監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

Smith, G. S. T., Voyer-Grant, J. A. M., Harauz, G. Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization. J. Vis. Exp. (59), e3422, doi:10.3791/3422 (2012).

中枢神経系は、最終的にニューロンの人口や機能の低下につながる数多くの副作用を持つことがストレスと神経学的侮辱の数を、体験することができます。損傷した軸索は、順番に、アストロサイトやオリゴデンドロサイト^、8,16などのサポートグリア細胞への更なる侮辱と怪我を作り出すことができる細胞外マトリックス、にカリウムやグルタミン酸を含む興奮性分子を解放することができます。侮辱が続く場合は、細胞が十分に確立されたシグナル伝達カスケード¹⁴の数によって調節し、活性化されるプログラム細胞死（アポトーシス）を、受けることになる。アポトーシスと組織の壊死は、外傷性脳損傷、脳虚血、および発作の後に発生する可能性があります。アポトーシス調節の古典的な例としては、システインに依存するアスパラギン酸特異的プロテアーゼ、またはカスパーゼの家族です。カスパーゼを含む活性化プロテアーゼは、慢性的な神経に応答して細胞死に関与しているアルツハイマー病、ハンチントン病、および多発性硬化症^{4、14、3、11、7を}含む変性疾患。

このプロトコルでは、このような高濃度のような別の細胞外ストレスへの暴露後に、不死化N19 -オリゴデンドロサイト（OLG）細胞培養^15、5におけるカスパーゼ-3を介するアポトーシスの割合を測定するためにNucView 488カスパーゼ3基質の使用を記載しカリウムやグルタミン酸。条件付きで不死化N19 - OLGの細胞株は、（O2Aの前駆細胞を表す）博士はアンソニーCampagnoni（神経科学のためのUCLAセメル研究所^）15、5から得られた、と以前にミエリンの遺伝子発現とつながるシグナル伝達の分子メカニズムを研究するために使用されていますOLG分化（例えば^{、6、10）。}我々は、外因性のミエリン塩基性タンパク質（MBP）とトランスフェクションを基準にして堅牢なものになるようにこの細胞株を発見したRFPまたはGFP（赤色または緑色蛍光タンパク質^）13、のどちらかに融合構築12。ここで、N19 - OLG細胞培養は、80 mMの塩化カリウムまたは⁹アポトーシス誘導する細胞外マトリックスへの軸索漏れを模倣する100mMのグルタミン酸ナトリウムのいずれかで処理した。我々は、DEVD（ASP -グルタミン酸- VAL - ASP）カスパーゼ-3認識サブユニットとDNA結合色素^2を含む二官能性カスパーゼ-3基質を使用。基板は、すぐにそれが細胞内のカスパーゼ3により切断される細胞質に入ります。染料、NucView 488が解放され、それがアポトーシスをシグナル伝達、488nmでDNAと蛍光グリーンを結合する細胞核に入る。 NucView 488カスパーゼ3基質を使用すると、リアルタイムの^1、10の生細胞イメージングを可能にする。このビデオでは、我々はまた、不死化N19 - OLGの細胞だけでなく、ライブセルイメージング技術の培養とトランスフェクションについて説明します。

1。解凍と培養細胞

1. 長期的な液体窒素の店から冷凍不死N19 -オリゴデンドログリア細胞の株式を取得する。
2. 細胞懸濁液が完全に融解するまで37℃のウォーターバスを細胞を含む浸しバイアル。
3. 10cmの培養皿に10％FBS（ウシ胎児血清）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEM中の7 mLの（ダルベッコ変法イーグル培地）を追加します。
4. 細胞懸濁液をプレートに滴下し、穏やかに攪拌し、均一に細胞を分散させるためにペトリ皿を揺するを追加。
5. 34 ° C / 5％CO ₂インキュベーターで培養細胞。
6. 4時間後、プレートから吸引メディアは、凍結保護剤として使用されていた残りのDMSO（ジメチルスルホキシド）を削除する、および（10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足した7 mLのDMEM高グルコース培地）を新鮮な培地と交換してください。

2。継代細胞

1. 70から80パーセントで合流点は、（4-7日間の成長）、細胞から培地を吸引除去する。
2. プレートに0.25％トリプシン液1mLを追加。細胞を（約5分）デタッチするピペットトリプシン。
3. 実験条件と通過するための適切な希釈細胞密度劣らずその0.1 × 10 ⁶細胞/ mLで、将来の実験のための追加の10cmのプレートを作る。

