Måling af cytosole Ca ^{2 +} I isolerede kontraktile lymfekar

1. Dyr

1. Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og bruge udvalget ved Louisiana State University Health Sciences Center, og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institute of Health (NIH publikation nr. 85-12, revideret 1996). Mand Sprague-Dawley rotter (Charles River Laboratories, 270-350 g krop wt) blev anbragt i en kontrolleret temperatur (22 ° C) og kontrolleret belysning (00:12 H lys mørke cyklus) miljø. Efter ankomsten blev rotterne indgivet til en uges akklimatisering periode og blev leveret standard rotte Chow (2018 Teklad Global 18% Protein Gnavere Kost, Harlan) og vand ad libitum.

2. Eksperiment Set-Up

1. Glas mikropipetter til montering lymfevejene er lavet af borosilikatglas med endeløse OD 1.2mm, ID 0.69mm (Sutter Instrument BF 120-69-15). Træk pipetter ved hjælp af en Flaming / Brown Mikropipette Puller model P-97 (Sutter instrumENT) og er bevel med en Micro Grinder EG 400 (Narishige) for at få en skrå spids med en ~ 60 my udvendig diameter.
2. Monter mikropipetter i den isolerede skibet kammer (model CH-1, levende systemer, Burlington, VT). Den pipetter skal være modstand matches (samme størrelse åbning).
3. Fyld kammer (5 ml) og mikropipetter forsynet med albumin-fysiologisk saltopløsning (APSS, se tabel 1). Sørg for, at der ikke er bobler i mikropipetter eller slangen.
4. Forbered udkragningen knob med oftalmologiske suturer og læg en på hver mikropipette.

3. Indsamling lymfatisk Isolation

1. Bedøver dyrene med en intramuskulær injektion af ketamin / xylazin (90 og 9 mg / kg) ved hjælp af en BD injektionssprøjte (1 ml) og nål (BD intradermal koniske 26G3 / 8).
2. Spray underlivet området med 70% alkohol til at sterilisere, udføre en midterlinjen laparotomi, og exteriorize og punktafgifter tyndtarmen og mesenterium. Placer væv i ICe-kold APSS. Aflive dyrene med en overdosis af ketamin / xylazin og bekræft død ved at åbne brystet (som pr American Veterinary Medical Association retningslinjer for eutanasi).
3. Pin en sektion af mesenterium i en dissektion kammer fyldt med iskoldt APSS. Omhyggeligt dissekere en indsamling lymfatisk fartøj (8-20 μm indvendig diameter og 1-2 mm i længde) fra omgivende fedt-og bindevæv ved hjælp af et stereomikroskop. Brug dissekere Dumont pincet-INOX 55 (Fin Science Tools # 11255-20) og dissecting fjeder sakse (Fin Science Tools # 15000-03). Brug isoleret fartøjer med kun én ventil for at sikre optimal trykstyring i hele segmentet under eksperimentet.
4. Overfør isolerede lymfesystemet til den isolerede skibet kammer, der indeholder 5 ml APSS. Monter fartøj, de to modstand-matchede glas mikropipetter ved at binde med oftalmologiske suturer.
5. Overførsel kammeret til en inverteret fluorescerende mikroskop (vi har en Nikpå TE-2000U) udstyret med en xenon lampe (Sutter Instruments Lambda LS2 300 W) 340/380 filter hjul system (Sutter Lambda 10-3 med Chroma Technology 340 og 380 nm excitation filtre), 510 nm dichroic emitter (Chroma Technology D510 / 80 m), en følsom CCD kamera (Photometrics HQ ^2), og software til erhvervelse (Nikon Elements AR) (Figur 1).
6. Fastgør slangen stammer fra mikropipetter enten justerbar reservoirer eller til servo-feedback pumpesystem (levende systemer Instrumentering, Burlington VT), begge som kan bruges til at ændre tryk og flow.
7. Tilslut kammer til opvarmning enhed (levende systemer) og indstille badet til 37 ° C.
8. Se lymfe direkte gennem dækglasset i bunden af ​​kammeret med en 10X objektiv (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Hurtig time-lapse billede sæt kan erhverves ved hjælp af Image Acquisition software (vores system har Nikon Elements AR software).

