Scale-Up fra pattedyr Cell Kultur bruge et nyt lag Lommelærke

Abraham, E. J., Slater, K. A., Sanyal, S., Linehan, K., Flaherty, P. M., Qian, S. Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask. J. Vis. Exp. (58), e3418, doi:10.3791/3418 (2011).

Et stigende antal af celle-baserede applikationer kræver et stort antal celler. Brug af enkelt lag T-flasker, som er tilstrækkeligt stor i små ekspansion, kan blive besværlig, møjsommelig og tidskrævende når et stort antal celler er påkrævet. For at imødekomme dette behov, til udførelsen af ​​en ny multi-lag cellekultur fartøj lette nemt skalere op af celler fra en enkelt lag T-kolber vil blive drøftet. Det testede kolber findes i 3 - og 5-lags-format og gøre det muligt for kultur og fuldstændig helbredelse af tre og fem gange så mange celler sammenlignet med T-175 kolber. Et centralt element i BD Multi-Kolbe er en blanding / ligevægt port, der giver mulighed for hurtige in-fartøj blanding samt ensartet fordeling af celler og reagenser inden for og mellem lag af hver beholder og producere ensartede celler, der kan dyrkes i et miljø, er kongruent til T-175 kolber.

Udformningen af ​​disse Multi-Kolber giver også mulighed for Convenient pipette adgang til tilføjelse af reagenser og celler direkte i kolberne samt effektiv inddrivelse af værdifulde celler og reagenser og reducerer risikoen for forurening som følge af at hælde. Til applikationer, hvor hælde er foretrukket frem for pipettering tillader design for minimal residual væske retention, for at mindske spild af værdifulde celler og reagenser.

1. Protokol til at bruge Multi-flasker til cellekultur

1. Udarbejdelse af fartøjer og tilføje cellesuspension
   1. Forbered cellevækst medie efter behov.
   2. Line up Multi-Kolbe lodret på sin side med hætten opad på arbejdsfladen (sterilt laminar flow hætte).
      1. Disse flasker er til rådighed i 3 og 5-lags formater og bruge en lignende work-flow-mønster som en T-175 kolbe.
   3. Løsn og fjern hætter. Tilsæt nødvendige mængde forvarmet medium til kolbe ved hjælp af et 50 eller 100 ml pipette eller ved at hælde.
      1. Pipetter, der er ≤ 10 ml kan nå bunden af beholderen, når Multi-Kolber er placeret lodret med hætten opad. Pipetter ≥ 10 ml kan nå ind i fartøj øjeblikkeligt forbi logoet på Multi-kolbe, hvilket giver en bekvem portal til at tilføje større mængder af medier til fartøj.
   4. For at undgå bobler af medie, der trænger væske streame til flOW langs indersiden af ​​Multi-Kolbe låg (logo-side).
   5. Tilføj cellesuspension fra en koncentreret celle materiel skal tages i vækstmediet gennem det øverste lag ved hjælp af en 10 mL pipette og hætte kolber.

      Tips:

      - Transport Multi-beholdere om en vogn til inkubator-stedet og udføre de resterende trin.
      - Cellen seeding tæthed vil variere afhængigt af celletype, mellemstore og kultur varighed skal. Begynd med seeding tæthed og medielydstyrken den, der anvendes i standard T-175 kolber og gange med 3 eller 5, afhængigt af Multi-Kolbe, der bruges.

