Overvåking kløyvde caspase-3 Aktivitet og Apoptose av udødeliggjort Oligodendroglial Cells bruker Live-cell Imaging og Cleaveable Fluorogenic-dye Underlag Etter Kalium-indusert Membrane depolarisering

Smith, G. S. T., Voyer-Grant, J. A. M., Harauz, G. Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization. J. Vis. Exp. (59), e3422, doi:10.3791/3422 (2012).

Det sentrale nervesystemet kan oppleve en rekke påkjenninger og nevrologiske fornærmelser, som kan ha en rekke negative effekter som til slutt fører til en reduksjon i neuronal befolkning og funksjon. Skadede axons kan slippe eksitatoriske molekyler, inkludert kalium eller glutamat i ekstracellulær matrix, som igjen kan produsere ytterligere fornærmelse og skade på støtte glial celler, inkludert astrocytes og oligodendrocytes ^{8, 16.} Hvis fornærmelse vedvarer, vil celler gjennomgå programmert celledød (apoptose), som er regulert og aktiveres av en rekke godt etablerte signal transduksjon kaskader ^14. Apoptose og vevsnekrose kan oppstå etter traumatisk hjerneskade, cerebral iskemi, og beslag. Et klassisk eksempel av apoptotiske regulering er familien til cystein-avhengige aspartat-rettet proteaser eller caspases. Aktivert proteaser inkludert caspases har også vært innblandet i celledød i respons til kronisk nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers, Huntingtons, og Multippel sklerose ^{4, 14, 3, 11, 7.}

I denne protokollen beskriver vi bruk av NucView 488 caspase-3 substrat å måle frekvensen av caspase-3 mediert apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte (OLG) cellekulturer ^{15, 5,} etter eksponering for ulike ekstracellulære påkjenninger som for eksempel høye konsentrasjoner av kalium eller glutamat. Den betinget-udødeliggjort N19-OLG cellelinje (representerer O2a stamfar) ble hentet fra Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) ^{15, 5,} og har tidligere blitt brukt til å studere molekylære mekanismer av myelin genuttrykk og signaltransduksjon ledende til OLG differensiering ^{(6 f.eks, 10).} Vi har funnet denne cellelinje til å være robust med hensyn til transfeksjon med eksogen myelin grunnleggende protein (MBP) konstruerer smeltet sammen til enten RFP eller GFP (rød eller grønn fluorescerende protein) ^13,12. Her ble N19-OLG cellekulturer behandlet med enten 80 mm kaliumklorid eller 100 mm natrium glutamat å etterligne aksonal lekkasje inn i ekstracellulære matrix å indusere apoptose ^9. Vi brukte en bi-funksjonell caspase-3 substrat som inneholder en devd (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 anerkjennelse subenheten og et DNA-bindende dye ^2. Underlaget går fort cytoplasma der det spaltes av intracellulære caspase-3. Fargestoff, 488 NucView frigjøres og kommer inn i cellekjernen der det binder DNA og fluoresces grønt ved 488 nm, signalering apoptose. Bruk av NucView 488 caspase-3 substrat muliggjør for live-cell imaging i sanntid ^{1, 10.} I denne videoen, vi også beskrive dyrking og transfeksjon av udødeliggjort N19-OLG celler, samt live-cell imaging teknikker.

1. Tining og dyrking Celler

1. Skaffe lager av frossen udødeliggjort N19-oligodendroglial celler fra langsiktig flytende nitrogen butikker.
2. Fordyp hetteglass som inneholder celler ved 37 ° C vannbad til cellesuspensjonen er helt tint.
3. Legg til 7 mL DMEM (Dulbecco modifiserte Eagle Medium) med høy glukose supplert med 10% FBS (Fetal Bovine serum) og 1% penicillin / streptomycin til en 10 cm kultur plate.
4. Legg til celle-suspensjonen slipp-messig til plate, og forsiktig agitere og rock Petri plate å spre cellene jevnt.
5. Kultur celler ved 34 ° C / 5% CO ₂ inkubator.
6. Etter 4 timer, aspirer media fra plater for å fjerne eventuelle gjenværende DMSO (dimethyl sulphoxide) som hadde vært brukt som cryoprotectant, og erstatte med friskt media (7 mL DMEM høy glukose media supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin) .

