suivre les étapes 01/03 au 01/07

    2.Récolte des cellules de Multi-Flacons

    1. Pour dissocier les cellules, jusqu'à la ligne Multi-flacons à la verticale et amener chacun à Mix position (étape 1.2.1). Retourner doucement flacons avec col en face de vous, afin de permettre aux médias de vidange pour la couche supérieure de Multi-Flask.
    2. Insérez un 5 ou 10 ml pointe de l'aspiration par le cou jusqu'à ce que vous atteignez le niveau de liquide près du port mix. Aspirer moyennes épuisées.
    3. Ajouter la dissociation réactif / tampon de lavage et amener à la position Mix comme dans l'étape 1.2.1, passez et suivez les étapes 1.3 à 1.7. Neutraliser avec un milieu de croissance / agent neutralisant et versez la suspension cellulaire dans un tube de réception ou d'inverser flacon tels que les cellules de vidange pour la couche supérieure de la cuve et de recueillir des cellules à l'aide d'une pipette de 10 mL.

      Astuce: Pour améliorer la récupération des cellules ou des réactifs, mettre Multi-ballon pour bien mélanger la position (étape 1.2.1), inverser avec le cou vers l'opérateur pour permettre un drainage complet de supports d'al couches l pour la couche supérieure. Ensuite, l'inclinaison multi-Flask le sens horaire pour 45 ° d'angle (loin du port mix) tandis que le flacon multi-reste inversé. Utiliser une pipette (1-10 ml) pour collecter les réactifs restants.

    3. Recommandée de volume de travail dans Falcon multi-flacons

    Les milieux de croissance

    3-couche: 75 à 150 mL par flacon multi-
    5-couche: 125-250 mL par flacon multi-

    La dissociation d'agent

    3-Layer: ≥ 15 ml par flacon multi-
    5-Layer: ≥ 25 ml par flacon multi-

    Astuce: Commencez avec un volume moyen utilisé dans la norme T-175 flacons et multiplier par 3 ou 5 fois selon le Flacon multi-format évaluées afin que mL par unité de surface reste la même.

    4. Les résultats représentatifs:

    1. Conception de Falcon multi-Flacon

    files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
    . Figure 1: Multi-Flacon de culture cellulaire bateaux sont disponibles dans une 3 - et 5-couche de forme empilables pour mise à l'échelle de cellules fournissant 525 et 875 cm 2 de surface de croissance, respectivement. Pipette d'accès facilite ajout et la suppression des cellules et des réactifs dans et hors du navire. Présence du mix-port permet rapidement en cuve de mélange et d'égalisation des médias à travers toutes les couches de la fiole multi-.

    2. Rendement cellulaire en utilisant Multi-Flacon:

    Ces vaisseaux sont disponibles en 3 couches et 5 couches formats qui correspondent aux 3 et 5 fois la surface de la T-175 flacons. En conséquence, ≥ 3 et 5 fois (130 ± 6,8 x 10 6 et 218 ± 23,6 x 10 6 cellules, respectivement) le nombre de cellules BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cellules ont été cultivées et récupéré de Multi-Flask par rapport à T-175 flacons (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellules; Fig.2a). Le rendement par cellule unit surface était équivalente dans les 3 - et 5-couche multi-flacons et T-175 flacons pour BHK-21, LNCaP (ligne de la prostate humaine de cellules d'adénocarcinome), Hep-G2 (lignée cellulaire humaine hépatocarcinome), Ecopack 2-293 (humaines lignée cellulaire de rein) cultivés pendant une période de 48-96h (Fig.2b) dans les milieux de croissance (35 ml par couche) comme recommandé par le fournisseur de cellulaire (ATCC, Sigma et / ou Clontech). Les cellules ont été dénombrées sur un système automatisé de Vi-CELL contre (1).

    Figure 2A
    Figure 2A: trois et cinq fois le nombre de cellules BHK-21 ont été cultivées et récupérées à partir de 3 - et 5-couche multi-flacons par rapport à T-175 flacons. Rendement attendu a été déterminé en utilisant le rendement moyen des cellules de contrôle T-175 flacons multiplié par trois et cinq fois pour les 3 - et 5-couche multi-flacons respectivement (n = 4 flacons / format).

    Figure 2B
    Figure 2B>: le rendement de cellules par cm 2 a été équivalente dans les 3 - et 5-couche multi-flacons et T-175 flacons pour BHK-21, LNCaP, HepG2 et EcoPack2-293 cellules. Chaque barre représente dire de 4 à 6 flacons. Cellules BHK-21 (11000 cellules/cm2) ont été cultivées pendant 72 heures, les cellules LNCaP (20000 cellules/cm2) et EcoPack2-293 cellules (~ 35 000 cellules/cm2) ont été cultivées pendant 96 heures et les cellules HepG2 (25.000 cellules / cm 2 ) ont été cultivées pendant 48 heures avant la récolte.

