निगरानी Cleaved गतिविधि कस्पासे 3 और अमर Oligodendroglial पोटेशियम प्रेरित झिल्ली विध्रुवण के बाद लाइव सेल इमेजिंग और Cleaveable Fluorogenic डाई Substrates का उपयोग कर कक्ष के Apoptosis

Smith, G. S. T., Voyer-Grant, J. A. M., Harauz, G. Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization. J. Vis. Exp. (59), e3422, doi:10.3791/3422 (2012).

1. विगलन और संवर्धन कक्ष

1. लंबी अवधि तरल नाइट्रोजन स्टोर से जमे हुए अमर N19 oligodendroglial कोशिकाओं का जायजा प्राप्त करते हैं.
2. विसर्जित कर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं से युक्त शीशी सेल निलंबन तक पूरी तरह thawed है.
3. उच्च शर्करा 10% (भ्रूण गोजातीय सीरम) FBS और 1% पेनिसिलिन / एक 10 सेमी संस्कृति की थाली स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक के साथ DMEM के 7 एमएल (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) जोड़ें.
4. सेल निलंबन थाली करने के लिए ड्रॉप - बुद्धिमान, और धीरे आंदोलन और पेट्री प्लेट रॉक करने के लिए कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने में जोड़ें.
5. 34 ° सी / 5% सीओ ₂ इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिकाओं.
6. बाद 4 घंटे, प्लेटों से महाप्राण (व्यंजन) मीडिया के किसी भी शेष DMSO (डाइमिथाइल sulphoxide) है कि एक cryoprotectant के रूप में इस्तेमाल किया गया था निकालने के लिए, और ताजा मीडिया (7 एमएल DMEM उच्च ग्लूकोज 10% FBS के साथ पूरक मीडिया और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ जगह .

2. Passaging कक्ष

1. 70-80%संगम (4-7 दिन विकास), कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण (व्यंजन).
2. थाली करने के लिए 0.25% की एक एमएल trypsin जोड़ें. पिपेट trypsin कोशिकाओं (5 मिनट के बारे में) को अलग करने के लिए.
3. प्रयोगात्मक शर्तों और पारित करने के लिए उपयुक्त एक सेल घनत्व है कि कम कोई 0.1 x 10 ⁶ कोशिकाओं एमएल / भविष्य प्रयोगों के लिए एक अतिरिक्त 10 सेमी थाली dilutions बनाओ.

नोट: आप उन्हें प्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले विगलन के बाद अपने कोशिकाओं को कम से कम दो बार पारित होने चाहिए.

3. गिनती और चढ़ाना कक्ष

1. जीना सेल इमेजिंग के लिए थाली की कोशिकाओं के लिए trypsinize, के रूप में पहले से वर्णित है.
2. कोशिकाओं के लगभग 30 μL निकालें और एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग गिनती.
3. एक uncoated 6 अच्छी तरह से थाली में कांच coverslip रखें. अच्छी तरह से करने के लिए 2 एमएल phenol मुक्त DMEM उच्च ग्लूकोज मीडिया में 0.1 x 10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व, 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 34 °% / 5 सी सीओ ₂ के साथ पूरक कोशिकाओं जोड़ें.
4. अनुमति दें34 पर रातोंरात (16-20 घंटे) बढ़ने कोशिकाओं ° / 5 सी अभिकर्मक पहले सीओ _2%.

4. अभिकर्मक

1. 100 μL सीरम मुक्त मीडिया, 0.5-4 μg प्लास्मिड डीएनए, और 4 μL FuGENE HD (Roche) शुद्ध मिश्रण. भंवर धीरे मिश्रण करने के लिए.
2. फिर संक्षेप में भंवर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डीएनए परिसर में, और फिर सीधे संवर्धित कोशिकाओं FuGENE एच.डी. डीएनए मिश्रण जोड़ने की अनुमति है. धीरे मिश्रण करने के लिए थाली झुकाएँ.
3. संस्कृति पर एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए 34 °% / 5 _सी 2 उपचार या प्रयोग करने से पहले सीओ कोशिकाओं .

5. लाइव सेल इमेजिंग के लिए तैयारी कक्ष (LCI)

1. LCI Chamlide साधन रहने कक्ष नियंत्रण बॉक्स पर कम से कम 1 घंटे मुड़ें इससे पहले कि आप अपना प्रयोग शुरू करना चाहते हैं. नियंत्रण बॉक्स भी LCI Chamlide के भीतर तापमान और नमी को नियंत्रित करता है, _{और premixed} 5% सीओ 2 के प्रवाह को नियंत्रित करता है.