2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i i den isolerede lymfe glatte muskel er målt ved Ca ^{2 +-sensing} dye Fura 2-acetoxymethyl ester (AM) (Molecular Probes, Eugene, OR).
2. Læg lymfesystemet fartøj med Fura-2 AM af at udveksle badet til APSS opløsning med Fura-2:00 (2 μM) og pluronic syre (0,2% vægt / vol) i 30 minutter ved 37 ° C.
3. Efter 30 minutter ændre badet tilbage til APSS løsning. Skyl 2 gange for at vaske ud Fura-2 fra badet løsning. Lad skibet for en Ekvilibreringstiden på mindst 20 minutter før [Ca ^{2 +]} _i målinger til at tillade genetablering af spontane veer.
4. Saml ratiometrisk Fura-2 målinger i isolerede lymfevejene med en anskaffelsesværdi protokol, alternativt lyser ved 340 og 380 nm bølgelængder for varigheder på 50 ms hver. Den fluorescerende lys passerer gennem et dichroic spejl (400 nm; Chroma Technology Corp 400DCLP) og et bredt bånd emission filter (510 nm, 80 nm båndbredde; Chroma Technology Corp D510/80m) og er erhvervet af Photometrics HQ ² kamera. Vi indsamler 2 minutter af data på en baseline intraluminale tryk på 2 cm H ₂ O og under trin stigninger på +2, +4, +6, +8, og +10 cm H ₂ O.
5. At analysere den gennemsnitlige [Ca ^{2 +]} _i, tegne en region of interest (ROI), som omfatter hele lymfe fartøjet og omegn, således at fartøjet er fuldt spores i løbet af afslapning og sammentrækning (figur 2). Hvis den ene mikropipette er i synsfeltet disse områder bør ikke indgå i ROI. Mindre ROIs kan også vælges, dog et potentielt problem med små ROIs er, at karvæggen kan bevæge sig lidt i den langsgående retning ud af ROI som skibet bremsende og slapper af. Et andet potentielt problem er, at nogle fartøjer twist under kontraktion, og disse lymphatics bør ikke anvendes for at studere. The vride bevægelser er som regel undgås ved at begrænse længden af ​​den isolerede lymfesystemet til <1 mm. Hertil kommer, segmenter på hver side af en ventil til tider ikke snøre / slappe af i synkront. I dette tilfælde, fordi disse segmenter udgør særskilte funktionelle lymphangions bør lymfe undersøges på kun den ene side af ventilen, eller hver lymphangion kan studeres separat med en ROI placeret på hver side. Når du bruger en 10X mål bør karvæggen ophold i fokus under phasic veer, men hvis der er nogen dele af væggene, der går ud af fokus under sammentrækninger disse områder bør ikke indgå i ROI. En baggrund ROI er også brugt, og skal placeres langt fra skibet (fx i hjørnet af billedet). En stigning i 340/380 forholdet indikerer en stigning i [Ca ^{2 +]} _i. Luminale diameter på forskellige tidspunkter kan også måles ved hjælp af softwaren er måle funktion eller ved at spore karvæggen over tid (se afsnit 6). </ Li>

