Sitosolik Ca ölçümü ^{2 +} İzole Kontraktil Lenfatikler

1. Hayvanlar

1. Tüm işlemler, Louisiana State Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH yayın No 85-12, 1996 revize) kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Erkek Sprague-Dawley sıçan (Charles River Laboratuvarları, 270-350 g vücut ağırlığı), kontrollü bir sıcaklık (22 ° C) ve kontrollü aydınlatma (00:12 saat aydınlık karanlık döngüsü) ortamında yerleştirildiler. Gelişinden sonra fareler, bir haftalık bir aklimasyonundan süre için sunulmuştur ve standart sıçan yemi (2018 Teklad Global% 18 Protein Kemirgen Diyet, Harlan) ve su ad libitum verilmiştir .

2. Set-Up Deney

1. Montaj lenfatikler Cam mikropipetler filament OD 1.2mm ID 0.69mm (Sutter Enstrüman BF 120-69-15) Borosilikat yapılır. Flaming / Brown Mikropipet Çektirme model P-97 (Sutter Aletleri, pipetler çekinKBB) ve ~ 60 mm dış çapa sahip bir kesik uç elde etmek için bir Micro Öğütücü EG 400 (Narishige) olan konik.
2. Mikropipetler izole damar odası (CH-1 modeli, Oturma Sistemleri, Burlington, VT) monte edin. Pipetler (aynı boyutta açma) direnç uyumlu olmalıdır.
3. Dolgu odası (5 ml) ve albümin-fizyolojik tuz çözeltisi ile mikropipetler (APSS bkz. Tablo 1). Mikropipetler veya tüp hiçbir baloncuklar olmadığından emin olun.
4. Knot overhand oftalmik sütür ve her mikropipet bir yer hazırlayın.

3. Lenfatik İzolasyon Toplama

1. (1 ml), BD şırınga ve iğne (BD intradermal konik 26G3 / 8), ketamin / xylazine bir intramüsküler enjeksiyon (sırasıyla 90 ve 9 mg / kg) ile hayvanların anestezisi.
2. Karın bölgesinde,% 70 alkol ile sterilize etmek için Sprey orta hat laparotomi yapmak ve ince barsak ve mezenter exteriorize ve özel tüketim. Ic içinde doku yerleştirin.e-soğuk APSS. Aşırı dozda ketamin / xylazine hayvanlar Euthanize ve göğüs (ötenazi Amerikan Veteriner Hekimler Derneği kurallar başına) açarak ölüm onaylayın.
3. Diseksiyonu odasında buz APSS ile dolu bir mezenter bir bölümü Pin. Dikkatlice bir stereomikroskopta yardımı ile yağ ve bağ dokusu çevresindeki lenfatik damar toplanması teşrih (80-200 mikron iç çapı ve uzunluğu 1-2 mm). (Güzel Bilim Araçları # 15.000-03) Dumont forseps-INOX 55 diseksiyon (Güzel Bilim Araçları # 11.255-20) ve yaylı makas diseksiyon kullanın. Deney süresince tüm segmentinde en uygun basınç kontrolü sağlamak için sadece bir vana ile izole damarlarda kullanın.
4. APSS 5 ml'lik izole damar odasına izole lenfatik aktarın. Oftalmik sütür bağlama gemi direnç eşleştirilmiş iki cam mikropipetler üzerine monte edin.
5. Odasının ters bir floresan mikroskop Devret (bizim bir NikTE-2000U), xenon lambası (Sutter Aletleri Lambda LS2 300 W) 340/380 filtre tekerlek sistemi (Krom Teknoloji 340 ve 380 nm eksitasyon filtreler ile Sutter Lambda 10-3), 510 nm dikroik emitör (Krom Teknoloji D510 ile donatılmıştır / 80m), hassas CCD kamera (Photometrics HQ ²⁾ ve satın alma için yazılım (Nikon Elements AR) (Şekil 1) .
6. Ya ayarlı rezervuarlar veya basınç ve debi değiştirmek için kullanılabilecek hem servo-feedback pompa sistemi (Living Sistemleri Enstrümantasyon, Burlington VT), mikropipetler kaynaklı boru takın.
7. Odasının ısıtma ünitesi (Living Systems) bağlayın ve 37 ° C'ye kadar banyo seti
8. 10X objektif (Nikon Planı Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0.17, 16.0 WD) ile odanın tabanında doğrudan lamel lenfatik gör. Hızlı time-lapse görüntü setleri görüntü elde etme yazılımı (bizim sistemi Nikon Elements AR yazılımı) kullanarak elde edilebilir.

