マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

Casadevall i Solvas, X., Niu, X., Leeper, K., Cho, S., Chang, S. I., Edel, J. B., et al. Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms. J. Vis. Exp. (58), e3437, doi:10.3791/3437 (2011).

化学と生物学を行うためのマイクロ流体プラットフォームの開発は、大部分のシステムの小型化に伴う潜在的な利益の範囲によって駆動されています。利点は、効率的にサンプルのfemotoリットルのボリューム、機能コンポーネントの容易な統合、大規模な多重化、強化された分析のスループット、改良されたコントロールと減少楽器の足跡に向けた本質的な素因ナノに処理する能力が含まれています^1。

近年では多くの関心は、液滴ベース（またはセグメント化されたフロー）マイクロ流体システムとハイスループット実験のプラットフォームとしての可能性の開発に焦点を当てている。ここでは^2-4、油中水型のエマルジ ​​ョンが自発的にマイクロ流体チャネルで形成するように作られて2つの不混和相の間のキャピラリー不安定の結果として。重要なのは、正確に定義されたボリュームや組成の微小液滴は、周波数で発生させることができます数kHzの。さらに、連続的な不混和相、サンプルのクロストークの両方と分散（拡散およびテイラーベース）で区切られた、分離区画内で関心の試薬をカプセル化することによって除去することができる、これは最小限のクロスコンタミネーションと時間分析プロセスをする能力につながる偉大な精度で。さらに、液滴の内容とチャネル壁（連続相によって湿潤されている）の間には接点がないので、チャネル壁上に試薬の吸収と損失が防止される。

この種の液滴が生成され、処理された後は、必要な分析情報を抽出することが必要です。この点では選択肢の検出方法、検出の高感度と低制限を提供する、迅速でなければならない、分子種の範囲に適用可能である、非破壊的であると安易な方法で、マイクロ流体デバイスと統合することができるようになります。このニーズに応えるために、我々はとして開発しました。実験的なツールと小音量の環境からの光物理大量の情報の抽出を可能にし、物理的、化学的、生物学的パラメータの広い範囲の分析に適用可能なプロトコルのuite。ここにこれらのメソッドの二つの例を提示し、単一細胞とピコリットル容量の液滴内部の混合プロセスのマッピングの検出に適用されます。我々は、マイクロ流体チップ製造、光学セットアップおよび液滴の生成と検出のプロセスを含む全体の実験的なプロセスを報告する。

1。マイクロチップ製造

1. SU8マスター製作。
   3000rpmでシリコンウエハ上に40μmの高さ、スピンコートSU8 - 50（マイクロケム社）のマイクロ流体チャネルを取得するには、30秒のための65℃のホットプレート上でソフトベーク℃で5分間と95℃の溶剤を蒸発させるとフィルムの密度を高めるために30分間。冷却後、適切なマスクの下に300で360から440 nmの放射とMJ / ^2を抵抗SU8を公開。曝露後、65℃ウェハを焼く℃で2分間、4分間、95 ° Cを。冷却後、撹拌しながら、5分間未露光領域を（Micrpoposit EC溶剤、Chestech）を開発^。5使用新鮮なウェーハをリンスしてから、きれいな表面を生成するガスの下でそれを乾燥させる溶剤EC。ヘキサン及びメタノール洗浄とウェハを扱う。表面にシラントリクロロ蒸発の最終段階（1,1,2,2 - perfluoocytl）（40分間デシケーター内）でSU8マスターの製造プロセスを完了します。
2. PDMS curinG、ダイシングや穴パンチ。
   構造化されたマイクロ流体基質を形成するために、我々は、架橋剤の樹脂の10:1（w / w）の比でSylgard 184（ダウコーニング）を一緒にして、マスターを介して注ぐ。その後、デシケーター中でドガ、そして、65で1時間デバイス（最上層）℃を治すマスターオフ硬化PDMSとその皮を切り取ります。生検パンチを使用して流体配管用のアクセス穴を作成します。 65℃20分間PDMSの別の層（均等に10 × 10センチメートルシャーレに広がる樹脂の8g）を℃を治す底層上に準備さ最上層を配置し、65℃一晩硬化℃に使用のためのペトリ皿とダイスからチップはがします。

