Scale-Up של תרבית תאים היונקים באמצעות Flask multilayered חדש

Abraham, E. J., Slater, K. A., Sanyal, S., Linehan, K., Flaherty, P. M., Qian, S. Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask. J. Vis. Exp. (58), e3418, doi:10.3791/3418 (2011).

מספר גדל והולך של יישומים מבוססי תאים דורשים מספר גדול של תאים. שכבה אחת של שימוש T-צלוחיות, כי הם נאותים במהלך התרחבות בקנה מידה קטן, עשוי להיות מסורבל, מייגע זמן רב כאשר מספר גדול של תאים נדרשים. כדי לענות על הצורך הזה, את הביצועים של כלי תרבות חדשה רב שכבתית התא כדי להקל על סולם קל של תאים מן מרובד אחד T-צלוחיות יידונו. צלוחיות שנבדקו זמינים 3 - 5 ו - שכבתיים בפורמט ולאפשר תרבות התאוששות מלאה של שלוש עד חמש פעמים את מספר התאים בהתאמה, בהשוואה ל T-175 צלוחיות. תכונה מרכזית של Flask Multi-BD הוא נמל לערבב / איזון המאפשר מהירה, כלי ערבוב וכן התפלגות אחידה של תאים ריאגנטים בתוך ובין שכבות של כלי כל עקבי לייצר תאים שיכולים להיות מתורבת בסביבה הוא חופף ל-T-175 צלוחיות.

העיצוב של אלה Multi-צלוחיות גם מאפשר גגישה פיפטה onvenient להוספת ריאגנטים ותאי ישירות לתוך צלוחיות כמו גם התאוששות יעילה של תאים ריאגנטים ערך מפחיתה את הסיכון של זיהום עקב שוטף. עבור יישומים בהם לשפוך היא המועדפת על pipetting, העיצוב מאפשר שמירה מינימלית נוזל שיורי כדי לצמצם בזבוז של תאים ריאגנטים יקר.

1. פרוטוקול להשתמש Multi-צלוחיות של תרבית תאים

1. הכנת כלי והוספת ההשעיה תא
   1. הכן צמיחה בינוני התא לפי הצורך.
   2. הקו עד Multi-Flask במאונך על צדה עם הכובע כלפי מעלה על משטח העבודה (ברדס סטרילי זרימה למינרית).
      1. צלוחיות אלו זמינים 3 ו -5 שכבות פורמטים להשתמש דפוס דומה לעבודה זרימה כמו בקבוק T-175.
   3. שחרר ולהסיר כובעים. הוסף את הכמות הנדרשת של אמצעי טרום חימם לתוך בקבוק בעזרת פיפטה 50 מ"ל או 100 או על ידי שפיכת.
      1. Pipettes כי הם ≤ 10 מ"ל יכולים להגיע לתחתית הכלי כאשר Multi-צלוחיות ממוקמים אנכית עם הכובע כלפי מעלה. Pipettes ≥ 10 מ"ל יכולים להגיע אל כלי השיט מיד בעבר הלוגו על Flask רב, ובכך מתן פורטל נוח להוסיף כמויות גדולות של כלי התקשורת.
   4. כדי להימנע מבעבע של המדיום, לאפשר זרם נוזל flow לאורך הקיר הפנימי של המכסה Multi-הבקבוק (לוגו בצד).
   5. הוסף ההשעיה תא ממלאי תא מרוכז לתוך מדיום הגידול דרך השכבה העליונה בעזרת פיפטה 10 מ"ל ו צלוחיות כובע.

      טיפים:

      - תחבורה Multi-צלוחיות על עגלה לאתר החממה לבצע השלבים הנותרים.
      - צפיפות זריעה תא ישתנו בהתאם לסוג התא, בינוני משך צורך תרבות. בגין עם צפיפות זריעה נפח התקשורת המשמש בתקן T-175 צלוחיות ולהתרבות על ידי 3 או 5, תלוי Flask Multi-הפורמט המשמש.