2 +] _i oranlı metrik Ölçme

1. [Ca ^{2 +],} izole lenfatik düz kas ⁱ + algılama boya Fura 2-acetoxymethyl ester (PM) (Moleküler Probları, Eugene, OR) ^Ca 2 ile ölçülür .
2. 37 30 dakika Fura 02:00 (2 mcM) ve pluronic asit (0.2% wt / vol) içeren bir çözüm APSS banyo alışverişi Fura-2 AM lenfatik damar Yük ° C
3. 30 dakika sonra çözüm APSS geri banyo değiştirmek. Fura-2 banyo çözüm yıkamak için 2 kez durulayın. 20 dakika önce en az bir dengeleme zamanı gemi bırakın [Ca ^{2 +]} _i ölçümler izin vermek için spontan kasılmaların yeniden kurulması.
4. Alternatif olarak her biri 50 ms süreler için 340 ve 380 nm dalga boylarında aydınlatan bir satın alma protokolü ile oranlı metrik Fura-2 ölçüm izole lenfatiklerde toplayın. Chroma Te dikroik ayna (400 nm floresan ışık geçer;chnology Corp 400DCLP) ve geniş bant emisyon filtresi (510 nm, 80 nm bant genişliği; Chroma Technology Corp D510/80m) ve Photometrics HQ ² kamera ile elde edilir. Biz 2 cm H ₂ O bir temel intraluminal basınç ve +2 adım artar, 4, 6, 8 sırasında 2 dakika veri toplamak ve 10 cm H ₂ O
5. Ortalama çözümlemek için [Ca ^{2 +]} _i, tüm lenf gemi ve gemi tam gevşeme ve kasılma (Şekil 2) sırasında izlenen böylece çevredeki içeren bir ilgi bölgesi (ROI) çizin. Ya mikropipet görüş alanı ise bu alanlarda yatırım getirisi dahil edilmemelidir. Daha küçük ROI'ler küçük ROI'ler potansiyel bir sorun da ancak geminin daraltır ve rahatlatır damarı duvarlarının ROI boyuna biraz hareket etmiş olabileceğini, seçilebilir. Bir diğer potansiyel sorun, bazı damarların kasılması sırasında büküm olduğunu ve bu lenfatiklerde çalışma için kullanılmamalıdır. The büküm hareketleri genellikle izole lenfatik <1 mm uzunluğu sınırlayarak kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, bazen bir vana iki tarafta segmentleri sıkmak yok / senkronize rahatlayın. Bu durumda, çünkü bu kesimleri ayrı işlevsel lymphangions temsil, lenfatik vana sadece bir tarafında eğitim olmalıdır, ya da her lymphangion iki tarafında yerleştirilen bir yatırım getirisi ile ayrı ayrı incelenebilir. 10X objektif kullanırken, damar duvarları Ancak bu alanlarda yatırım getirisi dahil edilmemelidir kasılmalar sırasında odak duvarların herhangi bir parça vardır, fazik kasılmaları sırasında odak kalmalıdır. Arka plan ROI da kullanılır ve gemi (örneğin görüntünün köşesinde) uzak konulmalıdır. 340 / 380 oranında bir artış [Ca ^{2 +]} _i bir artış gösterir. Luminal çapı farklı zaman noktalarında (bkz. Bölüm 6) veya zamanla damar duvarları takip ederek yazılımın önlem işlevini kullanarak ölçülen olabilir./ Li>