2。実験的なセットアップ

1. マイクロ流体セットアップ
   1. に気泡がチューブのどの部分に残っていないの確保、必要なソリューションを注射器を（Becktonディッキンソン社からまたはSGE分析科学からのプラスチックまたはガラス）塗りつぶし。液滴生成​​のための二つの相が使用されます。水溶液（分散）のPHAeは興味の試薬（例えば、増殖培地中の細胞の懸濁液、または分子フルオロフォアの解）が含まれています。この場合には、連続相として機能するが、一般的に油と界面活性剤の混合物から形成される油相、、フッ素系オイルに例えば2％のレインダンスの界面活性剤（レインダンステクノロジーズ）（3Mフロリナート電子液体FC - 40）、または2％ミネラルオイルでスパン80（クローダ）。
   2. 針への一方の端に注射針の先端と同じ内径のチューブ（ポリエチレンチューブ、ハーバード装置）を取り付けます。チューブは振動摂動による流れの不安定性を最小限に抑えるために最短の長さにカットしてください。
   3. PDMS基板にパンチ穴に直接チューブの他端を接続します。このようなシリカキャピラリーポートやコネクタの使用（例えば、アップチャーチのNanoports）などのより複雑なソリューションは、また、マイクロ流体デバイスとチューブの間のより堅牢なインタフェースを実装できます。コンセントを接続するコレクタ（ごみ収集またはさらなる分析物の処理用）にチューブと直接にチップのポート。
   4. シリンジポンプ（例えばPHD 4400 Hpsiプログラマブルシリンジポンプ、ハーバード装置）上にシリンジをマウントし、各フェーズ（通常毎分マイクロリットル程度）のために必要な注入流量を定義します。 1の油/水フローレートの最小値比は、不安定な液滴形成（デバイスのジオメトリに応じて）につながる水相、でPDMSの濡れを避けることをお勧めします。同じ理由で、それも第一の水性相を導入する前に、任意のマイクロ流体チャネルを介して、単独で油相をフラッシュすることをお勧めします。実験の記載に使用される最終的なセットアップを図2aに示されています。
2. 光学系のセットアップ
   1. 高い空間分解能と時間分解能を持つマイクロ流体チャネル内に少量を（ダウン数ピコリットルまで）をプローブするには、共焦点顕微鏡を（自動販売と使用EDサブミクロンの位置決め能力）。
   2. 理想的に高い量子収率で水溶性蛍光分子を使用してください。関与する蛍光体の吸収と一致する波長で動作するレーザーを使用して分子を励起する。例えば、フルオレセイン5 - イソチオシアネート（FITC）とAlexa - ® 488などの一般的な蛍光分子を効率的に488nmのダイオードレーザー（例：PicoQuant GmbHは、LDH - PC - 485）を使用して励起することができます。このようなテキサスレッドまたはアロフィコシアニン（APC）のような蛍光分子は、効率的に彼/ Neレーザ（例えばニューポートR - 31425）を用いて633 nmで終了することができます。
   3. 蛍光寿命イメージング（FLIM）実験のための十分に分化した寿命特性と繰り返し数MHzのレート（数nsのパルスの分離による）とフルオロフォアで動作するパルスレーザを使用してください。
   4. ビームの高さだけでなく、ビーム方向を制御するビームステアリングミラーと光学系を使用してください。
   5. 客観的なlにレーザービームを反射するダイクロイックミラーを使用して、ENS。二つのレーザーを同時に使用する場合、デュアルバンドのダイクロイックミラーは、2つのレーザービーム（クロマテクノロジー社からz488/633rdcミラーが理想的である488および633 nmのビーム用など）の反射を可能にするためにインストールすることができます。
   6. マイクロ流体チャネル内でタイトな焦点にレーザー光をもたらす無限遠補正、高開口数（NA）顕微鏡対物（すなわちオリンパス60 × / 1.2 NA、水浸漬）を使用してください。背の高いマイクロチャネル（>100μm）に操作する際に使用される目的は、適切にそのワーキングディスタンスが効果的にマイクロチャネルの完全な高さをカバーすることを保証するために選択する必要があります。
   7. 同じ高NAの対物と同じダイクロイックミラーを透過を使用してサンプル（マイクロ流体チャネル内）が発する蛍光を収集する。
   8. シングルまたはデュアルバンド放射フィルタ（例えばクロマテクノロジー社からz488/633フィルタ）を使用して、残留励起光を取り外します。
   9. 蛍光emissioフォーカスn個の平凸レンズを（例：50.2 F;ニューポート株式会社）を用いて75μmのピンホールへ。顕微鏡対物レンズの焦点面にピンホールを合わせます。
   10. 2つの検出器に蛍光シグナルを分割する別のダイクロイックミラー（例えば630dcxr、クロマテクノロジー社）を使用してください。
   11. エミッションフィルター（例えばクロマテクノロジー社からhq540/80メートルフィルター）とダイクロイックミラーにより反射された蛍光をフィルタリングし、平凸レンズでフォーカス（例えば、F = 30.0、idを25.4ミリメートル、Thorlabs）最初に（ '緑）検出器。二赤色蛍光体を含む実験では、別の排出量のフィルタ（例えばクロマテクノロジー社からhq640lpフィルタ）とダイクロイックミラーにより送信される蛍光をフィルタして、2番目（'赤'）検出器の上に別の平凸レンズでフォーカスのために。
   12. 蛍光光子の検出にアバランシェフォトダイオード（例えばAQR - 141、EG＆G、パーキンエルマー社製）を使用してください。最終的なセットアップは、に示されています