5. Pressure Control Protocol

1. At studere tryk uafhængig af pålagte flow, må det samme tryk skal anvendes på hver mikropipette af servo-null Feedback pumpe. Slangen fra hver mikropipette er fastgjort via et T-stik til fælles slange monteret på pumpen. I første omgang indstille intraluminale tryk ved 2 cm H ₂ O i 45-60 min., Der er tilstrækkelig tid til at muliggøre udviklingen af lymfatisk spontane veer.
2. Til studiebrug Kun fartøjer, der opfylder følgende kriterier inden ligevægtstidspunktet perioden: (1) fartøjet udvikler spontane tone ved 2 cm H ₂ O, (2) fartøjet udvikler regelmæssige, spontane veer, som er nogenlunde ensartet over hele længden af fartøjet . Ofte området nedstrøms fra en ventil bremsende mere end resten af ​​fartøjet, og disse fartøjer vil blive brugt, så længe der er bevis for, at resten af ​​fartøjet displays kontraktile aktivitet.
3. Optag den hurtige time-lapse billeder under pres for trin. For hver, vil presset begynder ved 2 cm H ₂ O i 30 s, og derefter er opvokset i et trin ved +2, +4, +6, +8, eller 10 cm H ₂ O i et minut, og sænket ryg til 2 cm H ₂ O for 30 s.
4. Efter afslutningen af trykket trin serien, ændre bad løsning på en Ca ^{2 +-frit} APSS ved 37 ° C for at måle den maksimale passive diameter (Max D) og Ca ^{2 +-fluorescens} målinger på hvert af de ovennævnte luminale pres. Max D bruges til at beregne tone og normalisere data mellem lymfevejene af forskellig størrelse.

6. Lymfe kontraktile Parametre

1. Ændringer i beholderen diameter over tid kan bestemmes ved hjælp af objekt sporingsværktøjer i de fleste billede analyse software pakker. Dette kan opnås ved kun at bruge én af de kanaler (vi bruger 340 nm kanal, men de 380 kanal kan også bruges). En kontrast tærskel er caløj over for billedstak så karvæggen er fremhævet, og derefter ROIs omfatter hver væg er tegnet for at spore dem over tid (Figur 3 A). Den indvendige diameter kan bestemmes ved at måle det geometriske tyngdepunkt af hver væg og beregne afstanden mellem de to centroids, minus halvdelen af ​​tykkelsen af ​​hver mur.
   En anden mulighed, når det er svært at spore hver væg på grund af et stærkt signal i den luminale området er at måle ydre diameter, og bruge en korrektionsfaktor baseret på en statisk måling af karvæggen til at opnå indre diameter. I dette tilfælde spænder over ROI hele fartøjet og den ydre diameter er sporet (Figur 3 B). Denne metode kan også bruges til at bestemme hele den synlige tværsnitsareal af de lymfatiske (Figur 3 C). På grund af den typiske form af en lymphangion, kan denne sidstnævnte mulighed give et bedre estimat af den faktiske mængde af væske pumpes med hver sammentrækning end at bruge en diameter på en udvalgt delaf fartøjet.
2. Fra time-lapse undersøgelse fastlægge følgende parametre af lymfatisk luminale diameter målinger ^4,12,13:
   Sammentrækning frekvens (CF), bestemmes ved at tælle antallet af phasic sammentrækninger i minuttet.
   Slut diastoliske diameter (EDD), som er diameteren bare forud for en phasic sammentrækning.
   Slut systoliske diameter (ESD), diameteren ved slutningen af ​​en phasic sammentrækning.
   Amplitude af sammentrækning (AMP = EDD-ESD), en forenklet indeks slagvolumen.
   Den maksimale passive diameter på hvert tryk (Max D bestemmes i Ca ^{2 +-fri} betingelser), som kan bruges til at bestemme tonen genereret af lymfe glatte muskulatur, og bruges også til at normalisere data mellem lymfevejene af forskellig diameter, eller den samme lymfe studeret på forskellige luminale tryk.
   EDD _1, som er den EDD forbundet med den første sammentrækning efter et tryk skridt. Dette bruges som udgangspunkt, nårfastlæggelse myogenic konstriktion af et lymfatisk fartøj som reaktion på en trinvis forøgelse af luminale tryk ^5.
   Myogenic konstriktion af en isoleret lymfatisk efter et tryk skridt er repræsenteret ved den normaliserede ændringen i EDD efter et tryk skridt stigning = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / Max D.
   Yderligere variabler, der kan beregnes, men behandles andetsteds i detaljer ⁴ er:
   Tone = 100 * (Max D - EDD) / Max D, normaliseret AMP = AMP / Max D
   Slagvolumen indeks (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Uddrivningsfraktion (EF) = SVI / (πEDD2)
   Volume Flow Index (VFI) = CF x SVI.