5. Basınç Kontrol Protokolü

1. Bağımsız basınç uyguladığı akışı çalışma için boş servo geribildirim pompa ile aynı basınç her mikropipet uygulanabilir olmalıdır. Her mikropipet boru, pompa monte edilmiş ortak boru bir T-bağlayıcısı ile eklenir. Başlangıçta 45-60 dk. Lenfatik spontan kasılmaları gelişimine izin vermek için yeterli zamanı için 2 cm H ₂ O intraluminal basınç ayarlayın.
2. Çalışma için dengeleme süre içinde aşağıdaki kriterlere uygun sadece damarları kullanın: (1) gemi, 2 cm H ₂ O kendiliğinden gelişir ton (2) gemi, geminin uzunluğu boyunca makul üniform düzenli, spontan kasılmaları gelişir . Genellikle bir vana alanında downstream geminin geri kalanından daha fazla daraltır ve bu gemiler geminin kalan kontraktil faaliyet gösteren kanıt yoktur kullanılacaktır.
3. Basınç adım prosedürü sırasında hızlı time-lapse görüntüleri kaydedin. Her biri için, 30 saniye 2 cm H ₂ O basınç başlayacak, sonra 6, 4, 2 ile bir adım, bir dakika için 8 veya 10 cm H ₂ O yükseltilir ve geri indirdi 2 cm H ₂ O, 30 s.
4. Basınç adım serisi tamamlandıktan sonra, yukarıdaki luminal baskıların her maksimal pasif çapı (D Max) ve Ca ^{2 +} floresans ölçümleri ölçmek için banyo çözüm ⁺ ücretsiz APSS 37 Ca ² ° C değiştirin. D Max, tonu hesaplamak ve farklı boyutlarda lenfatikler arasında veri normalleştirmek için kullanılır .

6. Lenfatik Kontraktil parametreler

1. Zamanla damar çapı değişiklikler, çoğu görüntü analiz yazılımı paketleri nesne izleme araçları kullanılarak tespit edilebilir. Bu kanalların sadece biri (340 nm kanalı kullanılan ancak 380 kanal da olabilir) kullanılarak elde edilebilir. Bir kontrast eşik appdamar duvarları vurgulanır böylece görüntü yığın yalan ve sonra her bir duvarı kapsayan ROI (Şekil 3 A), zaman içinde onları izlemek için çizilir . Iç çapı Her duvarın kalınlığı eksi yarısı, her duvarın centroid ölçme ve iki kütle merkezleri arasındaki mesafe hesaplanırken tespit edilebilir.
   Luminal alanda güçlü bir sinyal nedeniyle her duvar izlemek için zor bir ikinci seçenek, dış çapı ölçümü ve damar duvarlarının iç çapı elde etmek için statik bir ölçüm dayalı bir düzeltme faktörü kullanmak için. Bu durumda, yatırım getirisi, tüm gemi kapsar ve dış çapı (Şekil 3 B) izlenir . Bu yöntem aynı zamanda lenfatik tüm görüntülenebilir kesit alanı (Şekil 3 C) belirlemek için kullanılabilir. Çünkü bir lymphangion tipik şekli, bu ikinci seçenek, her kasılma ile seçilen bir parçası çapı kullanmaktan daha pompalanır gerçek sıvısı hacminin daha iyi bir tahmin sağlar.Geminin.
2. Time-lapse çalışma lenfatik luminal çap ölçümleri ^4,12,13 aşağıdaki parametreleri belirler:
   Daralma frekans (CF), dakikada fazik kasılmaları sayma sayısı tarafından belirlenir.
   Fazik bir daralma hemen önce çapı diyastolik çapı (EDD), End.
   Sistol sonu çapı (ESD), fazik bir daralma sonunda çapı.
   Daralma Genlik (AMP = EDD-ESD), atım hacmi basitleştirilmiş bir dizin.
   Lenfatik düz kas tarafından üretilen sesi belirlemek için kullanılabilir ve aynı zamanda değişik çap lenfatikler arasında veri normalleştirmek için kullanılır, ya da maksimal pasif her basınçta çapı (Ca ^{2 +} ücretsiz koşulları belirlenir Max D) Aynı lenfatik farklı luminal basınçlarda okudu.
   EDD _1, basınç adımdan sonra ilk daralma ile ilişkili EDD. Bu bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılır.luminal basıncı ⁵ bir adım artışa yanıt olarak lenf damar miyojenik daralma belirleyici.
   D / Max basınç adımdan sonra izole bir lenfatik miyojenik daralma normalize değişim = 100 * (EDD ₁ EDD) bir basınç adım artış aşağıdaki EDD tarafından temsil edilmektedir.
   Hesaplanmış olabilir, ancak başka ayrıntı ⁴ tartışılmıştır ek değişkenler şunlardır:
   Ton = 100 * (Max D - EDD) D / Max, normalize AMP = AMP / Max D
   Strok volüm indeksi (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Ejeksiyon Fraksiyonu (EF) = SVI / (πEDD2)
   Debi Endeksi (VFI) = CF x SVI.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Her fazik daralma başında, [Ca ^{2 +]} _i (Şekil 4) geçici bir artış vardı. Buna ek olarak, luminal basınç adım artar sonra, frekans Ca ^{2 +} transientler ve phasic kasılmaları senkronize arttı. Bu gözlemler, bir tel ^myograph 14 üzerine monte edilmiş ve salınım ^{Ca 2} + sürümü fazik kasılma ^döngüsü 15 altında yatan mekanizma iç mağazalar için merkezi bir rol gösteren önceki verileri destek torasik kanalları kullanarak bir önceki bulmaya benzer .