    3. Distribution de médias parmi les couches de Multi-Ballon

    Milieu de culture cellulaire (DMEM; Invitrogen) a été ajouté à cinq couches multi-flacons (250 navires mL/5-layer) et partitionné en couches selon le protocole décrit ci-dessus. La distribution des médias a été mesurée par forage de trous dans chaque couche et des médias pompée à partir des couches individuelles. Poids du liquide récupéré de chaque couche a été jugée relativement uniforme d'une couche à tel qu'illustré à la figure 3. Ils sont comme suit: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (GM).

    Figure 3
    Figure 3. Uniforme de distribution des médias dans chacun des cinq couches d'une couche de 5-Multi-Ballon. Milieu de culture cellulaire a été ajouté à multi-flacons (250 navires ml/5-layer), équilibrée et cloisonné à des couches individuelles. Les médias a été pompé à travers des trous percés dans les couches individuelles et le poids du liquide a été enregistré à partir de chaque couche (n = 6 flacons).

    Distribution de la cellule 4. Entre des couches de Multi-Ballon

    Les cellules peuvent être ajoutés et mélangés dans le flacon multi-. Nous distribution simulée des cellules entre les couches de Multi-Flacon en utilisant des perles (10 microns; Polysciences Inc) de taille similaire aux cellules. Suspension de billes a été ajouté dans la cuve Flacon multi-aide d'une pipette de 10 mL à travers la couche supérieure et mélangé avec les médias dans le navire comme described dans le protocole ci-dessus. La distribution de billes a été mesuré par des trous de forage dans chaque couche et fluide contenant suspension de billes a été pompée à partir des couches individuelles. La concentration de billes récupérer auprès de chaque couche a été lue sur un compteur Coulter et enregistrées. Ci-dessous sont équivalentes inter-couches distributions billes en 3 couches multi-flacons (fig.4a). Le mix-port permet une répartition homogène de cellules et de réactifs entre les multi-couches Flask.

    Figure 4A
    Figure 4A: la distribution de billes dans chacune des trois couches d'une couche de 3-Multi-Ballon. Une suspension de perles (3,6 x10 6 / ml) a été ajouté au milieu distribué dans multi-flacons (suspension de billes: le volume des médias est de 1:10, vol: vol) et mixte, suivie d'équilibration et les étapes partition en utilisant le protocole décrit. La concentration de billes récupérer auprès de chaque couche (moyenne pompée à travers des trous percés sur chaque couche) a été lue sur un comte CoulterER et enregistrées. Ci-dessous sont équivalentes inter-couches distributions de billes dans 3 - la couche multi-flacons (n ​​= 5 flacons)

    Ci-dessous sont des images représentatives de schémas Ecopack coloration 2-293 de cellules cultivées à confluence> 80% sur le 3-couche multi-flacons dans les milieux de croissance complété. Monocouches de cellules ont été fixées et colorées avec du cristal violet et multi-couches Flask ont ensuite été coupées et les images numérisées (2). Structuration des cellules Remarque, a été homogène sur toutes les couches de Multi-Flacon (Fig.4B). Des résultats similaires ont été obtenus avec plusieurs types de cellules évalués (données non présentées).

    La figure 4B
    Figure 4B: Cette figure illustre la croissance des cellules homogènes entre les couches de la multi-flacons. Ecopack-2-293 cellules cultivées jusqu'à confluence> 80% en 3 couches multi-flacons et T-175 ont été fixées et colorées avec du cristal violet. Multi-Flacon navires ont été coupées et chaque couche teinté a été scannée.

    5 d'alimentation en air de Multi-Flask.:

    Analyse des médias consacré à l'utilisation BioProfile FLEX analyseur (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 cellules cultivées pendant 96 heures n'a révélé aucune différence dans la saturation de l'air des cellules cultivées en 5 couches multi-Flacons vs T-175 flacons (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambiante O 2).

    Figure 5
    Figure 5: Air saturation (% ambiante O 2) des médias a passé étaient similaires dans les médias pré-mélangés de 5 couches multi-Flacons vs T-175 flacons. EcoPack2-293 cellules ont été ensemencées à une densité de 35000 cellules / cm 2 et cultivées pendant 96 heures avant l'analyse des médias (n = 3 flacons).

    Discussion

    L'étude actuelle démontre l'augmentation de la productivité que la conception du flacon multi-offre aux chercheurs. S'il est important de suivre les étapes décrites ci-dessus pour des performances optimales lors de l'utilisation multi-flacons, il ya quelques étapes cruciales dans ce protocole qui sont jugées les plus essentielles. Il s'agit notamment (i) le mélange de cellules et de réactifs en utilisant le port mélange dans la cuve (ii) en transportant Multi-ballon à un angle de 45 ° vers la droite après un partitionnement de liquide dans chacune des couches (iii) la pose multi-plates Flacon après partitionnement dans le incubateur.