2. Passaging Cells

1. Hos 70-80%samløpet (4-7 dager vekst), aspirer media fra cellene.
2. Tilsett 1 mL 0,25% trypsin til plate. Pipette trypsin å koble celler (ca 5 minutter).
3. Gjør passende fortynninger for eksperimentelle forhold og passage ytterligere 10 cm plate for senere eksperimenter på en celle tetthet ikke mindre enn 0,1 x 10 ⁶ celler / ml.

Merk: Du bør passasje cellene dine minst to ganger etter tining før du bruker dem for eksperimenter.

3. Opptelling og Plating Celler

1. Til plate celler for live-cell imaging, trypsinize som tidligere beskrevet.
2. Ta ca 30 mL av celler og telle ved hjelp av en haemocytometer.
3. Plasser en ubestrøket glass dekkglass i en 6 bra plate. Legg celler til brønnen ved en tetthet på 0,1 x 10 ⁶ celler / ml i 2 ml fenol-free DMEM høy glukose media, supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin, ved 34 ° C / 5% CO _2.
4. Tillateceller til å vokse over natten (16-20 t) ved 34 ° C / 5% CO ₂ før transfeksjon.

Fire. Transfeksjon

1. Kombiner 100 mL serum-frie medier, 0,5 til 4 mikrogram renset plasmid DNA, og 4 mL FuGENE HD (Roche). Vortex forsiktig å blande.
2. Vortex igjen kort og la DNA til komplekse i 5 minutter ved romtemperatur, og deretter legge FuGENE HD DNA blanding direkte til dyrkede celler. Tilt platen forsiktig for å blande.
3. Kultur cellene for en ekstra 48 t ved 34 ° C / 5% CO ₂ før behandling eller eksperimentering.

5. Forbereder Celler for Live-Cell Imaging (LCI)

1. Slå på LCI Chamlide live-cell instrument kontrollboks minst 1 time før du ønsker å starte eksperimentet. Kontrollboksen regulerer også temperaturen og fuktigheten i LCI Chamlide, og regulerer flyten av ferdigblandet 5% CO _2.

Merk: Det anbefales åslå på kontrollboksen opp til 3 t før du begynner eksperimenter for å sikre at hele scenen når 34 ° C. Dette trinnet vil redusere fokus drift, som er forårsaket av fluxulation og termisk utvidelse av metall scenen som den varmer, under imaging.

2. Arbeid i en flyt-hette, spray Chamlide magnetiske-type kultur kammer, og pinsetter, med 70% etanol og la dem tørke i 5 minutter.
3. Fjern celler fra inkubator og bekrefte at de er friske. De bør vises heftende og godt spredt på glasset dekkglass med mange membran prosesser. Celler som er stresset fra transfeksjon er ikke egnet for eksperimentering, og vil ha et redusert antall prosess utvidelser, og har ofte en uregelmessig-formet kjerne.
4. Vipp 6-brønn plate og fjern dekkglass med pinsett. Raskt plassere dekkglass celle siden opp i bunnplaten av kulturen kammeret. Ikke la dekkglass tørke.
5. Fest den magnetiske viktigstekroppen av kulturen kammer og tilsett 500 mL av media fra den opprinnelige 6-vel plate på toppen av dekkglass. Re-bruker dette mediet vil redusere mengden stress plassert på cellene forårsaket av miljømessige endringer, og kan også være nyttig for å vurdere ekstracellulære secreted faktorer.
6. Plasser glassdekselet på kultur kammeret.
7. Bruk en KimWipe sprayet med 70% etanol for å fjerne materiale fra bunnen av dekkglass, som ville forstyrre mikroskopi.
8. Plasser kulturen kammer i 34 ° C / 5% CO ₂ inkubator for 30 min. Dette trinnet vil sikre at kammeret selv varmes til 34 ° C for å redusere skiftende av dekkglass som metallet varmes opp.

Seks. Mikroskop Innstillinger

Bildene ble kjøpt her med en Leica DMIRE2 invertert mikroskop med en egendefinert stafett linse og utslipp filter hjul boliger for patron lasting av flere hjul (quorum Technologies Inc., Guelph, ON).