3。液滴の生成とデータ収集

1. 液滴の生成方法
   1. あなたは、液滴を生成するマイクロチャネルの2つの主要な構成を使用することができます。中心に流れたり、T -ジャンクションの形式（ 図3aおよび ^3b）6,7滴が形成されたとして、どちらの方法が長いように等価である自体マイクロチャネルと同じ幅です。一緒に2つの不混和流体をもたらすためにこれらのジオメトリを使用して、インターフェイスでの開発、その後のキャピラリー不安定性から生じるせん断力の結果として、単分散液滴は、（いくつかのfemtoliters限り小さく）自発的に生成されます。
   2. あなたが別の方法で試薬をカプセル化することができます。試薬を調製し、そして混合所望の混合物/濃度にチップオフ、またはそれらはチップに別々に持ち込み、次に液滴形成（ 図3c）前に一緒に結合することができますすることができます。この混合物/濃度は単に相対的なフローレートを調整することで変更できるので、最後の方法は、より高い柔軟性を提供します。それは、細胞のカプセル化のために、注射器で細胞懸濁液は、実験の時間スケール上にセルの結露を避けるために攪拌する必要があることに留意されたい。
2. 蛍光データの収集。
   1. カップルアバランシェフォトダイオード検出器（2.2.12で説明されている）からのデータロギングのためのマルチファンクションDAQデバイス（例えばPCI 6602、ナショナルインスツルメンツ）の電子信号を、パーソナルコンピュータ上で実行されている。
   2. FLIMの実験のために別々のPC上で動作する時間相関シングルフォトンカウンティング（TCSPC）カード（例えばTimeHarp 100、PicoQuant社）に検出器を接続してください。各検出された蛍光光子が入射レーザーパルスに相関しているため、それぞれの発する蛍光光子は、遅延時間を割り当てられている：このカードは、TCSPC方法論を用いて蛍光寿命のデータが得られるためにすることができます。このデータ蛍光団/秒放射率係数/ sの推定を得るために、単一または複数の指数減衰カーブフィッティングすること検出器の測定器の応答関数（IRF）と生データをDeconvolute：これは、低濃度のオーラミン- Oソリューションを（数ピコ秒の蛍光寿命を発揮する）を使用して得られる^8。

4。液滴内の混合の細胞認識とマッピング

1. 液滴内の混合の細胞認識とマッピング
   1. 生死判別試験の実験のために、大腸菌のトップ10菌株を使用してください。文化は、一晩LB培地中の細胞と前の実験に0.5に光学密度と一致している。
   2. 細胞の生存率を検出するための0.4μMSYTO9および1μMのヨウ化プロピジウムを使用してください。両方とも、DNA -インターカレー色素であり、それらの蛍光強度はDNAに結合すると20以上の折り目によって増加する。 SYTO9は私である緑色蛍光色素です。mbrane透過性とヨウ化プロピジウムは細胞膜​​不浸透性の赤色蛍光色素です。死んだ細胞は'緑'と'赤'の両方の排出量を示す間、このように生きている細胞は'緑の蛍光を発する。
   3. 緑/赤の蛍光検出のための2.2で導入されたセットアップ）を使用してください。
   4. 細胞の沈降を防止するために7ミリメートルの磁気撹拌棒を装着した3mlのBD plastipakシリンジ内に細胞懸濁液を撹拌するポータブル、ミニマグネチックスターラーを（ユタ州バイオディーゼル供給、ユタ州）を使用してください。
2. FLIMを用いて混合イベントのマッピング
   1. 滴が流れているそれに沿ってマイクロチャネルの半分の高さで光プローブの量をフォーカス。
   2. 、二つの水溶液（ 図3cのように）からの液滴を形成し、それぞれ異なる特性蛍光寿命と（非相互作用）蛍光体を含む。
   3. チャネルの片側から始まり、1μmの間隔でチャネルの幅全体に沿ってそれぞれ実験を行う。チャネルEDレーザ光が彼らの近くに集中されると蛍光強度が大幅に下がるとGESは、容易に識別することができます。
   4. 油相のノイズ背景から、信号のバーストを（液滴に関連付けられている）を区別するために、各バーストの持続時間を確立するためにアルゴリズムを実装します。
   5. 実験が実施されている特定の幅で、各液滴の長さに沿って遅延時間と強度の値を抽出する第2のアルゴリズムを実装する^。9
   6. その後、実験の各液滴の蛍光寿命を評価するために最尤推定量（MLE）アルゴリズムを使用する^。8は 、実験のすべての滴の有効期間の値を平均し、最尤推定計算の最終的な誤差を低減（より多くの液滴はプローブ、エラーが小さい）。
   7. 生涯の軌跡は、各幅のために取得されると、2Dマップ内のすべての軌道を組み合わせる。それぞれのライフタイム値はparticuに関連付けられているのでLAR two蛍光体の混合物は、濃度（または混合）のマップを得ることができる。
   8. オプションで、液滴の混合の3Dマップは、マイクロ流体チャネルの高さに沿って異なる位置でこのプロトコルを繰り返すことにより容易に得ることができる。