2. ערבוב של תאים
   1. מערבבים עמדה: החזק את הבקבוק Multi-זקוף עם הלוגו פונה אליך ולהפוך נגד כוון השעון עד 45 ° זווית עם יציאת לערבב פונה אליך.
   2. מחזיק באותה זווית, בעדינות להטות Multi-Flask מ מלפנים לאחור (צוואר ממך) עד נוזלי בשכבה העליונה מנקז downwar מלאDS דרך נמל לערבב. Pivot על תמהיל נמל בצד.
   3. כמו כן, בעדינות רוק Flask Multi-מהסוף להתחלה (צוואר כלפיך) עד בינוני מרוקן לגמרי מהשכבה התחתונה כלפי העליונה דרך נמל לערבב. חזור על שלבים 1.2.2 ו 1.2.3 עוד פעם אחת כדי להבטיח ערבוב ראויה.
   4. תביאו Multi-Flask בחזרה למיקום לערבב (שלב 1.2.1) והמשך שלב 1.3
   5. לחלופין, השעיית התא ניתן להכין חוץ מהבקבוק Multi-ההשעיה תא ניתן להוסיף את הכלי בעזרת פיפטה או עדין שוטף.
      1. נמל מאפשר לערבב בתוך כלי ערבוב של תאים עם התקשורת מבטל את הצורך להפוך כמויות גדולות של המתלים תא חיצוני.
      2. זה גם מאפשר השוואת התקשורת ברחבי שכבות Flask Multi-
3. איזון של נוזל
   1. לאחר ערבוב / הוספת ההשעיה התא, מקום רב Flask אנכית על גבי משטח עבודה שטוח להשוות את נפח הנוזל equally בכל השכבות.
4. החלוקה נוזל לתוך כל שכבת
   1. החזק את הבקבוק רב עם הלוגו פונה אליך ולהפוך כיוון השעון לנוזל 45 ° זווית למחיצה לתוך כל השכבות.

      טיפ:

      - לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב להשתמש משטח עבודה שטוח צעדים 1.3-1.4

5. הובלה
   1. לאחר ההשעיה מדיה המכילה תאים מחולק למחיצות, תחבורה Multi-Flask ב 45 ° זאת זוית (בכיוון השעון) כמו שלב 1.4.1 עם אמצעי התקשורת רחוק מנמל לערבב לתוך אינקובטור. עמדה זו מתאימה גם בעת הסרת צלוחיות מן החממה לצפייה על מיקרוסקופ.
6. הצבת Multi-Flask על המדף חממה
   1. אחזקות Multi-Flask על 45 ° זווית (עם כיוון השעון, הרחק מן הנמל, לערבב), בעדינות לסובב אותה אופקית על משטח החממה (באמצעות בפינה הרחק מנמל לערבב כמוpivot). Lay Multi-Flask עם לוגו פונה כלפי מעלה.
      1. פלקון רב Flask עיצוב כלי המאפשר להיות מוערמים ומחזיק אותם במקום על ידי הצלעות לערום חסון.
7. חלוקת תאים ריאגנטים
   1. לאחר הצבת Multi-Flask שטוח על משטח העבודה, בעדינות קדימה ואחורה ומצד אל צד להפיץ התאים באופן שווה על גבי משטחים תרבות נזהרת שלא לשפוך נוזל מתוך כל שכבה. סטאק צלוחיות.
      1. Flask זה עשוי מחומר ברור אופטית ותאי על השכבה האחרונה ניתן לראות בקלות על מיקרוסקופ.
8. מדיה החליפין
   1. לשאוב תוך הטיית Flask Multi-שמאלה (תערובת יציאת בצד) עם הלוגו פונה אליך.
   2. ואז להטות, את הבקבוק Multi-ימינה, ממשיכים לשאוב את כל התקשורת שיורית.
   3. הוסף את הכמות המתאימה של התקשורת ופעל צעדים 1.3-1.7