नोट: यह सलाह दी जाती है3 घंटे पहले बॉक्स नियंत्रण पर बारी शुरुआत प्रयोगों को सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे चरण में 34 डिग्री सेल्सियस तक पहुँचता है इस कदम के लिए इमेजिंग के दौरान फोकल बहाव, जो fluxulation और धातु चरण के थर्मल विस्तार की वजह से है के रूप में इसे warms, कम हो जाएगा.

2. एक प्रवाह हुड में कार्य करना, Chamlide चुंबकीय प्रकार संस्कृति कक्ष स्प्रे, और चिमटी, 70% इथेनॉल के साथ और उन्हें 5 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति.
3. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और पुष्टि करते हैं कि वे स्वस्थ हैं. वे पक्षपाती दिखाई और अच्छी तरह से कई झिल्ली प्रक्रियाओं के साथ कांच coverslip पर फैल चाहिए. कक्ष अभिकर्मक से जोर दिया जाता है प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं और प्रक्रिया एक्सटेंशन के एक कम संख्या में होगा, और अक्सर एक अनियमित आकार नाभिक है.
4. 6 - अच्छी तरह से थाली झुकाएँ और चिमटी के साथ coverslip निकालें. जल्दी संस्कृति कक्ष के नीचे थाली में coverslip सेल की ओर जगह है. Coverslip शुष्क करने की अनुमति नहीं है.
5. चुंबकीय मुख्य संलग्नसंस्कृति चैम्बर के शरीर और coverslip के शीर्ष पर मूल प्लेट 6 अच्छी तरह से मीडिया के 500 μL जोड़ने. पुनः उपयोग इस मीडिया पर्यावरण परिवर्तन के कारण कोशिकाओं पर रखा तनाव की राशि कम है, और भी कोशिकी secreted कारकों का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
6. संस्कृति कक्ष पर गिलास को कवर रखें.
7. Coverslip के नीचे से किसी भी अवशिष्ट सामग्री हटाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव KimWipe है, जो माइक्रोस्कोपी के साथ हस्तक्षेप करेगा का उपयोग करें.
8. 34 में संस्कृति कक्ष प्लेस ° 30 मिनट के लिए सी / 5% _सीओ 2 इनक्यूबेटर . यह कदम यह सुनिश्चित करेंगे कि कक्ष ही 34 warms ° सी coverslip के स्थानांतरण को कम करने के रूप में धातु ऊपर warms.

6. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स

छवियाँ यहाँ से हासिल किया गया एक कस्टम रिले लेंस और कई पहियों के कारतूस लोड करने के लिए उत्सर्जन फिल्टर पहिया आवास (कोरम टेक्नोलॉजीज इंक, जी के साथ एक Leica DMIRE2 उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोगuelph, पर).

1. Brightfield लैंप - 2.5 वी और 240 एमएस के लिए समय जोखिम करने के लिए सेट.
2. लाल प्रतिदीप्त प्रोटीन - लाभ (आरएफपी) 200 एमएस के लिए 140 पर सेट है.
3. ग्रीन प्रतिदीप्त प्रोटीन (GFP) - लाभ 500 एमएस के लिए 140 पर सेट है.
4. हमारा खुर्दबीन एक कताई डिस्क के बजाय एक dimmable दीपक कोशिकाओं के लिए उपलब्ध प्रकाश की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए है. हम प्रकाश के साथ अधिकतम दीपक तीव्रता के 90% पर हमारे प्रयोगों चलाते हैं.