注：この実験のためにそれらを使用する前に、融解後の少なくとも二回通過して細胞をしてください。

3。細胞をカウントし、めっき

1. 生細胞イメージングのためのプレートの細胞に、前述のようにトリプシン処理。
2. 細胞の約30μLを削除し、haemocytometerを使用して数える。
3. 6ウェルプレートにコーティングされていないガラスのカバースリップを置きます。 34で10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン、° C / 5％CO ₂を添加した2 mLのフェノールを含まないDMEM高グルコース培地で0.1 × 10 ⁶細胞/ mLの密度、にウェルにセルを追加。
4. 許可34で（16〜20時間）一晩増殖する細胞° C / 5％トランスフェクションの前にCO _2。

4。トランスフェクション

1. 100μLの無血清培地、プラスミドDNAを精製0.5から4μgの、および4μLトランスフェHD（Roche）を組み合わせる。渦は、静かに混和する。
2. 簡潔に再びボルテックスし、室温で5分間複合体にDNAを可能にし、培養細胞に直接トランスフェHDのDNAの混合物を追加。穏やかに混合するためにプレートを傾けて。
3. 34 ° C / 5％、治療前や実験へのCO ₂でさらに48時間培養では細胞。

5。ライブセルイメージングのための準備細胞（LCI）

1. あなたが実験を開始する前に、LCI Chamlide生細胞計測器制御ボックスに少なくとも1時間を切ります。コントロールボックスには、LCI Chamlide内の温度と湿度を調節し、プレミックス、5％CO ₂の流れを調整する。

注：これは、にお勧めですステージ全体が34に達することを保証するために実験を開始する前に、最大3時間までコントロールボックスをオンに℃をこのステップは、撮像中に、それは温めとしてfluxulationと金属のステージの熱膨張によって引き起こされる焦点ドリフトを、減らすことができます。

2. フローフードでの作業、70％エタノールで、Chamlide磁気型培養チャンバー、およびピンセットをスプレーし、それらを5分間乾燥させます。
3. インキュベーターから細胞を取り出して、それらが健康であることを確認してください。彼らは、接着表示され、多数の膜プロセスとカバーガラスでよく広げてください。トランスフェクションから強調している細胞は、実験には適していない、およびプロセスの拡張子の数を減らす必要があります、としばしば不規則な形状の核を持っている。
4. 6 - ウェルプレートを傾けて、ピンセットでカバーを取り外します。迅速に培養チャンバーの底板にカバーガラスの細胞の側を上に置きます。カバースリップを乾燥させないでください。
5. 磁気メインを取り付けます培養チャンバーの本体とカバースリップの上にオリジナルの6ウェルプレートから培地を500μLを加える。再使用してこのメ​​ディアは、環境の変化によって引き起こされる細胞にかかる負荷の量を減少し、また、細胞外分泌因子を評価するのに役立ちます。
6. 培養チャンバーのガラスカバーを置きます。
7. 顕微鏡と干渉するカバーの底からの残留物質を除去するために70％エタノールでスプレーキムワイプを、使用してください。
8. 34に培養チャンバーを配置° C / 5％CO ₂インキュベーターで30分間。このステップでは、チャンバー自体が金属のウォームアップとして° Cはカバースリップのシフト減らすために34に温まることが保証されます。

6。顕微鏡の設定

画像は複数の車輪のカートリッジのロードのためにカスタムのリレーレンズと発光フィルターホイールハウジングとライカDMIRE2倒立顕微鏡を使用して、ここで取得しました（クォーラムTechnologies社、Guelph、ON）。

1. 明視野 - 240ミリ秒〜2.5 Vと露光時間のランプのセット。
2. 赤色蛍光タンパク質（RFP） - 200ミリ秒140で設定されたゲイン。
3. 緑色蛍光タンパク質（GFP） - ゲインは500 ms、140に設定。
4. 当社の顕微鏡は、調光可能なランプではなく、細胞に利用できる光の量を制御するための回転ディスクを持っています。我々は、ランプの最大強度の90％の光を私たちの実験を実行する。