Biz de araştırıldı olmadığını [Ca ^{2 +]} _i diyastolde (Ca ^{2 ila +} transientler ve fazik kasılmaları), lenfatik sesi ve basınç adım artar (Şekil 5) dayatılan streç neden miyojenik daralma ile ilişkilidir . Hemen basınç adım (Şekil 5B) evvelki göre giderek artan diyastolde 4 cm H ₂ O ve üzeri, [Ca ^{2 +]} _i, basınç adım artar. Buna ek olarak, çapı, basınç _{(EDD 1)} adım artışları nedeniyle ilk artıştan sonra, miyojenik daralma (Şekil vardıönceki raporlarda ^5,12 EDD ₁ EDD bir azalma olarak tanımlanır ure 5C). Farklı basınç adımları arasında EDD ortalama normalize değişim karşılaştırıldığında, önemli ölçüde daha fazla daralma 8 artış sonra ve 10 cm H ₂ O 2 cm H ₂ O (Şekil 6 A) . Istikrarlı bir yükseliş [Ca ^{2 +]} _i de Ca ² de anlamlı olarak daha yüksek değişikliklere neden adım +6 artar, 8 ve 10 cm H ₂ O, basınç ile ilgili ⁺ den 2 cm H ₂ O ( Şekil 6 B). Ancak, basınç adım Ca ^{2 +} ilişki de bu baskılara plato gibi görünüyor. Bu sonuçlar, Ca ^{2 +-bağımlı} bir mekanizma streç yanıt lenfatik miyojenik daralma ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Ancak, plato basınç adım Ca ^{2 +} ilişki ⁺ duyarlılık, aynı zamanda artan miyojenik constri katkıda bulunabilir Ca ² arttıran bir mekanizma öneriyoryüksek basınç adım ction.

Şekil 1 ölçümü için kullanılan mikroskop sistemi şematik [Ca ^{2 +]} _i izole bir lenfatik. Inverted mikroskop aşamasında izole lenfatik odasına yerleştirilir. Örnek, 340 ve 380 nm dalga boyunda alternatif aydınlatılmış ve lenfatik tarafından yayılan floresan sinyal bir CCD kamera ile toplanır ve kişisel bir bilgisayarda saklanır. Lenfatik intraluminal basınç boş bir servo-geribildirim sistemi tarafından kontrol edilir. Kullanıcı sistemi için basıncı ayarlar ve basınç dönüştürücüleri lenfatik in-line geri besleme sistemi, dinamik yükseltmek, ya da bir pompa aracılığı ile düşük basınç intraluminal basınç rölesini.

Şekil 2. İlgi Bölgesi Örneği (ROBen izole lenf damarlarına Fura-2 oranlı metrik görüntüleme çalışmaları için) seçimi. Seçilen bölge, geminin tüm kurs için takip edilecek sağlamak için en gemi (mikropipetler dokunmadan alanlar hariç) ve çevresini içerir. Arka plan YG (sağ üst köşe) de çevresindeki hamamı nonspesifik sinyal ortadan kaldırmak için kullanılır.

Şekil 3 pompalama izleme lenfatik Yöntemleri. A. İç çapı ROI'ler kullanarak zamanla tespit edilebilir, damar duvarları takip hareketi. B. kontrast eşiği tüm gemi olarak ayarlandığında, dış çapı tek bir yatırım getirisi ile takip edilebilir. İç çapı, duvar kalınlığı düzelterek bu ölçümler tahmin edilebilir. C . Başka bir seçenek ve duvar kalınlığı düzelterek ses düzeyini hesaplamak için kullanılabilir alan gemi kapsadığı izlemek içinlenfatik varsayarak silindirik geometri vardır.