7. Apoptosis inducers और प्रकोष्ठों के NucView 488 कस्पासे 3 सब्सट्रेट के साथ उपचार

1. यह महत्वपूर्ण है समय से आगे apoptosis inducers के बड़े भंडार तैयार करने और उन्हें aliquots में फ्रीज, ताकि सांद्रता प्रयोगों के बीच अनुरूप हो जाएगा.
2. NucView 488 सब्सट्रेट प्रकाश के प्रति संवेदनशील है. -20 डिग्री सी एल्यूमीनियम पन्नी में कवर में / फ्रीज विगलन, दुकान और ट्यूबों कम 15 μL की aliquots तैयार. परिवेश कमरे के रूप में संभव के रूप में कम प्रकाश के साथ कार्य करने के लिए NucV के जोखिम को कमiew 488 सब्सट्रेट, इसके उपयोग से पहले प्रकाश में.
3. संस्कृति कक्ष जल्दी इनक्यूबेटर से इतना है कि कोशिकाओं को तापमान में कमी के लिए नहीं उजागर कर रहे हैं पुनर्प्राप्त. खुर्दबीन के पर्यावरण कक्ष पर संस्कृति कक्ष प्लेस, और clamps का उपयोग करने के लिए जाने से संस्कृति कक्ष रखना. इस बिंदु पर आप भी मंद कमरा रोशनी चाहिए.
4. दोहरी नियामक के साथ 5% premixed सीओ ₂ टैंक पर मुड़ें.
5. 10x उद्देश्य का प्रयोग, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कंप्यूटर मॉनीटर पर कोशिकाओं को खोजने ध्यान केंद्रित नोट: आप इच्छित आवर्धन के साथ सबसे बड़ा उद्देश्य पर संख्यात्मक एपर्चर का उपयोग करने के लिए समय जोखिम को कम करना चाहते हैं.
6. कोशिकाओं (हमारे मामले में 80 मिमी, पोटेशियम या 100 मिमी ग्लूटामेट में) के apoptosis के inducers उद्धार के लिए, निम्न विधियों में से इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक उदाहरण के रूप में 80 मिमी पोटेशियम के वितरण का उपयोग करें, हमारे ठेठ संस्कृति मीडिया में एक 10x ध्यान केंद्रित के रूप में भंग KCl का उपयोग करेंगे.
   1. मीडिया मुद्रा खy धीमी और स्थानीय छिड़काव:
      - नए 80 मिमी पोटेशियम युक्त मीडिया के साथ संस्कृति कक्ष में मुद्रा मीडिया के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का प्रयोग करें.
      - टयूबिंग की एक छोर 80 मिमी phenol मुक्त DMEM में भंग पोटेशियम का एक शेयर के 10 एमएल, और टयूबिंग के दूसरे छोर देने के कक्ष से मीडिया को दूर करेंगे.
      - तुम कम से कम मीडिया के एक 10x विनिमय करने के लिए सुनिश्चित करें कि कक्ष में छोड़ दिया मीडिया पोटेशियम का सही एकाग्रता है चाहता हूँ.
      - के बाद मीडिया का आदान - प्रदान है, कक्ष में मीडिया को NucView 488 सब्सट्रेट के 3 μL जोड़ने. मिश्रण पिपेट.
   2. 80 मिमी कश्मीर ⁺ और ​​संस्कृति कक्ष में मीडिया को 488 सब्सट्रेट NucView के प्रत्यक्ष इसके अलावा :
      - Phenol मुक्त DMEM में भंग 80 मिमी पोटेशियम का एक 10x स्टॉक समाधान तैयार करें.
      10x 80 मिमी पोटेशियम के 50 μL NucView 488 सब्सट्रेट के 3 μL जोड़ें. मिश्रण पिपेट. संस्कृति कक्ष में 500 μL phenol मुक्त DMEM जोड़ें.
      नोट: इस विधि हैपसंदीदा यदि आप बनाए रखने या विकास या अन्य secreted कारक है कि मूल मीडिया में मौजूद हो सकता है का आकलन करने में रुचि रखते हैं. हमने पाया है कि NucView 488 सेल संस्कृति में सब्सट्रेट के रूप में लंबे समय के रूप में 36 एच. स्थायी प्रयोगों के लिए स्थिर है

8. लाइव सेल इमेजिंग

1. लाल चैनल पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं प्रदर्शित करने के लिए क्लिक करें.
2. जहां वहाँ कई ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं रहे हैं एक दर्जन फ्रेम के चारों ओर का चयन करें और बचाने, और इन "XY मंच अंक बचाने के. कंप्यूटर स्मृति की मात्रा पर निर्भर करता है, तो आप चरण अंकों की संख्या है कि आप को प्राप्त करने में सक्षम हो जाएगा करने के लिए सीमित किया जा सकता है.
3. इन बचाया मंच पर माइक्रोस्कोप छवियों पर कब्जा उज्ज्वल मैदान, लाल चैनल, और हरे चैनल में हर 6 मिनट में अंक.
4. कोई हरे रंग धुंधला हो जाना है कि प्रयोगों के प्रारंभिक चरणों के दौरान दिखाई देता है की संभावना कोशिकाओं कारण आमतौर पर अभिकर्मक और / या पर्यावरणीय तनाव के लिए कि पहले से ही apoptosis के दौर से गुजर रहे हैं, इंगित करता है. Apoptप्रयोगात्मक उपचार के कारण osis प्रयोग में बाद timepoint में पता लगाया जाएगा.