1. Lysfelt - Lampe satt til 2,5 V og eksponeringstiden til 240 ms.
2. Red Fluorescent Protein (RFP) - Gevinst satt til 140 for 200 ms.
3. Grønt fluorescerende protein (GFP) - Gevinst satt til 140 for 500 ms.
4. Våre mikroskop har en dimmes lampe snarere enn en roterende disk for å kontrollere mengden av lys tilgjengelig til cellene. Vi kjører våre eksperimenter med lys ved 90% av maksimal lampe intensitet.

7. Behandling av Celler med Apoptose Inducere og NucView 488 caspase-3 substrat

1. Det er viktig å forberede store bestander av apoptose indusere forhånd og fryse dem i alikvoter, slik at konsentrasjonene vil være konsistente mellom eksperimenter.
2. Den NucView 488 Underlaget er lys sensitive. Forbered alikvoter av 15 mL å redusere fryse / tining, og lagre rør ved -20 ° C dekket i aluminiumsfolie. Arbeidet med ambient belysning så lavt som mulig for å redusere eksponeringen av NucView 488 substrat for lys, før bruk.
3. Hent kulturen kammer raskt fra inkubatoren slik at cellene ikke blir utsatt for en reduksjon i temperatur. Plasser kulturen kammeret på miljømessige kammer av mikroskopet, og bruk klemmer for å holde kulturen kammeret fra å flytte. På dette punktet bør du også dempe rommet lysene.
4. Slå på 5% ferdigblandet CO ₂ tank med doble regulator.
5. Bruke 10x mål, fokus for å finne cellene på dataskjermen med lyse-field mikroskopi. Merk: du ønsker å bruke den største numerisk apertur på formålet med ønsket forstørrelse for å redusere eksponeringen tid.
6. Lever indusere apoptose i cellene (i vårt tilfelle 80 mm kalium, eller 100 mM glutamat), kan en av følgende metoder benyttes. Vi vil bruke levering av 80 mm kalium som et eksempel, bruker KCl oppløst som en 10x konsentrat i våre typiske kultur media.
   1. Media utveksling by langsom og lokal perfusjon:
      - Bruk en peristaltiske pumpen for å utveksle media i kulturen kammeret med nye medier inneholder 80 mM kalium.
      - Den ene enden av slangen skal levere 10 mL av en bestand på 80 mM kalium oppløst i fenol-free DMEM, og den andre enden av slangen vil fjerne mediene fra kammeret.
      - Du vil ha minst en 10x utveksling av media for å sikre at mediene igjen i kammeret har riktig konsentrasjon av kalium.
      - Etter at media er utvekslet, tilsett 3 mL av NucView 488 substrat til media i kammeret. Pipetten å blande.
   2. Direkte tillegg av 80 mM K ⁺ og NucView 488 substrat til media i kultur kammer:
      - Utarbeide en 10x stamløsning på 80 mM kalium oppløst i fenol-free DMEM.
      - Tilsett 3 mL av NucView 488 substrat til 50 mL av 10x 80 mm kalium. Pipetten å blande. Legg til 500 mL fenol-free DMEM i kultur kammer.
      Merk: Denne metoden erforetrekke hvis du er interessert i å opprettholde eller vurdere vekst eller andre secreted faktorer som kan være til stede i det opprinnelige mediet. Vi har funnet at NucView 488 underlaget er stabilt i cellekultur for eksperimenter som varer så lenge som 36 h.

8. Live-cell Imaging

1. Klikk på den røde kanalen å vise transfektert celler.
2. Velg og lagre rundt et dusin rammer der det er flere transfektert celler, og lagre disse "XY scenen points". Avhengig av mengden av datamaskinens minne, kan du bli begrenset til antall scenen poeng at du vil kunne tilegne seg.
3. Har mikroskopet ta bilder (i lyse-feltet, rød kanal, og grønn kanal) på disse lagret stadium poeng hver 6 minutter.
4. Eventuelle grønne flekker som er synlige i den tidlige fasen av forsøkene indikerer sannsynlig celler som allerede gjennomgår apoptose, på grunn vanligvis til transfeksjon og / eller miljømessige stress. Apoptosis grunn av eksperimentelle behandlinger vil bli oppdaget på et senere endepunktet i forsøket.