2.תאים מסיק מן Multi-צלוחיות

1. כדי לנתק את התאים בשורה Multi-צלוחיות אנכית להביא כל אחד מערבבים עמדה (שלב 1.2.1). בעדינות להפוך צלוחיות עם צוואר פונה אליך על מנת לאפשר תקשורת לנקז את השכבה העליונה של Flask רב.
2. הוספת טיפ 5 או 10 מ"ל aspirating דרך הצוואר עד שתגיע לרמה נוזלי ליד הנמל לערבב. לשאוב בינוני מותש.
3. הוסף דיסוציאציה מגיב / לשטוף חיץ ולהביא מערבבים עמדה כמו שלב 1.2.1, ולאחר מכן להמשיך ולעקוב אחר הצעדים 1.3-1.7. לנטרול באמצעות צמיחה בינוני / סוכן נטרול ויוצקים ההשעיה התא לתוך צינור המקבל או להפוך בקבוק כזה כי תאי ניקוז אל את השכבה העליונה של הספינה ולאסוף תאים בעזרת פיפטה 10 מ"ל.

   עצה: כדי לשפר את ההתאוששות של תאים או חומרים כימיים, להביא Multi-Flask לערבב עמדה (שלב 1.2.1), להפוך את הצוואר כלפי מפעיל כדי לאפשר ניקוז מוחלט של התקשורת מאל אני שכבות השכבה העליונה. ואז, Flask Multi-להטות כיוון השעון עד זווית 45 מעלות (הרחק מנמל תערובת), בעוד Flask Multi-נשאר הפוך. השתמש פיפטה (10-10 מ"ל) לאסוף כל ריאגנטים הנותרים.

3. נפח העבודה מומלץ פלקון Multi-צלוחיות

צמיחה התקשורת

3-Layer: 75-150 מ"ל לכל Flask Multi-
5-Layer: 125-250 מ"ל לכל Flask Multi-

דיסוציאציה סוכן

3-Layer: ≥ 15 mL לכל Flask Multi-
5-Layer: ≥ 25 mL לכל Flask Multi-

טיפ: התחילו עם נפח בינוני המשמשים T-175 צלוחיות תקן ולהתרבות על ידי 3 או 5 פעמים בהתאם Flask רב את הפורמט, כך העריכו מ"ל לכל יחידת שטח נשאר זהה.

4. נציג תוצאות:

1. עיצוב Flask Multi-Falcon

files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. איור 1: Multi-Flask התרבות כלי נייד זמינים 3 - 5 ו - שכבתיים בפורמט stackable עבור מדרוג כלפי מעלה של תאים מתן 525 ו - 875 ² ס"מ צמיחה פני השטח, בהתאמה. פיפטה גישה מקלה בנוסף והסרה של תאים לתוך ריאגנטים ו מתוך הספינה. נוכחות של נמל לערבב מאפשרת מהירה, כלי ערבוב השוואת התקשורת בכל שכבות Flask רב.

2. תשואה נייד באמצעות Multi-Flask:

כלים אלה זמינים Layer-3 ו - 5-שכבת פורמטים המתאימים 3 ו - 5 פעמים את פני השטח של T-175 צלוחיות. לפיכך, ≥ 3 ו 5 פעמים (130 ± 6.8 x 10 ⁶ ו 218 ± 23.6 x 10 ⁶ תאים, בהתאמה) מספר BHK-21 (כליות התינוק אוגר) התאים גדלו התאושש Flask Multi-בהשוואה ל-T-175 צלוחיות (43.2 ± 3.5 x 10 ⁶ תאים; Fig.2A). תא תשואה לכל uאזור ניט השטח היה המקבילה 3 - ו 5 רב שכבתיים צלוחיות ו-T-175 עבור צלוחיות BHK-21, LnCAP (תאים אנושיים הערמונית קו אדנוקרצינומה), הפ-G2 (קו אנושי תא hepatocarcinoma), EcoPack 2-293 (אנושי התא קו כליות) בתרבית למשך תקופה של 48-96h (Fig.2B) בתקשורת צמיחה (35 מ"ל לכל שכבה) מומלץ על ידי הספק הסלולרי (ATCC, Sigma ו / או Clontech). תאים פורטו על הדלפק וי תא אוטומטי ^(1).