7. Repræsentative resultater:

I begyndelsen af hver phasic sammentrækning, var der en forbigående stigning i [Ca ^{2 +]} _i (Figur 4). Hertil kommer, efter trin stigninger i luminale pres, hyppigheden af Ca ^{2 +} transienter og phasic sammentrækninger steg i synkront. Disse observationer er de samme som en tidligere at finde ved hjælp af thorax kanaler monteret på en ledning myograph ¹⁴ og støtte til tidligere data, der viser en central rolle for oscillerende Ca ^{2 +} frigivelse fra interne butikker i den mekanisme, der ligger til grund for phasic kontraktile cyklus ^15.

Vi har også undersøgt, om [Ca ^{2 +]} _i løbet diastole (mellem de Ca ^{2 +} transienter og phasic sammentrækninger) er forbundet med lymfe tone og myogenic konstriktion forårsaget af stræk, når trin stigninger i tryk er pålagt (figur 5). Umiddelbart efter trin stigning i presset på +4 cm H ₂ O og højere, [Ca ^{2 +]} _i løbet diastole steget støt, i forhold til baseline forud for det pres trin (Figur 5B). Hertil kommer, efter den initiale stigning i diameter grund til det trin, stigninger i tryk (EDD ₁₎ var der myogenic konstriktion (FigURE 5C), defineret som et fald i EDD fra EDD ₁ i tidligere rapporter ^5,12. Når man sammenligner den gennemsnitlige normaliserede ændringen i EDD mellem de forskellige pres trin, der var væsentligt mere konstriktion efter stigninger på +8 og +10 cm H ₂ O i forhold til +2 cm H ₂ O (figur 6 A). Den konstante stigning i [Ca ^{2 +]} _Jeg var også relateret til tryk, med trin stigninger på +6, +8, og +10 cm H ₂ O forårsager betydeligt højere ændringer i Ca ^{2 +} end 2 cm H ₂ O ( Figur 6 B). Men presset trin-Ca ^{2 +} forhold ser ud til at plateau ved disse belastninger vurderes som godt. Disse resultater tyder på, at en Ca ^{2 +-afhængige} mekanisme er forbundet med lymfatisk myogenic konstriktion som reaktion på stræk. Men plateau i det pres, trin-Ca ^{2 +} forhold tyder på en mekanisme, der øger Ca ^{2 +} følsomhed kan også bidrage til den øgede myogenic constriIndsatsen på de højere tryk trin.

Figur 1. Skematisk af mikroskopet, der anvendes til måling af [Ca ^{2 +]} _Jeg i en isoleret lymfe. Den isolerede lymfe kammeret er placeret på den fase af inverteret mikroskop. Prøven er belyst alternativt ved 340 og 380 nm, og det fluorescerende signal, der udsendes af lymfe opsamles med en CCD-kamera og opbevares i en personlig computer. Den intraluminale tryk lymfe styres af en servo-null feedback-system. Brugeren sætter pres for systemet, og tryktransducere in-line med lymfe viderebringe intraluminale pres for at den feedback system, der dynamisk kan hæve eller sænke trykket via en pumpe.

Figur 2. Eksempel på Region of Interest (ROI) valg for Fura-2 ratiometrisk billeddiagnostiske undersøgelser i isolerede lymfekar. Det valgte område omfatter det meste af skibet (eksklusive områder berøre mikropipetter) og de omkringliggende område for at sikre, at skibet vil blive sporet for hele tidsforløbet. En baggrund ROI (øverste højre hjørne) kan også bruges til at fjerne uspecifik signal fra det omgivende badet.