7。アポトーシス誘導因子とNucView 488カスパーゼ3基質と細胞の治療

1. 濃度は、実験間の一貫になるように、前もって時間のアポトーシス誘導剤の大規模な在庫を準備し、アリコートでそれらを凍結することが重要です。
2. NucView 488基板は、光に敏感です。アルミ箔で覆われ、-20℃で凍結/解凍、およびストアチューブを減らすために15μLのアリコートを準備します。 NucVの露出を減らすために可能な限り低い周囲の部屋の照明で働くiew 488基板は、その使用前に、点灯する。
3. 細胞が温度の減少にさらされないようにすぐにインキュベーターから培養チャンバーを取得します。顕微鏡の環境室に培養チャンバーを配置し、移動から培養チャンバーを維持するためにクランプを使用してください。この時点で、部屋の照明を落とすこともすべき。
4. デュアルレギュレータ、5％混合CO ₂タンクをオンにします。
5. 10倍対物レンズを用いて、明視野顕微鏡を使用してコンピュータのモニタ上で細胞を見つけるために焦点を当てる。 メモ ：露光時間を減らすために所望の倍率で客観的で最大の開口数を使用するとよいでしょう。
6. 細胞（私たちのケース80mMのカリウム、または100 mMのグルタミン酸で）にアポトーシスの誘導を実現する、次のいずれかの方法を使用することができます。私たちは、典型的な培養培地で10倍濃縮液として溶存KClを用いて、例として、80mMのカリウムの配信を使用します。
   1. メディア交換BYが遅いとローカル潅流：
      - 80 mMリン酸カリウムを含む新しい培地で培養チャンバーにメディアを交換する蠕動ポンプを使用してください。
      - チューブの一端には、フェノールを含まないDMEMに溶解した80mMのカリウムの株式を10 mLをお届けします、、チューブのもう一方の端は、チャンバーからメディアを削除します。
      - あなたは、チャンバー内に残っているメディアは、カリウムの正しい濃度を持っていることを保証するためにメディアの少なくとも10倍の交換をしたい。
      -メディアが交換された後、チャンバー内のメディアにNucView 488基板の3μLを加える。ミックスするピペット。
   2. 80mMのK ⁺および培養チャンバー内のメディアへNucView 488基板の直接添加する 。
      - フェノールを含まないDMEMに溶解した80mMのカリウムの10倍のストック溶液を調製する。
      - 10倍の80mMのカリウムの50μLにNucView 488基板の3μLを加える。ミックスするピペット。培養チャンバーに500μLのフェノールを含まないDMEMに追加します。
      注：この方法はあなたが成長または元のメディアに存在するかもしれない他の分泌因子を維持したり、評価する上で興味があれば望ましい。我々はNucView 488基板は限り36時間を持続させる実験のために細胞培養で安定していることを発見した

8。ライブセルイメージング

1. トランスフェクションされた細胞を表示するには、赤チャンネルをクリックしてください。
2. 選択して、いくつかのトランスフェクションされた細胞が存在するダースのフレームの周りに保存し、これらの"XYステージのポイントを"保存。コンピュータのメモリの量によっては、あなたが取得できるようになるステージのポイントの数に制限される場合があります。
3. これらの保存された段階で、顕微鏡のキャプチャ画像（明視野、赤チャンネル、緑チャンネルに）持っていることは、すべての6分を指しています。
4. 実験の初期段階で表示されている緑色の染色は、おそらくすでに通常トランスフェクションおよび/または環境ストレスによるアポトーシスを、受けている細胞を示す。 Apopt実験的な治療に起因するOSISは実験の後のタイムポイントで検出されます。

9。統計的分析

1. 各実験では、我々は効率的に大きなデータセットを収集するために複数のXYポイントを獲得するために顕微鏡をプログラムする。各実験は、重複または三重に実行され、データが異なる日に行わ別々の実験からコンパイルされます。各データセットから、我々は、ビューの15のフィールドまで分析して、カスパーゼ陽性細胞（ビュー/カスパーゼ陽性細胞の総数のフィールド内のセルの合計数）にカスパーゼ陰性細胞の比率を比較する。

2. 各データセットから記録された測定は、より大きなサンプルのセットにグループ化され、そして、1つANOVA表（P = 0.05）を使って他と比較されます。我々は、各実験の平均値（SEM）の標準誤差を示し、次にWHを決定するためにテューキーの方法の比較試験（P = 0.05）を実行することで、平均の差を比較するICHの治療法は、互いに大きく異なっている。

10。代表的な結果

我々はNucView 488基板は高い細胞外カリウム濃度と治療後のN19 - OLG細胞培養のアポトーシスの増加率を示すことができる方法を示すために実験を記載している。 N19 -細胞はRFPでトランスフェクトした、とのどちらか3μLNucView 488基板（コントロール）、または3μLNucView 488基板と80mMの[K ^+]（治療）で処理した。細胞は、モニターし、画像は神経傷害（ 図1A）を対象とした研究に適している12時間の時間経過、以上を取得した。コントロール条件では、80 mMのと比較してアポトーシスを大量に観察されなかった[K ^+] 12時間（ 図1B）の後に約45％の細胞死を示した処理培養物（ハッシュ化されたボックス）、。背景の緑色の信号が観察制御条件のdは、細胞外カリウムを添加することなくアポトーシスを受けている細胞を示す。他の状況での実験が長く実行するために必要なことかもしれないが、12時間の時点で対照実験の展示アポトーシスにおける細胞の事実上どれも、。画像は10倍対物レンズを用いて取得しました。バー= 100μmの。