2. Blanding af celler
   1. Mix position: Hold Multi-Kolbe oprejst med logoet opad, og drej mod uret til en 45 ° vinkel med mix-porten mod dig.
   2. Beholdning ved den samme vinkel, tilt forsigtigt Multi-kolben fra front til bag (nakken væk fra dig), indtil væsken i det øverste lag afløb fuldt downwards gennem mix-porten. Pivot på mix port-side.
   3. Ligeledes forsigtigt klippe Multi-kolben fra back til front (hals mod dig), indtil medium afløb fuldt ud fra det nederste lag mod toppen via mix-porten. Gentag trin 1.2.2 og 1.2.3 en gang mere for at sikre korrekt blanding.
   4. Bring Multi-kolbe tilbage for at blande position (trin 1.2.1) og fortsæt til trin 1,3
   5. Alternativt kan cellesuspension være forberedt eksternt fra Multi-kolben og cellesuspension kan føjes til skibet ved hjælp af en pipette eller ved forsigtig hælde.
      1. Bland port tillader in-fartøj blanding af celler med medier og eliminerer behovet for at gøre store mængder cellesuspensioner eksternt.
      2. Det giver også medierne udligning på tværs af lag af Multi-kolbe
3. Ligevægt af væske
   1. Efter blanding / tilsætning af cellesuspension, at placere Multi-Kolbe lodret på en flad arbejdsflade udligne væskevolumen ligningerlly i alle lag.
4. Partition væske ind hvert lag
   1. Hold Multi-kolbe med logoet opad, og drej med uret til en 45 ° vinkel til at opdele væsken ind i hver af strengene.

      Tip:

      - For det bedste resultat, er det vigtigt at bruge en flad arbejdsflade for Steps 1,3-1,4

5. Transport
   1. Når medier, der indeholder cellesuspension er partitioneret, transport Multi-kolbe på samme 45 ° vinkel (med uret), som i Trin 1.4.1 med medier væk fra mix havnen i kuvøse. Denne holdning er også velegnet, når du fjerner kolber fra kuvøse til visning på et mikroskop.
6. Placering Multi-kolbe på inkubator hylde
   1. Holding Multi-kolbe på 45 ° vinkel (med uret, væk fra mix-port), forsigtigt drej den ned vandret på kuvøse overflade (ved hjælp hjørnet væk fra mix-port somPivot). Lay Multi-kolbe med logoet opad.
      1. Falcon Multi-Kolbe design giver fartøjer, der skal stables og holder dem på plads af en robust stacking ribben.
7. Fordeling af celler og reagenser
   1. Efter markedsføringen af ​​Multi-Kolbe fladt på arbejdsfladen, rock forsigtigt frem og tilbage og fra side til side for at distribuere celler jævnt på kultur overflader pas på ikke at spilde væske fra hvert lag. Stack kolber.
      1. Denne kolbe er fremstillet af optisk klar materiale og celler på det sidste lag kan let ses på et mikroskop.
8. Media udveksling
   1. Aspirer mens vippe Multi-Kolbe til venstre (mix-port-side) med logoet mod dig.
   2. Så tilt, Multi-Kolbe til højre, fortsætter med at suge alle resterende medier.
   3. Tilsæt passende mængde af medier og følge trin 1,3-1,7

2.Høst celler fra Multi-Kolber

1. For at adskille celler, linje op Multi-Kolber lodret og bringe hver én til at blande position (trin 1.2.1). Vend forsigtigt kolber med nakken mod dig, således at medierne til at løbe til det øverste lag af Multi-kolbe.
2. Indsæt en 5 eller 10 mL sugning spidsen gennem halsen, indtil du når væsken niveau nær mix havnen. Aspirer opbrugt medium.
3. Tilføj dissociation reagens / vaskebuffer og bring Mix position som i trin 1.2.1, derefter fortsætte og følge trin 1,3-1,7. Neutraliser med vækstmedium / neutraliserende middel og hæld cellesuspension til en modtagende rør eller invertsukker kolbe, således at celler afløb til det øverste lag af fartøjet og indsamle celler ved hjælp af en 10 ml pipette.

   Tip: For at fremme genanvendelsen af celler eller reagenser, bringer Multi-Kolbe at blande position (trin 1.2.1), vendes med nakken mod operatøren for at tillade fuldstændig dræning af medier fra al l lag til det øverste lag. Så, tilt Multi-kolbe med uret til 45 ° vinkel (væk fra mix-port), mens Multi-Kolbe er stadig inverteret. Brug en pipette (1-10 ml) for at samle eventuelle resterende reagenser.

