Skala upp av däggdjur Cell Culture med en ny mångbottnad Flask

Abraham, E. J., Slater, K. A., Sanyal, S., Linehan, K., Flaherty, P. M., Qian, S. Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask. J. Vis. Exp. (58), e3418, doi:10.3791/3418 (2011).

Ett växande antal cell-baserade applikationer kräver ett stort antal celler. Användning av enkelt lager T-flaskor, som är tillräckligt vid småskalig utbyggnad, kan bli besvärlig, mödosam och tidskrävande när ett stort antal celler behövs. För att möta detta behov, till utförandet av ett nytt mångsidigt cellodling fartyget underlätta enkel skala upp av celler från samma lager T-flaskor kommer att diskuteras. De testade flaskor finns i 3 - och 5-layer format och att kultur och fullständig återhämtning av tre och fem gånger antalet celler, jämfört med T-175 flaskor. Ett viktigt inslag i BD Multi-kolv är en mix / jämvikt port som tillåter snabb på-fartyg blandning samt jämn fördelning av celler och reagenser inom och mellan lager av varje fartyg och konsekvent producera celler som kan odlas i en miljö som är kongruent till T-175 flaskor.

Utformningen av dessa Multi-Kolvar gör det också möjligt för convenient pipett tillgång för att lägga till reagenser och celler direkt i flaskor samt effektiv återvinning av värdefulla celler och reagenser och minskar risken för förorening på grund hälla. För tillämpningar där hälla är att föredra framför pipettering, gör designen för minimal kvarvarande vätska retention för att minska slöseri med värdefulla celler och reagenser.

1. Protokoll att använda Multi-Kolvar för cellodling

1. Beredning av fartyg och lägga cellsuspensionen
   1. Förbered medelstora celltillväxt som behövs.
   2. Rada upp Multi-kolv lodrätt på sidan med locket uppåt på arbetsytan (sterilt laminärt flöde huva).
      1. Dessa flaskor finns i 3 och 5-layer format och använder ett liknande arbete flöde mönster som en T-175-kolv.
   3. Lossa och ta bort mössor. Tillsätt önskad mängd förvärmda mediet i kolven med 50 eller 100 ml pipett eller genom att hälla.
      1. Pipetter som är ≤ 10 ml når fartygets botten när Multi-Kolvar placeras vertikalt med locket uppåt. Pipetter ≥ 10ml kan nå in i fartyget omedelbart förbi logotyp på Multi-kolven, vilket ger en bekväm portal för att lägga större volymer av media till fartyget.
   4. För att undvika bubblande av medium, låt vätskan strömma till FLow längs den inre väggen av Multi-Flask lock (logo-sidan).
   5. Lägg cellsuspension från en koncentrerad cell lager till tillväxt medium genom det översta lagret med hjälp av en 10 ml pipett och kolvar mössa.

      Tips:

      - Transport Multi-Kolvar på en vagn till inkubator plats och utföra resterande steg.
      - Cellen seedning densitet varierar beroende på vilken celltyp, medelstora och kultur varaktighet behöver. Börja med sådd densitet och medievolymen den som används i standard T-175 kolvar och multiplicera med 3 eller 5 beroende på Multi-Flask format som används.