図1。 （A）N19 OLGの文化の12時間のタイムコース実験を48時間トランスフェクション後NucView 488基板（グリーンチャンネル）の3μLと一緒にRFP - MBPを（赤チャンネル）を発現する。培養物は、いずれの80mMの[K ^+]（左パネル）、またはコントロール（右パネル）などの無治療の最終濃度で処理した。画像は6分間隔で取得され、そして切断されたカスパーゼ-3（緑信号）の有意な活性化は観察することができますD 80 mmに処理した培養物の[K ^+]対照実験と比較して細胞核（ハッシュ化されたボックス）内で。によって、ビューのフィールド内のセルの合計数を割ることによって計算された、切断されたカスパーゼ-3の細胞（の（B）の割合カスパーゼ陽性細胞の合計数）。条件を制御するための比較では、我々はKで12時間で⁺ -治療後の約45％の細胞死を観察

Sビデオ（1）N19 - OLGの文化の12時間のタイムコース実験48時間明視野像と三方と一緒に、NucView 488基板の3μL（グリーンチャンネル）でRFP - MBP（赤チャンネル）を発現するトランスフェクション後マージされた画像、80mMのでは、次の治療[K ^+]。

Sビデオ（2）N19 - OLGの文化の12時間のタイムコース実験48時間明視野IMAGとともにNucView 488基板（グリーンチャンネル）の3μLとRFP - MBPを（赤チャンネル）を発現するトランスフェクション後、ESとスリーウェイマージされた画像。何の治療は、文化に適用されていないとN19 - OLGsは、80mMの[K ^+]（Sビデオ1と比較）で処理した細胞培養とは対照的に顕微鏡のフィールドを介しての移行を見ることができます。

これはアポトーシスの検出に使用できる唯一の蛍光製品ではありませんが、NucView 488基板を使用するいくつかの重要な利点があります。主な利点のひとつは、大部分の代替製品はどちらの細胞溶解を必要とするか、悪い細胞の透過性を持っているのに対し、リアルタイムで生きた細胞のアポトーシスをフォローする機能です。他の利点は、カスパーゼ-3の認識、高い細胞透過性、低細胞毒性、およびアポトーシスの進行との干渉のための高感度が含まれています。それが切断されるとバックグラウンドの蛍光を除去する核を、入るまで、基板はまた、低バックグラウンドの蛍光を持っています。カスパーゼ-3認識配列は、3つの負電荷とDNA結合色素が含まれていますつの正電荷^2を持っています。 DEVD - NucView 488分子は、このようにカスパーゼがアクティブでない細胞のDNAに色素の活性化との結合を防止する正味の負電荷を持っています。

MA実験間のintaining一貫性が複製の間に意味のある比較を描画できるようにするためです。それがトランスフェクションの速度に影響を与えるとしての一貫性を保つために主なパラメータの一つは、細胞密度です。不死N19 - OLG細胞培養で高いトランスフェクション率を得ることが我々の経験^12、13に、このようなHeLa細胞またはHEK293など、他の一般的な細胞株と比べてより困難である、と密度に大きく依存している。これらの細胞のための私達の最高のトランスフェクション効率は、トランスフェHD（ロシュ）で取得し、通常は約15％ですが、構造に応じて、30％以上に到達することができますされています。慎重な細胞計数は、一貫性のあるトランスフェクション率を得ることに役立ちます。アポトーシスのレートを測定する場合は特に、さまざまな治療法から環境ストレスの同程度に細胞を公開することも重要です。特に、細胞をトランスフェクション試薬にさらされている時間の長さ、または光暴露量は、重要な環境変数です。ablesは考慮して、実験に渡って一定に保持する必要があります。私たちのアプリケーションの場合、我々はフィールドオブビューの多数を収集する統計的に有意な比較を行うために十分に大きなサンプルサイズを提供することを発見した[ 同上 ]。

著者らは開示する利害の衝突を持ちません。

この研究室は、保健研究、カナダ自然科学工学研究評議会、およびカナダの多発性硬化症協会（MSSC）のカナダの協会によって支えられてきた。 GSTSはMSSCから博士課程学生の身分の受け手だった。我々は、この原稿で多くの有用な議論とコメントの博士ジョアンボッグス（小児病院、トロント）に感謝しています。我々は、追加のNucView 488カスパーゼ3の彼らの寛大な贈り物用Biotiumに感謝しています。

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