3. Anbefalet arbejder volumen i Falcon Multi-Kolber

Vækstmedier

3-Layer: 75-150 ml pr Multi-kolbe
5-Layer: 125-250 ml pr Multi-kolbe

Dissociation agent

3-Layer: ≥ 15 ml pr Multi-kolbe
5-Layer: ≥ 25 ml pr Multi-kolbe

Tip: Begynd med medium volumen anvendes i standard T-175 kolber og gange med 3 eller 5 gange, afhængigt af Multi-Kolbe format evalueret, så mL pr areal forbliver den samme.

4. Repræsentative resultater:

1. Design af Falcon Multi-kolbe

files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Figur 1: Multi-Kolbe Cell Culture fartøjerne findes i en 3 - og 5-lags stabelbare format til opskalering af celler leverer 525 og 875 cm ² vækst areal, hhv. Pipette adgang letter tilføjelse og fjernelse af celler og reagenser ind-og ud af fartøjet. Tilstedeværelse af mix-port giver mulighed for hurtig in-fartøj blanding og udligning af medier på tværs af alle lag af Multi-kolbe.

. 2 Cell Yield ved hjælp af Multi-Flask:

Disse fartøjer er tilgængelige i 3-lag og 5-lags formater, som svarer til 3 og 5-gange arealet af T-175 kolber. Derfor ≥ 3 og 5 gange (130 ± 6,8 x 10 ⁶ og 218 ± 23,6 x 10 ⁶ celler, henholdsvis) antallet af BHK-21 (Baby hamster nyre) celler blev dyrket og nyttiggøres fra Multi-Kolbe sammenlignet med T-175 kolber (43,2 ± 3,5 x 10 ⁶ celler; Fig.2A). Cell udbytte pr uNIT areal svarede i 3 - og 5-lags Multi-kolber og T-175 flasker til BHK-21, LNCaP (humane prostata adenokarcinom cellelinje), Hep-G2 (human hepatocarcinoma cellelinje), Ecopak 2-293 (human nyre cellelinie) kunstigt i en periode på 48-96h (Fig.2B) i vækstmedier (35 ml pr lag), som anbefalet af celle leverandør (ATCC, Sigma og / eller Clontech). Celler blev opregnet på en automatiseret Vi-celletalsmåler ^(1).

Figur 2A: Tre og fem gange så mange BHK-21 celler blev dyrket og nyttiggøres fra 3 - og 5-lags Multi-Kolber sammenlignet med T-175 kolber. Forventede afkast er fastsat ved hjælp betyde celle udbytte af kontrol T-175 kolber, ganget med tre og fem gange for de 3 - og 5-lags Multi-Kolber henholdsvis (n = 4 kolber / format).

Figur 2B: Celle udbyttet pr cm ² blev tilsvarende i 3 - og 5-lags Multi-kolber og T-175 flasker til BHK-21, LNCaP, HepG2 og EcoPack2-293 celler. Hver søjle repræsenterer gennemsnit af 4 til 6 kolber. BHK-21 celler (11.000 cells/cm2) blev dyrket i 72 timer, LNCaP celler (20.000 cells/cm2) og EcoPack2-293 celler (~ 35.000 cells/cm2) blev dyrket i 96 timer og HepG2 celler (25.000 celler / cm ² ) blev dyrket i 48 timer før høst.

3. Medier fordeling mellem lag af Multi-kolbe

Cellekulturmedium (DMEM; Invitrogen) blev tilføjet til 5-lags Multi-Kolber (250 mL/5-layer fartøj) og partitioneret i lag i henhold til protokol, der er beskrevet ovenfor. Mediedistribution blev målt ved at bore huller i hvert lag og medier pumpes ud fra de enkelte lag. Vægt af væske inddrives fra hvert lag fandtes at være relativt ensartede fra lag til lag som vist i Figur 3. De er som følger: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (GM).

Figur 3. Ensartet mediedistribution i hver af de fem lag af et 5-lags Multi-kolbe. Cellekulturmedium blev tilføjet til Multi-Kolber (250 ml/5-layer fartøj), ekvilibreres & partitioneret til individuelle lag. Medierne blev pumpet ud gennem huller boret ind i de enkelte lag og flydende vægt blev registreret fra hvert lag (n = 6 kolber).