2. Blandning av celler
   1. Mix: Håll Multi-Flask upprätt med logotypen vänd mot dig och vrid moturs till 45 ° vinkel med mix port mot dig.
   2. Håll i samma vinkel, försiktigt luta Multi-kolven från framsidan till baksidan (hals bort från dig) tills vätskan i det översta lagret avlopp fullt downwards genom mixen porten. Pivot på mix port-sida.
   3. Likaså skaka Multi-kolven från bakfram (nacken mot dig) tills medelstora avlopp helt från det nedersta lagret mot toppen genom mixen porten. Upprepa steg 1.2.2 och 1.2.3 en längre tid för att säkerställa korrekt blandning.
   4. Ta Multi-kolv tillbaka för att blanda position (steg 1.2.1) och fortsätt till steg 1,3
   5. Alternativt kan cellsuspension vara beredd utvändigt från Multi-kolv och cellsuspension kan läggas till fartyget med hjälp av en pipett eller genom försiktig hälla.
      1. Blanda porten kan i-fartyg blandning av celler med media och eliminerar behovet av att göra stora volymer av cellsuspensioner externt.
      2. Det ger också media utjämning över lagren av Multi-Flask
3. Jämviktsinställning vätska
   1. Efter blandning / lägga cellsuspension att placera flera Flask lodrätt på en plan arbetsyta utjämna vätskevolym EQUAlly i alla lager.
4. Partition vätska i varje lager
   1. Håll Multi-kolven med logotypen vänd mot dig och vrid medurs för att en 45 ° vinkel för att partitionera vätska i varje lager.

      Tips:

      - För bästa resultat är det viktigt att använda en plan yta för steg 1,3-1,4

5. Transport
   1. När media som innehåller cellsuspension är partitionerad, samtidigt som 45 ° vinkel (medsols) som i steg 1.4.1 med media borta från mixen hamnen i kuvös transport Multi-kolven. Denna position är också lämplig när du tar bort flaskor från inkubator för visning på ett mikroskop.
6. Placera Multi-kolv på inkubator hylla
   1. Håll Multi-kolv vid 45 ° vinkel (medurs, bort från mix-port), försiktigt rotera den ner horisontellt på inkubatorn ytan (med hjälp av hörnet borta från mixen port sompivot). Lay Multi-kolv med logotypen vänd uppåt.
      1. Falcon Multi-kolv designen gör fartyg som ska staplas och håller dem på plats med en stadig stapling revben.
7. Fördelning av celler och reagenser
   1. Efter att flera Flask platt på arbetsytan, skaka fram och tillbaka och från sida till sida för att fördela celler jämnt på kultur ytor noga med att inte spilla vätska från varje lager. Stack kolvar.
      1. Kolven är tillverkat av optiskt klar material och celler på det sista lagret lätt kan ses på ett mikroskop.
8. Media utbyte
   1. Sug medan luta Multi-kolven till vänster (blandning Port-sida) med logotypen vänd mot dig.
   2. Sedan tilt, Multi-kolven till höger, fortsätter att aspirera alla kvarvarande medier.
   3. Tillsätt lämplig mängd media och följ steg 1,3-1,7

2.Skörd celler från Multi-Kolvar

1. Att skilja celler, rada upp flera Kolvar vertikalt och föra var och en till Mix position (steg 1.2.1). Vänd försiktigt kolvar med nacken mot dig så att media rinna till det översta lagret av Multi-kolven.
2. Sätt i en 5 eller 10 ml aspirering spets genom halsen tills du når vätskenivå nära mixen hamnen. Aspirera utmattad medium.
3. Lägg dissociation reagens / tvättbuffert och ta med till Mix position som i steg 1.2.1, fortsätt och följ steg 1,3-1,7. Neutralisera med tillväxt medium / neutraliseringsmedel och häll cellsuspension i en mottagande rör eller vänd kolv så att cellerna dräneras till det översta lagret av fartyget och samla in celler med hjälp av en 10 ml pipett.

   Tips: För att öka återvinningen av celler eller reagenser, ta med Multi-kolv för att blanda position (steg 1.2.1), invertera med nacken mot operatören för att möjliggöra fullständig dränering av media från al l lager på översta lagret. Sedan lutar Multi-kolv medurs till 45 ° vinkel (bort från blandningen hamnen) medan Multi-Flask återstår inverterad. Använd en pipett (1-10 ml) för att samla in eventuella kvarvarande reagenser.