איור 2 א ': שלוש עד חמש פעמים את מספר BHK-21 התאים גדלו התאושש 3 - 5 ו - שכבתיים Multi-צלוחיות לעומת T-175 צלוחיות. התשואה הצפוי נקבע באמצעות תא תשואה ממוצע משליטת T-175 צלוחיות מוכפל פי שלוש לחמש במשך 3 - 5 ו - שכבתיים Multi-צלוחיות בהתאמה (n = 4 צלוחיות / פורמט).

2B איור: תשואה Cell לס"מ ² היה המקבילה 3 - 5 ו - שכבתיים Multi-צלוחיות ו-T-175 עבור צלוחיות BHK-21, LnCAP, HepG2 ו EcoPack2-293 תאים. כל עמודה מייצגת ממוצע של 4-6 צלוחיות. BHK-21 תאים (11,000 cells/cm2) היו בתרבית למשך 72 שעות, תאים LnCAP (20,000 cells/cm2) ו EcoPack2-293 תאים (~ 35,000 cells/cm2) היו בתרבית למשך 96 שעות ו HepG2 תאים (25,000 תאים / ² ס"מ ) היו בתרבית במשך 48 שעות לפני הקציר.

3. מדיה הפצה בין שכבות של Flask Multi-

תרבית תאים בינוניים (DMEM; Invitrogen) נוספה שכבה 5-Multi-צלוחיות (250 כלי mL/5-layer) ו מחולקת לשכבות על פי הפרוטוקול המתואר לעיל. הפצת מדיה נמדדה על ידי קידוח חורים בכל שכבה התקשורת שאוב מתוך שכבות בודדות. משקל של נוזל התאושש כל שכבה נמצאה להיות אחיד יחסית משכבת ​​כפי שמוצג באיור 3. הם כדלקמן: 510.8 ± 0.73, 50.3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (GM).

באיור 3. הפצת מדיה אחיד בכל אחד חמש שכבות של Flask Multi-5-השכבה. תרבות בינוני Cell נוספה Multi-צלוחיות (250 כלי ml/5-layer), equilibrated & מחולקת לשכבות בודדים. התקשורת נשאבו החוצה דרך חורים שנקדחו לתוך שכבות הפרט משקל נוזל נרשמה מתוך כל שכבה (n = 6 צלוחיות).

4. Cell הפצה בין שכבות של Flask Multi-

תאים ניתן להוסיף מעורב בתוך Flask רב. אנחנו הפצה מדומה של תאים בין שכבות של Flask רב באמצעות חרוזים (10μm; PolySciences Inc) דומים בגודלם לתאים. השעיה ביד נוספה לכלי רב Flask באמצעות פיפטה 10 מ"ל דרך השכבה העליונה מעורבב עם כלי התקשורת כפי יורדribed בפרוטוקול לעיל. הפצה ביד נמדדה על ידי קידוח חורים בשכבת כל נוזל המכיל ההשעיה חרוז נשאבו מתוך שכבות בודדות. ריכוז ביד התאושש כל שכבת היה לקרוא על הדלפק קולטר והקליט. מוצג מתחת שקולים בין שכבת הפצות חרוז בשכבת-3 Multi-צלוחיות (Fig.4A). תמהיל-port מאפשר הפצה הומוגני של תאים ריאגנטים בין Flask מרובה שכבות.