9. Statistisk analyse

1. For hvert forsøk program vi mikroskop for å skaffe flere XY poeng å samle et stort datasett effektivt. Hver eksperimentet er utført i to eller tre eksemplarer, og data er hentet fra egne eksperimenter utført på ulike dager. Fra hver datasett, analyserer vi opp til 15 synsfelt og sammenligne forholdet mellom caspase-negative celler til caspase-positive celler (totalt antall celler i synsfeltet / totalt antall caspase-positive celler).

2. Den registrerte målinger fra hvert datasett er gruppert i en større prøvesett, og blir deretter sammenlignet med hverandre ved hjelp av en ANOVA tabell (p = 0,05). Vi viser standard feil for gjennomsnittet (SEM) for hvert forsøk, og deretter sammenligne forskjellen i midler ved å utføre en Tukey betyr sammenligning test (p = 0,05) for å bestemme which behandlinger er vesentlig forskjellige fra hverandre.

10. Representant Resultater

Vi har beskrevet et eksperiment for å illustrere hvordan NucView 488 underlaget kan indikere en økt forekomst av apoptose av N19-OLG cellekulturer etter en behandling med en høy ekstracellulært kalium konsentrasjon. Den N19-celler ble transfektert med RFP, og ble enten behandlet med 3 mL NucView 488 substrat (kontroll), eller 3 mL NucView 488 substrat og 80 mm [K ^+] (behandling). Celler ble overvåket og bilder samlet inn over en 12 h tid selvfølgelig, noe som er tilstrekkelig for studier med nevrologiske fornærmelser (figur 1A). I kontroll forhold, gjorde vi ikke observere betydelige mengder apoptose i forhold til 80 mm [K ^+] behandlede kulturer (hash-box), som viste ca 45% celledød etter 12 h (Figur 1B). Bakgrunnen grønt signal observered i kontroll forholdene tilsier cellene gjennomgår apoptose uten tillegg av ekstracellulært kalium. Nesten ingen av cellene i kontrollgruppen eksperimentere utstillingen apoptose ved 12 h tidspunkt, men i andre situasjoner forsøkene kan være nødvendig å kjøre lenger. Bildene ble kjøpt ved hjelp av en 10x objektiv. Bar = 100 mikrometer.

Figur 1. (A) En 12 h tidspunkt løpet eksperiment N19 OLG kulturer 48 t post-transfeksjon uttrykker RFP-MBP (rød sone) sammen med 3 mL av NucView 488 substrat (grønn kanal). Kulturer ble enten behandlet med en endelig konsentrasjon på 80 mM [K ^+] (venstre panel), eller ingen behandling som en kontrollgruppe (høyre panel). Bildene ble kjøpt til 6 min mellomrom, og betydelig aktivering av kløyvde caspase-3 (grønt signal) kan observered i kulturer behandlet med 80 mm [K ^+] i cellekjerner (hash-box) sammenliknet med kontrollgruppen forsøket. (B) Prosent av kløyvde caspase-3 celler (beregnet ved å dividere totalt antall celler i synsfeltet ved det totale antall caspase-positive celler). I forhold til kontroll forhold, observerte vi rundt 45% celledød følgende K ^+-behandling med 12 h.

SVIDEO 1. En 12 h tidspunkt løpet eksperiment N19-OLG kulturer 48 t post-transfeksjon uttrykker RFP-MBP (rød sone) med 3 mL av NucView 488 substrat (grønn kanal), sammen med lyse-feltet bilder og en tre-veis sammenslåtte bildet, etter behandling med 80 mm [K ^+].

SVIDEO 2. En 12 h tidspunkt løpet eksperiment N19-OLG kulturer 48 t post-transfeksjon uttrykker RFP-MBP (rød sone) med 3 mL av NucView 488 substrat (grønn kanal), sammen med lyse felt forestillees og en tre-veis sammenslåtte bildet. Ingen behandling ble brukt på kulturer og N19-OLGs kan sees migrere gjennom mikroskopet feltet i motsetning til cellekulturer behandlet med 80 mm [K ^+] (sammenlign med SVIDEO 1).