3. Rekommenderad arbetsvolym i Falcon Multi-Kolvar

Tillväxt medier

3-lager: 75-150 ml per Multi-kolv
5-lager: 125-250 ml per Multi-kolv

Dissociation agent

3-lager: ≥ 15 ml per Multi-kolv
5-lager: ≥ 25 ml per Multi-kolv

Tips: Börja med medelhög volym som används i standard T-175 kolvar och multiplicera med 3 eller 5 gånger beroende på Multi-Flask format utvärderas så att mL per ytenhet förblir detsamma.

4. Representativa resultat:

1. Design av Falcon Multi-kolv

files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Figur 1: Multi-Flask Cell Culture fartygen finns i en 3 - och 5-lagers stapelbara formatet för skala upp av celler som ger 525 och 875 cm ² område tillväxt yta, respektive. Pipettera tillgång underlättar tillägg och borttagning av celler och reagenser till-och ut ur fartyget. Förekomst av mix-port möjliggör snabb i-fartyg blandning och utjämning av media i alla lager av Multi-kolven.

2. Cell Yield med Multi-kolv:

Dessa fartyg är tillgängliga i 3-lagers och 5-layer format som motsvarar 3 och 5-gånger ytan av T-175 flaskor. Därför ≥ 3 och 5 gånger (130 ± 6,8 x 10 ⁶ och 218 ± 23,6 x 10 ⁶ celler, respektive) Antalet BHK-21 (barn hamster njure) var celler som odlas och återhämtat sig från Multi-kolv jämfört med T-175 kolvar (43,2 ± 3,5 x 10 ⁶ celler; Fig.2A). Cell avkastning per uNIT yta var motsvarande i 3 - och 5-lagers Multi-Kolvar och T-175 flaskor för BHK-21, LnCAP (humant prostata adenocarcinom cellinje), Hep-G2 (humant leverkarcinom cellinje), Ecopak 2-293 (mänskliga njure cellinje) odlade under en period på 48-96h (Fig.2B) i tillväxt media (35 ml per lager) som rekommenderas av cell-leverantören (ATCC, Sigma och / eller Clontech). Celler räknades på en automatiserad Vi-celltalsräknare ^(1).

Figur 2A: tre och fem gånger så många BHK-21 celler odlades och återhämtat sig från 3 - och 5-lagers Multi-Kolvar jämfört med T-175 flaskor. Förväntad avkastning bestämdes med menar cell avkastning från kontroll T-175 flaskor med tre gånger och fem gånger för 3 - och 5-lagers Multi-Kolvar respektive (n = 4 flaskor / format).

Figur 2B: Cell avkastning per cm ² var motsvarande i 3 - och 5-lagers Multi-Kolvar och T-175 flaskor för BHK-21, LnCAP, HepG2 och EcoPack2-293 celler. Varje stapel representerar betyder på 4 till 6 flaskor. BHK-21 celler (11 tusen cells/cm2) odlades i 72 timmar, celler LnCAP (20.000 cells/cm2) och EcoPack2-293 celler (~ 35 tusen cells/cm2) odlades för 96 timmar och HepG2-celler (25.000 celler / cm ² ) odlades under 48 timmar före skörd.

3. Media fördelningen mellan lager av Multi-kolv

Cellodlingsmedium (DMEM, Invitrogen) inkom 5-lagers Multi-Kolvar (250 mL/5-layer fartyg) och delas upp i skikt enligt protokollet beskrivs ovan. Mediadistribution mättes genom att borra hål i varje lager och media pumpas ut från enskilda lager. Vikt av vätska återhämtat sig från varje lager befanns vara relativt enhetligt från skikt till skikt som visas i Fig. 3. De är som följer: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (GM).

Figur 3. Enhetliga mediadistribution i alla de fem lager av en 5-lagers Multi-kolven. Cellodlingsmedium inkom Multi-Kolvar (250 ml/5-layer fartyg), jämvikt och partitionerad på enskilda lager. Medierna pumpades ut genom hål som borrats in i enskilda lager och vätska vikt spelades in från varje lager (n = 6 flaskor).