4. Cell fordeling mellem lag af Multi-kolbe

Celler kan tilføjes og blandes inden for Multi-kolbe. Vi simulerede fordeling af celler mellem lag af Multi-Kolbe med perler (10μm; PolySciences Inc.) svarer i størrelse til celler. Bead suspension blev tilføjet i Multi-Kolbe fartøj ved hjælp af en 10 mL pipette gennem det øverste lag og blandes med medier i fartøjet som described i protokollen ovenfor. Bead fordeling blev målt ved at bore huller i hvert lag og væske indeholdende perle suspension blev pumpet ud fra de enkelte lag. Bead koncentration inddrives fra hvert lag blev læst på en Coulter Counter og registreres. Nedenfor er ækvivalente inter-lags perle fordelinger i 3-lags Multi-kolber (Fig.4A). Mix-porten gør det muligt homogen fordeling af celler og reagenser mellem Multi-kolbe lag.

Figur 4A: Bead distribution i hver af de tre lag af en 3-lags Multi-kolbe. En suspension af perler (3,6 x10 ⁶ / ml) blev tilføjet til medium dispenseres i Multi-Kolber (perle suspension: medielydstyrken er 1:10, vol: vol) og blandes, efterfulgt af ligevægt og deling ved hjælp af den beskrevne protokol. Bead koncentration inddrives fra hvert lag (middel pumpes gennem huller boret på hvert lag) blev læst på en Coulter Countis og registreres. Nedenfor er ækvivalente inter-lags perle udlodninger i 3 - lags Multi-Kolber (n = 5 kolber)

Nedenfor er repræsentative billeder af Ecopak 2-293 farvede mønstre af celler vokset til> 80% sammenløb på 3-lags Multi-kolber i suppleret vækstmedie. Celle monolag blev fastsat og farves med krystalviolet og Multi-Kolbe lag blev derefter skåret og billeder, der scannes ^(2). Bemærk, celle mønstre var homogent på alle lag af Multi-kolbe (Fig.4B). Lignende resultater blev opnået med flere celletyper evalueres (data ikke vist).

Figur 4B: Denne figur illustrerer homogen cellevækst mellem lag af Multi-kolber. Ecopak-2 til 293 celler vokset til> 80% sammenløb i 3-lags Multi-kolber og T-175 var faste og farves med krystalviolet. Multi-Kolbe skibe blev skåret, og hver farvede lag blev scannet.

5 Lufttilførsel i Multi-kolbe.:

Analyse af brugte medier ved hjælp af BioProfile FLEX analysator ^(3,4) (Nova Biomedical) fra EcoPack2-293 celler dyrkes i 96 timer viste ingen forskel i luft mætning af celler dyrkes i 5-lags Multi-Kolber vs T-175 kolber (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% omgivende O _2).

Figur 5: Air mætning (% omgivende O ₂₎ af brugt medierne var ens i pre-mixed media fra 5-lags Multi-Kolber vs T-175 kolber. EcoPack2-293 celler blev tilsået med en tæthed på 35.000 celler / cm ² og dyrkes i 96 timer forud for medieanalyse (n = 3 kolber).

Den aktuelle undersøgelse viser stigningen i produktiviteten, at Multi-Kolbe design giver forskere. Selv om det er vigtigt at følge trinene ovenfor for optimal ydelse ved brug af Multi-Kolber, der er kun få kritiske skridt i denne protokol, der anses for mest essentielle. Disse omfatter (i) blanding af celler og reagenser ved hjælp af blandingen havn inden skibet (ii) transport af Multi-kolben på en 45 ° vinkel med uret efter partitionering væske ind i hver af de lag (iii) om Multi-Kolbe fladt indlæg opdele i kuvøse.