איור 4 א: הפצה ביד בכל אחד שלוש שכבות של Flask Multi-3-השכבה. ההשעיה של חרוזים (3.6 x10 ⁶ / ml) נוספה בינוני לוותר לתוך Multi-צלוחיות (השעיה חרוז: נפח המדיה 01:10, כרך: כרך) מעורב, ואחריו איזון צעדים מחיצה באמצעות פרוטוקול המתואר. ריכוז ביד התאושש כל שכבה (בינוני שאוב דרך חורים שנקדחו בכל שכבה) היה לקרוא על הרוזן קולטראה והקליט. מוצג מתחת שקולים בין שכבת הפצות חרוז ב 3 - שכבה Multi-צלוחיות (n = 5 צלוחיות)

מוצג להלן נציג תמונות של Ecopack 2-293 דפוסי מכתים של תאים גדל מפגש> 80% ב -3 שכבות Multi-צלוחיות בתקשורת צמיחה שיושלם. Monolayers Cell קובעו ונצבעו עם קריסטל סגול Multi-Flask שכבות נחתכו אז תמונות סרוקות ^(2). , הערה דפוסים התא היה אחיד על כל השכבות של Flask-Multi (Fig.4B). תוצאות דומות התקבלו עם סוגי תאים רבים העריכו (מידע לא מוצג).

איור 4B: נתון זה ממחיש צמיחת תאים הומוגנית בין שכבות של Multi-צלוחיות. Ecopack-2-293 תאים גדל מפגש> 80% ב 3-רב שכבתיים צלוחיות ו-T-175 קובעו ונצבעו עם קריסטל סגול. Multi-Flask כלי נחתכו כל שכבה צבעונית נסרק.

5 אספקת האוויר Flask-Multi.:

ניתוח של התקשורת בילה באמצעות BioProfile FLEX מנתח ^(3,4) (נובה ביו) מ EcoPack2-293 תאים בתרבית למשך 96 שעות עולה כי אין הבדל בתוך הרוויה אוויר של תאים שגודלו 5 שכבתיים Multi-צלוחיות לעומת T-175 צלוחיות (81.03 ± 1.9 לעומת 83.4 ± 5.8% הסביבה O _2).

איור 5: האוויר רווי (% הסביבה O ₂₎ של התקשורת בילה היו דומים מראש מעורבת התקשורת מ -5 שכבת Multi-צלוחיות לעומת T-175 צלוחיות. EcoPack2-293 תאים היו זורעים בצפיפות של 35,000 תאים / ס"מ ² ותרבותי עבור 96 שעות לפני ניתוח מדיה (n = 3 צלוחיות).

המחקר הנוכחי מדגים את הגידול בפריון כי העיצוב Flask Multi-מציעה לחוקרים. בעוד חשוב לבצע את השלבים שתוארו לעיל, לקבלת ביצועים מיטביים כאשר באמצעות Multi-צלוחיות, ישנם כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול זה נחשבים חיוניים ביותר. אלה כוללות: (i) ערבוב של תאים ריאגנטים באמצעות יציאת לערבב בתוך כלי (ii) העברת Multi-Flask בזווית של 45 מעלות עם כיוון השעון לאחר חלוקת נוזל לתוך כל השכבות (iii) הנחת Flask Multi-שלאחר שטוח לתוך מחיצות החממה.