5。データ分析

1. それらがさらに分析できるように、適切なコンピューティング言語への生の実験データファイルを再解釈する（時間をかけて光子計数の変動を含む例：テキストフ​​ァイルは、容易にデータの処理と解析のためのMATLABに抽出することができます）。あなたは、より複雑な実験のファイル（たとえば、FLIMのためのものなど）または最尤推定のアルゴリズムを実行したり、生涯の軌跡から混合pattersの2Dマップを構築するために含まれているデータにアクセスするために特定のコードを記述する必要があります。

6。代表的な結果

細胞の認識

varの典型的な例細胞ベースの実験のために時間の関数として光子カウントのiationは200ミリ秒の期間にわたって、 図4aおよび cに示されています。重要なのLB培地（LB培地）個々の細胞の存在に対応する明確な光子バーストを、、一方、水性液滴の境界を定義する弱い蛍光バックグラウンドとしての行為は、このような背景の上に区別することができます。 LB蛍光バックグラウンドは約矩形断面（赤と緑の点線でマーク）によって特徴付けられる。

E.から生じる蛍光バーストの完全な幅の半値全幅（FWHM） 大腸菌細胞は相対的な液滴の長さ（40ミクロン、30 picolitresの体積に相当する）とE.と一致している背景の液滴のイベント、30倍より短いです大腸菌細胞（1.5から2.0ミクロン^）10

デュアルチャネルで検出イオン系、生細胞または死細胞の存在は、緑と赤のチャンネルの分析と区別することができる。 図4 bとdは液滴当たりのセル数を表す確率分布を示す。

FLIMを用いて混合イベントのマッピング

分子蛍光寿命は、その化学的環境によって影響を受ける個々の蛍光体の本質的なプロパティです。従って、その測定は、濃度、励起強度、および光学的コレクションとして実験的な要因（依存している時間集積型蛍光測定が、より優れた分解能と精度で環境情報を（例えば溶液のpH、温度、極性や粘度など）を取得するために使用できます。効率性^）。9,11

、他の^8を提示としては、ジを持つ2つのフルオロフォアを用いて滴内部の混合パターンをマップすることが可能です。fferentライフタイム値。式1に示されているように、2つ（非相互作用）蛍光種を含む混合物で、崩壊はbiexponentialフォームにかかります。

個々の寿命は、τ1とτ2のように定義され、そして各成分の振幅はそれぞれ、α1とα2で与えられる。平均寿命は、次のように定義できます。

β1とβ2は、各成分の割合であり、次のように定義されています：

プローブのボリュームが固定され、液滴はその位置を越え流れているので、その特定の幅での液滴の長さに沿ってライフタイム値の軌跡が得られたことができます。特定の幅の特性軌道、アベレージ6000滴間のEDは、 図5aに観察することができます。

チャネルの幅全体にわたって軌道を組み合わせることにより、2D濃度（または混合）マップの形成につながる。典型的な結果は、 図5bに示されている。

液滴の多数の間で結果を平均することにより、得られた結果の標準誤差が大きく（ 図5aの95％信頼区間と標準誤差1％）減らすことができます。生涯の軌跡の決定法は、すべての水滴が実質的に同一であることを前提としています。液滴が大​​きく異なっていた場合、得られる平均寿命の軌道が（と平均液滴の長さに沿って寿命の大幅な違いが一貫して検出される）、あまり発散プロファイルをフラットなはず：これは、2つの主な理由主に正しいことが証明されています。さらに、結果に関係なく、個々の再現性分析した水滴や計算で使用される液滴の量は⁸