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

1. प्रत्येक प्रयोग के लिए, हम खुर्दबीन के लिए एकाधिक XY अंक प्राप्त करने के लिए एक बड़ी कुशलता से सेट डेटा इकट्ठा कार्यक्रम. डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में प्रत्येक प्रयोग किया जाता है, और अलग अलग दिनों पर प्रदर्शन प्रयोगों से डेटा संकलित कर रहे हैं. प्रत्येक डेटा सेट से, हम देखने के 15 क्षेत्रों के लिए विश्लेषण और कस्पासे पॉजिटिव कोशिकाओं (दृश्य / कस्पासे पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या के क्षेत्र में कक्षों की कुल संख्या) कस्पासे नकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात की तुलना.

2. प्रत्येक डेटा सेट से दर्ज की माप एक बड़ा नमूना सेट में वर्गीकृत कर रहे हैं, और हैं तो एक एक एनोवा तालिका (पी = 0.05) का उपयोग करते हुए एक अन्य की तुलना में. हम प्रत्येक प्रयोग के मतलब (SEM) के मानक त्रुटियों को दिखाने के लिए, और फिर एक Tukey का मतलब है की तुलना परीक्षण (पी = 0.05) का प्रदर्शन क निर्धारित द्वारा अर्थ में अंतर की तुलनाआईसीएच उपचार एक दूसरे से काफी अलग हैं.

10. प्रतिनिधि परिणाम

हम एक प्रयोग वर्णन कैसे NucView 488 सब्सट्रेट N19-OLG सेल संस्कृतियों की एक apoptosis की वृद्धि दर एक उच्च कोशिकी पोटेशियम एकाग्रता के साथ एक इलाज के बाद संकेत कर सकते हैं वर्णित है. N19 कोशिकाओं आरएफपी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, और या तो 3 μL NucView 488 (नियंत्रण) सब्सट्रेट, या 3 μL NucView 488 सब्सट्रेट और 80 मिमी के साथ ^इलाज किया गया [+ K (उपचार). कक्ष निगरानी और छवियों को एक 12 घंटे समय बेशक, जो स्नायविक अपमान (चित्र 1 ए) शामिल अध्ययन के लिए पर्याप्त है पर हासिल किया गया. नियंत्रण परिस्थितियों में, हम 80 मिमी की तुलना में apoptosis के महत्वपूर्ण मात्रा का पालन नहीं किया [कश्मीर ^+] इलाज संस्कृतियों (hashed बॉक्स) है, जो 12 घंटे (चित्रा 1 बी) के बाद लगभग 45% कोशिका मृत्यु से पता चला है. पृष्ठभूमि हरी झंडी का निरीक्षणनियंत्रण की स्थिति में कोशिकाओं है कि कोशिकी पोटेशियम के अलावा बिना apoptosis के दौर से गुजर रहे हैं इंगित करता है. 12 घंटे समय बिंदु से नियंत्रण प्रयोग एक्ज़िबिट apoptosis में कक्षों की लगभग कोई नहीं, हालांकि अन्य स्थितियों में प्रयोग करने के लिए लंबे समय तक चलाने के लिए आवश्यक हो सकता है. छवियाँ एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर हासिल किया गया. बार = 100 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 1. (ए) 12 N19 OLG संस्कृतियों के घंटे समय पाठ्यक्रम प्रयोग 48 घंटे बाद अभिकर्मक NucView 488 सब्सट्रेट (ग्रीन चैनल) के 3 μL साथ आरएफपी - MBP (लाल चैनल) व्यक्त. संस्कृतियों या तो 80 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के साथ इलाज किया गया ^[+ K (बाएं पैनल), या एक नियंत्रण (सही पैनल) के रूप में कोई इलाज है. छवियाँ 6 मिनट अंतराल पर हासिल किया गया है, और cleaved कस्पासे 3 महत्वपूर्ण सक्रियण (हरी झंडी) का निरीक्षण किया जा सकता हैघ 80 मिमी के साथ इलाज किया संस्कृतियों में ^[+ K] नियंत्रण प्रयोग करने के लिए तुलना में सेल नाभिक (hashed बॉक्स) के भीतर है. (बी) cleaved कस्पासे-3 कोशिकाओं (देखने के क्षेत्र में कक्षों की कुल संख्या को विभाजित करके गणना की प्रतिशतता कस्पासे पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या). शर्तों नियंत्रण की तुलना में, हम चारों ओर ^देखा + 12 एच. द्वारा उपचार कश्मीर के बाद 45% कोशिका मृत्यु

1 sVideo N19-OLG संस्कृतियों के एक 12 घंटे समय बेशक प्रयोग 48 NucView 488 सब्सट्रेट के 3 μL (ग्रीन चैनल) के साथ आरएफपी MBP (लाल चैनल) व्यक्त, उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और एक तीन तरह के साथ के बाद अभिकर्मक घंटे मर्ज किए गए छवि, 80 मिमी के साथ इलाज के बाद ^[+ K ]