שימוש נכון Flask רב מוביל הייצור של אוכלוסייה הומוגנית תא בתוך כלי אחד כי הוא תרבותי בסביבה כי הוא חופף ל-T-175 צלוחיות ^(5). כלים אלה מספקים תאים 3 ו - 5 פעמים יותר טביעת דומה כמו בקבוק T-175. כלי 3 ו -5 שכבת מספק 525 ו 875cm ² של אזור הגידול, בהתאמה ולהציע הן מרחב העבודה שלavings למשתמשים. בתרבית רקמה טיפול Surface ניתן להשוות צלוחיות סטנדרטי ומאפשר מדרוג כלפי מעלה ללא צורך מחדש אופטימיזציה התנאים תרבות קיימים או להתפשר על איכות, ההומוגניות או הביצועים של תאים ^{(6, 7).} זה גם מספק עבור השוואה עם נתונים שנאספו בעבר. כלים אלה יכולים להיות מצופים גם עם חומרים כימיים, כגון קולגן, פיברונקטין, poly-D-ליזין לספק תשתית לצמיחה המקצועית המצורף, והבחנה של סוגי תאים מסוימים, כגון ⁸ hepatocytes, kertainocytes ^9, בתאי גזע בוגרים בסרום ללא מדיה ניסוחים. פתרונות ציפוי ניתן להסיר עם שמירה מינימלית נוזל שיורי כדי לצמצם בזבוז של חומרים כימיים בעלי ערך, כמו גם הסרה יעילה של פתרון הציפוי לפני תאים culturing. נפח התקשורת מומלץ אופטימלי לתאי תרבות במגוון רב צלוחיות של 0.142-0.287 מ"ל / ² ס"מ אשר לתרגם 25-50 מ"ל לכל שכבה. בניגוד בקבוק אחר multilayered, לאהמוצר שלו מציע שילוב יציאת בכלי המאפשר מהירה, כלי ערבוב וכן התפלגות אחידה של תאים ריאגנטים בתוך ובין שכבות של כל כלי. שורות תאים מגוונים, תרבויות יסודי בתאי גזע כבר scaled עד ביעילות באמצעות Multi-צלוחיות. כלים אלה הם יתרון במיוחד ביישומים הדורשים מספר רב של תאים כגון תפוקה גבוהה, סינון, ייצור החיסון, transfections וקטור ויראלי טיפול בתא.

חסכון, עבודה הזמן, המרחב ואת ייצור הפסולת מופחתת הן זכיות המפתח של Flask רב לעומת תרבויות קונבנציונלי חד שכבתית כלי. אנחנו יכולים התרבות כ שלוש פעמים את מספר התאים שנקטפו מן 5, T-175 צלוחיות באותו מקום באמצעות 3, 5 רב שכבתיים צלוחיות. יתרון זה של שמירת מקום אינה מוגבלת רק ל-T-175, אך ניתן גם להרחיב את כלי אחר: הרים בקבוק סטנדרטי מנגנון שמתאים לבתים חממות משותף במעבדה 4 ~ רולהימלר בקבוקים (2200 מ"ל) שכל אחד מהם מספק 850cm ² שטח פנים. באותו אזור, ~ 20, 5 רב שכבתיים צלוחיות ניתן שוכנו ובכך לספק חמש פעמים את פני השטח של צמיחת תאים תרבות. יתר על כן, עם גידול המודעות "לך ירוק", אפשרויות להפחתת ייצור הפסולת הוא רצוי מאוד. במובן זה, יש 38% (5, T-175 צלוחיות שוקל 640g ~ בעוד אחד, 5 רב שכבתיים Flask שוקל ~ 400 גרם) ירידה ייצור הפסולת באמצעות Multi-צלוחיות לעומת T-175 צלוחיות אלה יתרונות להוביל לירידה בעלויות אחסון פסולת לרשות והתוצאה חיסכון כלכלי למשתמש.

מחברים כל עובדי בקטון דיקינסון, Biosciences, מגזר יחידת דיסקברי labware.

1. Szabo, S.E., Monroe, S.L., Fiorino, S., Bitzan, J., & Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109 (2004).
2. Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487 (1989).
3. Sengupta, N., Rose, S.T., & Morgan, J.A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83 (2010).
4. Zhu, M.M., Goyal, A., Rank, D.L., & Gupta, S.K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
5. Ryan, J.M., Sharf, B.B., & Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res 91, 389 (2004).
6. Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
7. Sanyal, S., Abraham, E.J, Slater, K., Cai A., Lacey B., Hartshorn C., Flaherty, P., McHugh B., & Qian S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
8. DiPersio, C.M., Jackson, D.A., & Zaret, K.S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405 (1991).
9. Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F.M., Fassler, R., Brakebusch, W.S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303 (2002).

2 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.