Korrekt brug af Multi-Kolbe fører til produktion af en homogen cellepopulation inden for hvert fartøj, der er dyrket i et miljø, der er kongruent til T-175 flasker ^(5). Disse fartøjer tilbyde 3 og 5 gange flere celler i et lignende fodaftryk, som T-175 kolbe. De 3 og 5-lags fartøj giver 525 og 875cm ² af vækstområde, henholdsvis og tilbyder både plads og arbejdskraft savings til brugerne. Vævskultur Overfladebehandling er sammenlignelig med standard kolber således at opskalering uden behov for re-optimering af eksisterende kultur betingelser eller gå på kompromis med kvalitet, ensartethed eller udførelse af celler ^{(6, 7).} Dette giver også mulighed for sammenlignelighed med tidligere indsamlede data. Disse fartøjer kan også belagt med reagenser, såsom collagen, fibronektin, poly-D-lysin til at give et specialiseret substrat for vedhæftet fil, vækst og differentiering af visse celletyper, såsom hepatocytter ^8, kertainocytes ^9, stamceller dyrket i serum-frie medier formuleringer. Coating løsninger kan fjernes med minimal residual væske retention, for at mindske spild af værdifulde reagenser samt effektiv fjernelse af belægning opløsning før dyrkning af celler. Den anbefalede optimale medielydstyrken til kultur celler i Multi-kolber området fra 0,142 til 0,287 ml / cm ^2, hvilket oversættes til 25-50 ml pr lag. I modsætning til et andet lag kolbe, tsit produkt byder på en blanding-havn i det fartøj, der gør det muligt hurtigt in-fartøj blanding samt ensartet fordeling af celler og reagenser inden for og mellem lag af hvert fartøj. Diverse cellelinjer, primære kulturer og stamceller er blevet skaleret op effektivt ved hjælp af Multi-kolber. Disse skibe er særlig fordelagtige i applikationer, der kræver et stort antal celler som i high throughput-screening, produktion af vacciner, viral vektor transfections og celleterapi.

Besparelser i tid, rum, arbejdskraft og reduceret affaldsproduktion er væsentlige gevinster af Multi-Kolbe versus konventionel kulturer i enkelt lag fartøjer. Vi kan kulturen omkring tre gange antallet af celler høstet fra 5, T-175 kolber i samme rum med 3, 5-lags Multi-kolber. Denne fordel i rummet besparelse er ikke begrænset til T-175, men kan også udvides til andre fartøjer: en standard, rulle flaske apparat, der passer til fælles laboratorium væksthuse huse ~ 4 rolLER flasker (2200 ml), som hver giver 850cm ² overfladeareal. I samme område, kan ~ 20, 5-lags Multi-Kolber anbringes hvilket giver fem gange så væksten overfladen til kultur celler. Desuden, med en stigning i "Go-Green" bevidsthed, er muligheder for at reducere affaldsmængderne særdeles ønskeligt. I den henseende er der en 38% (5, T-175 flasker vejer ~ 640g, mens én, 5-lags Multi-kolbe vejer ~ 400g) fald i affaldsmængderne ved hjælp af Multi-Kolber sammenlignet med T-175 flasker, og disse fordele bly at falde i oplagring af affald og bortskaffelse omkostninger og resultere i økonomiske besparelser for brugeren.

Alle forfattere er medarbejdere i Becton Dickinson, Biosciences Segment, Discovery Labware Unit.

1. Szabo, S.E., Monroe, S.L., Fiorino, S., Bitzan, J., & Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109 (2004).
2. Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487 (1989).
3. Sengupta, N., Rose, S.T., & Morgan, J.A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83 (2010).
4. Zhu, M.M., Goyal, A., Rank, D.L., & Gupta, S.K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
5. Ryan, J.M., Sharf, B.B., & Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res 91, 389 (2004).
6. Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
7. Sanyal, S., Abraham, E.J, Slater, K., Cai A., Lacey B., Hartshorn C., Flaherty, P., McHugh B., & Qian S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
8. DiPersio, C.M., Jackson, D.A., & Zaret, K.S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405 (1991).
9. Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F.M., Fassler, R., Brakebusch, W.S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303 (2002).

2 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.