マイクロ流体チップ製造上の図1。プロセスフロー。

。液滴形成のためのマイクロ流体チップに接続されたシリンジポンプとシリンジを表す2）図、 図 、二つのレーザーの典型的な光学セットアップのb）の模式図-二つフルオロフォア（緑と赤）励起および検出。 DC =ダイクロイックミラー、EM =エミッションフィルタ、L =レンズ、PH =ピンホール、APD =アバランシェフォトダイオード検出器。

図3オンチップ液滴形成戦略：）フローを中心の構成と、b）T -ジャンクションの構成。。 c）は、DRのチップカプセル化についてtwoもともと別々の水性試薬のoplets。

図4（a）死者と（c）生きている細胞（細胞懸濁液のためのフローレート：1μLmin ^-1で 、オイル：2μlの分^-1）のために記録された0.2秒トレースの光読み出し。。各アーチ状の信号は、点線でマークされた液滴の境界と、水液滴を形成する弱い蛍光LB培地に相当する。緑色の信号は633 nmの波長で633nmと赤の信号の下で読み出しを表す。細胞は、DNAインターカレート色素から生じる垂直スパイクによって区別されます。 （b）の死細胞及び（d）生きている細胞の単一液滴の内の細胞の占有率の確率分布。

図5特定の幅での液滴の長さに沿って）一般的な平均寿命の軌跡; B）すべての平均軌道の組み合わせの典型的な表現は（または濃度、％のFITC /％STR - AF488として表される）2次元一生に水滴の幅全体に沿ってマップをプローブ。

我々は、マイクロ流体デバイスの製造、液滴の形成と試薬のカプセル化と、処理液滴の光学的に検出するための実験のセットアップと関連プロトコルを記述している。 （液滴内の単一細胞の検出と流れる滴内部の混合プロセスのマッピング）を選択した二つの例は、現在、液滴のマイクロフルイディクスを検討されている一般的なアプリケーションを表します。

提示の実験が示すように、液滴マイクロ流体プラットフォームの使用は、しかし、そのような高スループット、準最適な閉じ込め、高い再現性...生産、大量の情報およびこの情報が作成されている時に高速などの特定の魅力的な特性を、提示完全な利点は、これらの小型のプラットフォームから得られるかどうか、高時空間分解能を持つ高速な検出方法を使用する必要があります。このケースではこれがであることを示している高精度の蛍光分光技術を使用して可能。特に、FLIMの検出技術は、（数nsと短い繰り返し周期とパルスレーザーを利用する）急速に流れる滴（1秒間に200前後の）から、非常に高速な情報を取得する能力を明らかにする。この場合、検出されたイベントの時間分解能は1μsと低かった。液滴の大きさと濃度の限界の面では、より大きな開口数のレンズと大きな出力レーザーの使用が容易に5μmの（液滴の大きさの制限は、フォトリソグラフィの解像度によって課されているような小さな液滴内nMの濃度の検出を可能にするでしょうサブミクロンの位置決めステージの製造プロセスと）。

マイクロ流体の液滴は下に単一のターゲット/イベントに、試薬の少量を含む大規模な実験を実施するために理想的な候補です。この技術の現在の制限は、DRを生成するために困難を伴うハイスループットな方法でさまざまなソースの大規模な様々な（数十または数百）からoplets。さらに、生成された各単一液滴をターゲットにして操作する難しさは、これらの技術の実用性には厳しい制限を課している。したがって、これらの問題は、マイクロ流体液滴のプラットフォームは、高スループットのアプリケーションの研究と分析の標準的な参照方法になることを可能にする必要な技術的ソリューションの開発を目指した重要な研究努力の中心になります。

利害の衝突は宣言されません。

EPSRC、HFSP、韓国の国立研究財団（助成番号R11 - 2009 - 044 - 1002 - 0K20904000004 - 09A050000410）：著者は、以下の研究会と助成金の支援を感謝したい。

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2. Zheng, B. & Ismagilov Angew, R.F. A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow. Chem. Int. Ed. 44, 2520 (2005).
3. Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J.B., & Demello, A.J. Microdroplets: A sea of applications? Lab on a Chip. 8, 1244 (2008).
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