4. Cell fördelning mellan lager av Multi-kolv

Celler kan läggas till och blandas i Multi-kolven. Vi simulerade fördelningen av celler mellan lager av Multi-kolv med pärlor (10μm, PolySciences Inc.) liknar storleken på cellerna. Bead fjädring inkom till multi-kolv fartyget med hjälp av en 10 ml pipett genom det översta lagret och blandas med media i fartyget som described i protokollet ovan. Bead fördelning mättes genom att borra hål i varje lager och vätska som innehåller pärla fjädring pumpades ut från enskilda lager. Bead koncentrationen återhämtat sig från varje lager lästes på en Coulter Counter och registreras. Nedan är likvärdiga mellan lager pärla distributioner i 3-lagers Multi-kolvar (Fig.4A). Mixen-porten gör det möjligt homogen fördelning av celler och reagenser mellan Multi-Flask lager.

Figur 4A: Bead fördelning i de tre skikten av en 3-lagers Multi-kolven. En suspension av pärlor (3,6 x10 ⁶ / ml) inkom medelstora droppats in Multi-kolvar (pärla suspension: media volymen är 1:10, vol: vol) och blandat, följt av jämvikt och steg-partition använder protokollet beskrivs. Bead koncentrationen återhämtat sig från varje lager (medium pumpas genom hål borrade i varje lager) var läsa på ett Coulter CountER och registreras. Nedan är likvärdiga mellan lager pärla distributioner i 3 - lagers Multi-kolvar (n = 5 flaskor)

Nedan är representativa bilder av Ecopak 2-293 färgningsmönster av celler som odlas till> 80% sammanflödet på 3-lagers Multi-kolvarna i kompletteras tillväxt medier. Cell monolager har fastställts och färgas med kristallviolett och Multi-kolv lager har sedan klippa och bilder som skannats ^(2). Observera cell mönstring var homogent i alla lager av Multi-kolv (Fig.4B). Liknande resultat erhölls med flera celltyper utvärderas (data visas inte).

Figur 4B: Denna siffra visar homogen celltillväxt mellan lager av Multi-kolvar. Ecopak-2 till 293 celler som odlas till> 80% confluence i 3-lagers Multi-Kolvar och T-175 har fastställts och färgas med kristallviolett. Multi-Flask fartyg sänktes och varje färgade lager skannades.

5 Lufttillförsel i Multi-kolv.:

Analys av använt media med BioProfile FLEX analysator ^(3,4) (Nova Biomedical) från EcoPack2-293 celler odlas under 96 timmar visade ingen skillnad i luften mättad av celler odlas i 5-lagers Multi-Kolvar vs T-175 kolvar (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% omgivande O _2).

Figur 5: Air mättnad (% omgivande O ₂₎ av använt medier var likartad i pre-blandteknik från 5-lagers Multi-Kolvar vs T-175 flaskor. EcoPack2-293 celler var seedade vid en densitet på 35.000 celler / cm ² och odlade under 96 timmar före medieanalys (n = 3 flaskor).

Den aktuella studien visar ökningen i produktiviteten som Multi-Flask design erbjuder forskare. Även om det är viktigt att följa stegen ovan för optimal prestanda när du använder Multi-Kolvar, det finns några viktiga steg i detta protokoll som anses vara mest väsentliga. Dessa är (i) blandning av celler och reagenser med mixen hamn inom kärlet (ii) transport av Multi-kolv i 45 ° vinkel medurs Efter partitioneringen vätska i varje lager (iii) om Multi-kolv platt efter uppdelning i inkubator.