Figur 3. Metoder til sporing af lymfe-pumpe. A. Indvendig diameter kan bestemmes over tid ved hjælp ROIs at spore bevægelser af fartøjet vægge. B. Når kontrasten tærsklen er fastsat til at omfatte hele skibet, kan den ydre diameter spores med en enkelt ROI. Indvendig diameter kan skønnes ud fra disse målinger ved at korrigere for vægtykkelse. C. En anden mulighed er at spore i området omfattet af det fartøj, som kan bruges til at beregne volumen ved at korrigere for godstykkelse ogunder forudsætning af lymfe har cylindriske geometri.

Figur 4. Forholdet mellem [Ca ^{2 +]} _i og lymfesystemet diameter. A. Repræsentant billeder fra en time-lapse video af Fura-2 intensitet (varme kort format) i en isoleret lymfe. Pilene i hvert billede skitsere den ydre diameter af fartøjet. Billede 1 viser lymfe under diastole, med relativt lav [Ca ^{2 +]} _i. På billede 2,. Intensiteten af ​​340/380 forholdet mellem stigninger i karvæggen, lige før phasic sammentrækning, der opstår i billeder 3-5 Efter billede 4 har Ca ^{2 +} forbigående sluttede, og efter billede 5 har det systoliske fase afsluttet, og fartøjet vender tilbage til sin hviletilstand. B. Et plot af [Ca ^{2 +]} _i og lymfe luminale diameter viser, at en forbigående stigning i [Ca ^{2 +]} _Jeg finder sted lige før hverphasic sammentrækning.

Figur 5. Ændringer i lymfe [Ca ^{2 +]} _i og lymfe kontraktile cyklus som reaktion på trin stigninger i tryk. Trykket trin protokoller (A), 340/380 forholdet data, der repræsenterer [Ca ^{2 +]} _i (B), og ændringer i lymfe diameter over tid (C) er vist. A. Baseline luminale pres var 2 cm H ₂ O og lymfe-fartøjet blev udsat for trin stigninger på +2, +4, +6, +8, og +10 cm H ₂ O. Tidsintervallet mellem hvert tryk skridt optagelse blev 1-2 min. Hvert tryk trin forårsagede en stigning i både hyppigheden af forbigående stigninger i [Ca ^{2 +]} _i (B) og phasic sammentrækninger (C). Lymfe diameter også steget med hvert trin stigning i luminale pres, og for de 4 til 10 cm H ₂ O pres trin, var der et indledende fald i EDD, der opstod ofTer EDD1 (C), som tidligere beskrevet som lymfe myogenic konstriktion. Der var også en støt stigning i de basale [Ca ^{2 +]} _i mellem transienter umiddelbart efter hvert trin stigning i tryk (B). Den myogenic konstriktion var mere udtalt med de større pres trin, men stigningen i basal [Ca ^{2 +]} _Jeg var næsten det samme for de 4 til 10 cm H ₂ O tryk trin (B). En tidligere rapporteret kompenserende stigning i AMP var også synlig efter pres trin 6 til 10 cm H ₂ O (C).

Figur 6. Lymfe myogenic konstriktion og den gradvise stigning i fri [Ca ^{2 +]} _i løbet diastole, kort efter trin stigninger i tryk. A. Den gennemsnitlige EDD mellem 30-50 s efter _EDD-1 bruges til at beregne ændringen i normaliseret EDD for hvert tryk trin. B. Intensiteten af de 340/380 forholdet 30-50 s efter _EDD-1 blev divideret med den gennemsnitlige 340/380 ratioen under baseline (2 cm H ₂ O). * P <0,05 vs på +2 cm H ₂ O pres skridt. N = 4 skibe undersøgt.

Movie 1. Eksempel på phasic sammentrækninger i et isoleret lymfe fartøj, der anvendes for at studere. Den luminale pres blev sat til 2 cm H ₂ O. Den forløbne tid, og en skala bar er vist nederst. Den time-lapse billeder blev indsamlet med en 10X mål ved hjælp af transmitteret lys. Klik her for at se filmen.