    L'utilisation appropriée de Multi-Flacon conduit à la production d'une population cellulaire homogène au sein de chaque navire qui est cultivée dans un milieu qui est congru à T-175 flacons (5). Ces navires offrent des cellules 3 et 5 fois plus dans un encombrement similaire à celui du flacon T-175. La cuve 3 et 5-couche fournit 525 et 875cm 2 de surface de croissance, respectivement, et offrent à la fois l'espace et du travail savings aux utilisateurs. Le traitement de surface de culture de tissus est comparable à fioles étalons permettant ainsi mise à l'échelle sans avoir besoin de re-optimiser les conditions de culture existantes ou compromettre la qualité, l'homogénéité ou la performance des cellules (6, 7). Cela fournit également des fins de comparabilité avec les données déjà collectées. Ces navires peuvent être également revêtues avec des réactifs tels que le collagène, la fibronectine, la poly-D-lysine pour fournir un substrat spécialisé pour l'attachement, la croissance et la différenciation de certains types cellulaires comme les hépatocytes 8, 9 kertainocytes, les cellules souches cultivées dans un milieu sans sérum formulations. Solutions de revêtement peut être enlevé avec une rétention de liquide résiduelle minimale afin de réduire le gaspillage de précieux réactifs ainsi que l'élimination effective de la solution de revêtement avant la culture de cellules. Le volume optimal recommandé de médias pour des cellules en culture dans des flacons multi-gamme de 0.142 à 0,287 ml / cm 2, qui se traduisent par 25-50 ml par couche. Contrairement à un autre flacon multicouche, tson produit offre un mélange-port dans la cuve qui permet rapidement en cuve de mélange ainsi que la distribution uniforme des cellules et des réactifs au sein et entre les couches de chaque navire. Lignées cellulaires, cultures primaires et les cellules souches ont été élargis de manière efficace à l'aide multi-flacons. Ces navires sont particulièrement avantageux dans les applications qui exigent un grand nombre de cellules comme dans un haut débit de dépistage, la production de vaccins, transfections de vecteurs viraux et de thérapie cellulaire.

    Gain de temps, d'espace, le travail et la production de déchets réduits sont les gains clés de la fiole multi-versus cultures conventionnelles en une seule couche navires. Nous pouvons la culture d'environ trois fois le nombre de cellules récoltées à partir de 5, T-175 flacons dans le même espace en utilisant 3, 5-couche multi-flacons. Cet avantage en gain d'espace n'est pas limité seulement à T-175, mais peut aussi être étendue à d'autres navires: un appareil à rouleaux standard bouteille qui s'inscrit dans les incubateurs de laboratoire communs maisons ~ 4 rolbouteilles LER (2200 ml) dont chacune fournit 850cm 2 de surface. Dans la même région, ~ 20, 5-couche multi-flacons peuvent être hébergés offrant ainsi cinq fois la surface de croissance pour les cellules de culture. En outre, avec une augmentation de la «Allez-vert" de sensibilisation, des options pour réduire la production de déchets est hautement souhaitable. À cet égard, il ya un 38% (5, T-175 flacons pèse 640g ~ alors que l'on, à 5 couches multi-Flacon pèse ~ 400g) diminution de la production de déchets à l'aide multi-flacons par rapport à T-175 flacons et ces avantages se traduisent par à diminuer dans le stockage des déchets et les coûts d'élimination et de traduire par des économies pour l'utilisateur.

    Disclosures

    Tous les auteurs sont des employés de Becton Dickinson, segment Biosciences, Discovery Labware Unité.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 BD Biosciences 353143
    5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 BD Biosciences 353144
    100ml pipette BD Biosciences 357600
    10 ml pipette BD Biosciences 357551
    5 ml aspirating pipette BD Biosciences 357501
    50 ml Polypropylene conical tube BD Biosciences 352070
    T-175 flask Tissue Culture-treated BD Biosciences 353028
    Gram Crystal Violet BD Biosciences 212525
    DMEM Invitrogen 11885
    GMEM Sigma-Aldrich G5154
    RPMI-1640 ATCC 30-2001
    MEM ATCC 30-2003
    Trypsin-EDTA Lonza Inc. CC-5012
    Fetal Bovine serum Invitrogen 16000-044
    Tryptose Phosphate Broth Sigma-Aldrich T8159
    BHK-21 cells Sigma-Aldrich 85011433
    Hep-G2, LnCAP ATCC
    Ecopack 2-293 Clontech Laboratories
    Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
    Polystyrene Bead Polysciences, Inc. 24628-20
    Bio-Profile Flex Analyzer Nova BioMedical

    References

    1. Szabo, S.E., Monroe, S.L., Fiorino, S., Bitzan, J., & Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109 (2004).
    2. Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487 (1989).
    3. Sengupta, N., Rose, S.T., & Morgan, J.A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83 (2010).
    4. Zhu, M.M., Goyal, A., Rank, D.L., & Gupta, S.K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
    5. Ryan, J.M., Sharf, B.B., & Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res 91, 389 (2004).
    6. Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
    7. Sanyal, S., Abraham, E.J, Slater, K., Cai A., Lacey B., Hartshorn C., Flaherty, P., McHugh B., & Qian S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
    8. DiPersio, C.M., Jackson, D.A., & Zaret, K.S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405 (1991).
    9. Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F.M., Fassler, R., Brakebusch, W.S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303 (2002).

    Comments

    2 Comments

    The video did not display. Sound was fine.
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 1, 2012, 4:53 PM

    The video and sound did not run.
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 20, 2012, 8:30 AM

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