Korrekt användning av Multi-kolv leder till produktion av en homogen cellpopulation inom varje fartyg som är odlade i en miljö som är kongruent till T-175 kolvar ^(5). Dessa fartyg ger 3 och 5 gånger fler celler i en liknande fotavtryck som T-175-kolv. Den 3 och 5-lagers fartyg ger 525 och 875cm ² i tillväxtområdet, respektive och erbjuder både utrymme och arbetskraft äravings för användarna. Vävnadskultur Ytbehandling är jämförbar med vanliga flaskor vilket gör att skala upp utan behov av nytt optimera existerande kultur villkor eller att kompromissa med kvalitet, homogenitet eller prestanda av celler ^{(6, 7).} Detta ger också för jämförbarhet med tidigare insamlade data. Dessa fartyg kan också belagd med reagens, exempelvis kollagen, fibronektin, poly-D-lysin för att ge en specialiserad substrat för fastsättning, tillväxt och differentiering av vissa celltyper som hepatocyter ^8, kertainocytes ^9, stamceller odlas i serum-fria medier formuleringar. Beläggning lösningar kan tas bort med minimal kvarvarande vätska retention för att minska slöseriet med värdefull reagenser samt effektiv borttagning av beläggning lösning innan odling celler. Den rekommenderade optimala medievolymen till kultur celler i flera flaskor sortiment från 0,142 till 0,287 ml / cm ² som översätter till 25-50 ml per skikt. Till skillnad från annan flerskiktade kolv, tsin produkt erbjuder en mix-port i fartyget som tillåter snabb på-fartyg blandning samt jämn fördelning av celler och reagenser inom och mellan lager av varje fartyg. Diverse cellinjer, primära kulturer och stamceller har skalats upp effektivt med hjälp av Multi-kolvar. Dessa fartyg är särskilt fördelaktigt i applikationer som kräver ett stort antal celler som i hög genomströmning-screening, vaccintillverkning, virusvektor transfections och cellterapi.

Besparingar i tid, rum, arbete och minskat avfall är viktiga vinster av Multi-Flask kontra traditionella kulturer i ett lager fartyg. Vi kan kulturen ungefär tre gånger antalet celler skördas från 5, T-175 flaskor i samma utrymme med 3, 5-lagers Multi-kolvar. Denna fördel i platsbesparande är inte begränsat bara till T-175 men kan också utvidgas till andra fartyg: en standard rulle flaska apparater som passar i vanliga laboratorium inkubatorer hus ~ 4 ROLler flaskor (2200 ml) som vardera ger 850cm ² yta. I samma område, kan ~ 20, 5-lagers Multi-Kolvar inrymmas vilket ger fem gånger tillväxten ytan till kultur celler. Dessutom med en ökning av "Go-Green" medvetenhet, är alternativ för att minska uppkomsten av avfall mycket önskvärt. I det avseendet finns det en 38% (5, T-175 flaskor väger ~ 640g medan en, 5-lagers Multi-kolv väger ~ 400g) minskning av uppkomsten av avfall med hjälp av Multi-Kolvar jämfört med T-175 flaskor och dessa fördelar att leda att minska under lagring av avfall och kostnaderna för bortskaffande och leda till ekonomiska besparingar för användaren.

Alla författare är anställda av Becton Dickinson, biovetenskaper segment, Discovery Labware Unit.

1. Szabo, S.E., Monroe, S.L., Fiorino, S., Bitzan, J., & Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109 (2004).
2. Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487 (1989).
3. Sengupta, N., Rose, S.T., & Morgan, J.A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83 (2010).
4. Zhu, M.M., Goyal, A., Rank, D.L., & Gupta, S.K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
5. Ryan, J.M., Sharf, B.B., & Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res 91, 389 (2004).
6. Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
7. Sanyal, S., Abraham, E.J, Slater, K., Cai A., Lacey B., Hartshorn C., Flaherty, P., McHugh B., & Qian S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
8. DiPersio, C.M., Jackson, D.A., & Zaret, K.S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405 (1991).
9. Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F.M., Fassler, R., Brakebusch, W.S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303 (2002).

2 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.