2 sVideo N19-OLG संस्कृतियों के एक 12 घंटे का समय बेशक प्रयोग 48 घंटे 3 NucView 488 सब्सट्रेट के μL (ग्रीन चैनल) के साथ आरएफपी - MBP (लाल चैनल) व्यक्त बाद अभिकर्मक, उज्ज्वल मैदान imag के साथ साथes और एक तीन तरह विलय छवि. कोई इलाज संस्कृतियों के लिए लागू किया गया था और N19-OLGs सेल संस्कृतियों 80 मिमी के साथ इलाज के लिए इसके विपरीत में खुर्दबीन क्षेत्र के माध्यम से पलायन देखा जा ^सकता है है [+ K (1 sVideo के साथ तुलना).

हालांकि यह केवल fluorogenic apoptosis का पता लगाने के लिए उत्पाद उपलब्ध नहीं है, वहाँ NucView 488 सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं. एक मुख्य लाभ की क्षमता वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं में apoptosis का पालन करें, जबकि सबसे वैकल्पिक उत्पादों या तो सेल lysis की आवश्यकता होती है या गरीब सेल पारगम्यता है है. अन्य लाभों में मान्यता कस्पासे-3, उच्च सेल पारगम्यता, कम cytotoxicity, और apoptosis की प्रगति के साथ कोई हस्तक्षेप के लिए उच्च संवेदनशीलता शामिल हैं. सब्सट्रेट भी कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है जब तक यह cleaved है और नाभिक, जो पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति समाप्त प्रवेश करती है. कस्पासे-3 मान्यता अनुक्रम 3 नकारात्मक आरोप शामिल है और डीएनए बाध्यकारी डाई एक सकारात्मक चार्ज ² है. DEVD - NucView 488 अणु इस प्रकार एक शुद्ध नकारात्मक चार्ज है, जो कोशिकाओं जहाँ कस्पासे सक्रिय नहीं है में डीएनए के लिए सक्रियण और डाई के बाध्यकारी रोकता है.

माप्रयोगों के बीच intaining स्थिरता प्रतिकृति के बीच सार्थक तुलना आकर्षित करने में सक्षम होना आवश्यक है. मुख्य मापदंडों के अनुरूप रखने के एक सेल घनत्व है, क्योंकि यह अभिकर्मक की दर को प्रभावित करता है. में उच्च अभिकर्मक दर प्राप्त करने के अमर N19 सेल संस्कृतियों OLG HeLa या HEK293 जैसे अन्य आम सेल लाइनों के साथ की तुलना में अधिक मुश्किल है, ^{और हमारे अनुभव} 12, 13 में उच्च घनत्व पर निर्भर है. इन कोशिकाओं के लिए हमारी सबसे अच्छी अभिकर्मक क्षमता Fugene HD (Roche) के साथ प्राप्त किया गया है और सामान्य रूप के बारे में 15% कर रहे हैं, लेकिन 30% से अधिक का निर्माण पर निर्भर करता है तक पहुँच सकते हैं. सावधानी से सेल गिनती अनुरूप अभिकर्मक दरों प्राप्त करने में सहायता करेगा. यह भी महत्वपूर्ण है पर्यावरण तनाव का एक ही डिग्री करने के लिए विभिन्न उपचार से कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए, खासकर जब apoptosis की दर को मापने. विशेष रूप से, समय की लंबाई, जिस पर कोशिकाओं अभिकर्मक अभिकर्मकों, या प्रकाश जोखिम की राशि को उजागर कर रहे हैं महत्वपूर्ण पर्यावरणीय variables विचार करना है, और प्रयोगों भर में स्थिर रहना चाहिए. हमारे अनुप्रयोगों के लिए, हमने पाया है कि क्षेत्रों के देखने की एक बड़ी संख्या में एकत्रित सांख्यिकीय महत्वपूर्ण तुलना करने के लिए एक पर्याप्त बड़ी नमूना आकार प्रदान करने के लिए [ इबिद]

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष करने के लिए खुलासा किया है.

इस प्रयोगशाला में कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान, प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल, और कनाडा (MSSC) के मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया है. GSTS MSSC से डॉक्टरेट छात्रावस्था के प्राप्तकर्ता था. हम इस पांडुलिपि पर कई उपयोगी और चर्चा टिप्पणियों के लिए डॉ. Joan Boggs (अस्पताल बीमार बच्चे, टोरंटो के लिए) के लिए आभारी हैं. हम उनके उदार उपहार के लिए अतिरिक्त 488 NucView कस्पासे-3 Biotium के लिए आभारी हैं .

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