Movie 2. Ratiometrisk Fura-2 billeddannelse i et pumpende isoleret lymfe. Et zonekort skala er vist øverst til venstre og den forløbne tid og skala bar er vist nederst. Trykket blev oprindeligt fastsat til 2 cm H ₂ O og blev hævet til 8 cm H ₂ O fra 0,5 min og returned til 2 cm H ₂ O på 1,5 min. Klik her for at se filmen.

En ny kombination af metoder, der var ansat til at studere iboende pumpning af lymfekar. Evnen til samtidigt at måle ændringer i [Ca ^{2 +]} _i og diameter i pumpe lymfevejene vil give mulighed for studier af de relative bidrag af Ca ^{2 +-afhængige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} signalveje i den samlede ordning, der gælder for lymfe kontraktile cyklus.

Det lymfe kontraktile cyklus består af phasic sammentrækninger ovenpå tone. Dataene viser, at hver phasic sammentrækning er forbundet med en forbigående stigning i [Ca ^{2 +]} _i, hvilket tyder på en central rolle Ca ^{2 +} i pacemaking mekanisme, og at hyppigheden af Ca ^{2 +} transienter er følsom over for ændringer i luminale pres . Vores data viser også, at en hurtig stigning i tryk kan fremkalde en støt stigning i de basale [Ca ^{2 +]} _i mellem transienter. Denne stigning kan bidrage tilden myogenic forsnævringen, der er observeret i indsamlingen lymfevejene følgende trin stigninger i luminale pres. Men vi observerede et plateau af stigningerne i denne basale [Ca ^{2 +]} _i med pres trin spænder fra 6 til 10 cm H ₂ O, som havde forskellige grader af myogenic konstriktion. Disse data tyder på, at en anden mekanisme, muligvis en Ca ^{2 +-sensibiliserende} mekanisme, der også er involveret i myogenic reaktion på pres.

En antagelse med disse undersøgelser er, at størstedelen af den målte Ca ^{2 +} er indeholdt i den glatte muskulatur. Men Ca ^{2 +} i endotelceller og andre celletyper, som kan være til stede i lymfevejene også bidrage til den samlede observerede [Ca ^{2 +]} _i, derfor de målte værdier er sandsynligvis en overvurdering af glat muskulatur [Ca ^{2 +]} _i i lymfevejene. Enhver Ca ^{2 +} målt fra endotelet forventes ikke at bidrage direktetil at udjævne muskelkontraktion baseret på tidligere undersøgelser i arterioler ^16. Dette spørgsmål vil blive behandlet i fremtidige eksperimenter, hvor lymfevejene er blottet for endothelium.

Når du bruger ratiometrisk farvestoffer til vurdering af [Ca ^{2 +]} _Jeg i celler eller væv, bevægelse af prøven kan forårsage artefakter. For at minimere bevægelse artefakter i ordregivende lymfevejene, har vi udnyttet en ROI, der omfatter så meget af fartøjet som muligt at afgøre, 340/380 nøgletal. Vi har også kun studere skibe, der forbliver i fokus i løbet af deres kontraktile cyklus. På grund af potentielle artefakter, der kan opstå som følge af fartøjets bevægelse, snarere end bestemme den absolutte [Ca ^{2 +]} _i på et bestemt websted, kan vi få den gennemsnitlige for en stor del af fartøjet. Vi fokuserer på de relative ændringer i den gennemsnitlige [Ca ^{2 +]} _i over tid, og hvordan disse ændringer vedrører phasic og tonic sammentrækning af fartøjer.

Sammenfattende DETErmination af ændringer i [Ca ^{2 +]} _Jeg ved ratiometrisk billeddannelse i isolerede indsamling lymfevejene er et effektivt redskab til at dechifrere de Ca ^{2 +-afhængige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} mekanismer, der ligger til grund for lymfe kontraktile cyklus. Med denne metode, vil fremtidige forsøg med selektive agonister eller hæmmere af forskellige signaltransduktionsveje også hjælpe med at differentiere den unikke molekylære mekanismer, der ligger phasic versus tonic nedgang i lymfe glatte muskulatur.