Selv om dette er ikke den eneste fluorogenic produktet tilgjengelig for apoptose deteksjon, er det flere betydelige fordeler med å bruke den NucView 488 underlaget. En av de største fordelene er muligheten til å følge apoptose i levende celler i sanntid, mens de fleste alternative produkter enten krever cellelyse eller har dårlig celle permeabilitet. Andre fordeler er høy følsomhet for caspase-3 anerkjennelse, høy celle permeabilitet, lav cytotoksisitet, og ingen forstyrrelser med utviklingen av apoptose. Underlaget har også lav bakgrunnsfluorescens til den er spaltes og kommer inn i kjernen, noe som eliminerer bakgrunnsfluorescens. Den caspase-3 gjenkjennelse sekvens inneholder 3 negative kostnader og DNA-bindende fargestoff har en positiv ladning ^2. Den devd-NucView 488 molekyl har dermed en netto negativ ladning, noe som hindrer aktivering og binding av fargestoff til DNA i cellene der caspase er ikke aktiv.

Maintaining konsistens mellom eksperimenter er nødvendig for å kunne trekke meningsfulle sammenligninger mellom replikater. En av de viktigste parametrene for å holde konsekvent er celle tetthet, da det påvirker frekvensen av transfeksjon. Innhenting av høy transfeksjon priser i udødeliggjort N19-OLG cellekulturer er vanskeligere enn med andre vanlige cellelinjer som Hela eller HEK293, og er svært avhengig av tetthet, i vår erfaring ^{12, 13.} Våre beste transfeksjon effektivitet for disse cellene har blitt oppnådd med Fugene HD (Roche) og er normalt ca 15%, men kan nå over 30%, avhengig av konstruksjon. Nøye celle telle skal hjelpe til med å skaffe konsekvent transfeksjon priser. Det er også viktig å eksponere cellene fra forskjellige behandlinger til samme grad av miljømessig stress, spesielt når man måler forekomst av apoptose. Konkret hvor lang tid over hvor cellene blir utsatt for transfeksjon reagenser, eller mengden av lyseksponering, er viktige miljømessige Variables å vurdere, og bør forbli konstant på tvers av eksperimenter. For våre applikasjoner, har vi funnet ut at å samle et stort antall felt-of-view gir en tilstrekkelig stor sample size for å gjøre statistisk signifikant sammenligninger [ibid].

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Dette laboratoriet har vært støttet av den kanadiske Institutes of Health Research, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, og multippel sklerose Society of Canada (MSSC). GSTS var mottakeren av en Doctoral Studentship fra MSSC. Vi er takknemlige til Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) for mange nyttige diskusjoner og kommentarer på dette manuskriptet. Vi er takknemlige for å Biotium for sin generøse gave av ekstra NucView 488 caspase-3.

1. Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C.N., Radu, C., & Djaballah, H. Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening. J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).
2. Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R.J., & Firestone, G.L. DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells. FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).
3. de Calignon, A., Fox, L.M., Pitstick, R., Carlson, G.A., Bacskai, B.J., Spires-Jones, T.L., & Hyman, B.T. Caspase activation precedes and leads to tangles. Nature. 464, 1201-1204 (2010).
4. Eldadah, B.A. & Faden, A.I. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).
5. Foster, L.M., Phan, T., Verity, A.N., Bredesen, D., & Campagnoni, A.T. Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation. Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).
6. Fulton, D., Paez, P.M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C.S., & Campagnoni, A.T. Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins. Glia. 58, 1292-1303 (2010).
7. Hisahara, S., Okano, H., & Miura, M. Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).
8. Lau, A. & Tymianski, M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration. Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).
9. Lawrence, M.S., Ho, D.Y., Sun, G.H., Steinberg, G.K., & Sapolsky, R.M. Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo. J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).
10. Paez, P.M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J.M., Campagnoni, C., & Campagnoni, A.T. Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells. J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).
11. Sanchez Mejia, R.O. & Friedlander, R.M. Caspases in Huntington's disease. Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).
12. Smith, G.S.T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M.K.B., Jones, N., Boggs, J.M., & Harauz, G.Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res. (In press, 2011).
13. Smith, G.S.T., Paez, P.M., Spreuer, V., Campagnoni, C.W., Boggs, J.M., Campagnoni, A.T., & Harauz, G. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms. J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).
14. Springer, J.E., Azbill, R.D., & Knapp, P.E. Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nat. Med. 5, 943-946 (1999).
15. Verity, A.N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V.W., & Campagnoni, A.T. Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus. J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).
16. Yu, S.P. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.