Şekil 4 arasındaki ilişki [Ca ^{2 +]} _i ve lenfatik çapı. Izole bir lenfatik Fura-2 yoğunluğu (ısı haritası biçimi) bir time-lapse video Temsilcisi görüntüler. Her resimde oklar geminin dış çapı anahat. Resim 1 diyastolde lenfatik, nispeten düşük [Ca ^{2 +]} _i gösterir. Görüntü 2, damar duvarlarında 340/380 oranı arttıkça yoğunluğu, görüntüleri 3-5 oluşur fazik daralma hemen önce. Resmi 4 Ca ^{2 +} geçici sona erdi ve görüntü 5, sistolik faz sona erdi ve damar dinlenme haline geri dönüyor. B. [Ca ^{2 +]} _i ve lenfatik luminal çapı bir arsa, geçici bir artış ^{[Ca 2} _+] i her biri için hemen önce gerçekleştiğini gösteriyorfazik daralma.

Şekil 5 lenfatik değişiklikler [Ca ^{2 +]} _i ve lenfatik kontraktil yanıt döngüsü basınç artışları adım. Basınç adım protokolleri (A), [Ca ^{2 +]} _i (B) ve (C) üzerinde lenfatik çapı değişiklikleri temsil 340/380 oranı verileri, gösterilmiştir. A. Temel luminal basıncı 2 cm H ₂ O ve lenfatik damar +2 artış, 4, 6, 8 adım maruz kaldı ve 10 cm H ₂ O Her basınç adım kayıt arasındaki zaman aralığı 1-2 dakika idi. Her basınç adım, geçici artar hem de frekans bir artışa neden olmuştur [Ca ² _{+] i} (B) ve fazik kasılmaları (C) . Lenfatik çapı da her adım luminal basınç artışı ile artan ve 4-10 cm H ₂ O basınç adımları, af oluştu EDD bir ilk düşüş olduter EDD1 (C), daha önce lenfatik miyojenik daralma olarak tarif. Bazal istikrarlı bir artış vardı [Ca ^{2 +]} _i transientler arasında hemen her adım basınç artışı (B). Miyojenik daralma büyük basınç adımları daha belirgindir Ancak bazal [Ca ^{2 +]} artış _i H ₂ O basınç adımları (B) 4-10 cm için yaklaşık aynıydı. AMP önceden bildirilen bir telafi edici artış 6-10 cm H ₂ O (C) basınç adımlardan sonra da belliydi .

Şekil 6 basınç adım artışları kısa bir süre sonra Lenfatik miyojenik daralma ve ücretsiz olarak kademeli bir artış [Ca ^{2 +]} _i diyastolde. EDD ₁ ay sonra 30-50 sn arasında EDD ortalaması, her bir basınç adım için normalize EDD değişimi hesaplamak için kullanılır. B. ₁ EDD sonra 340/380 oranı 30-50 s yoğunluğu başlangıca sırasında ortalama 340/380 oranı (2 cm H ₂ O) tarafından ikiye bölündü. * P <0.05 2 cm H ₂ O basınç adım vs. N = 4 gemilerin okudu.

Movie 1 Örnek çalışma için kullanılan bir izole lenf damarı fazik kasılmaları. Luminal 2 cm H ₂ O basınç kuruldu Geçen süre ve bir ölçek çubuğu alt kısmında. Time-lapse görüntüleri 10X amacı ile iletilen ışık kullanılarak toplanmıştır. film izlemek için buraya tıklayın.

Pompalama izole lenfatik Movie 2 oranlı metrik Fura-2 görüntüleme. Bir ısı haritası ölçeği sol üst kısmında gösterilir ve geçen zaman ve ölçek çubuğu alt kısmında gösterilir. Basıncı başlangıçta 2 cm H ₂ O ve 0.5 dak ve returne başlayan 8 cm H ₂ O büyüdüd 1.5 min 2 cm H ₂ O film izlemek için tıklayınız.

Lenf damarları pompalama içsel çalışma yöntemleri yeni bir kombinasyonu kullanılmıştır. Aynı anda değişiklikleri ölçmek için yeteneği [Ca ^{2 +]} _i ve pompa lenfatikler çap Ca ² göreceli katkıları ^+-bağımlı ve Ca ^{2 +} lenfatik kasılma döngüsünü düzenleyen genel mekanizması duyarlılaştırıcı sinyalizasyon yolaklar çalışmaları için izin verecek

Lenfatik kasılma döngüsü ton üzerinde üst üste fazik kasılmaları oluşur. Verileri her fazik bir kasılma ^{Ca 2} + pacemaker mekanizması merkezi bir rol öneren, [Ca ² _+] geçici bir artış ile ilişkili olduğunu göstermektedir ve bu frekans ^{Ca 2} + transientler Luminal basıncındaki değişikliklere duyarlı . Bizim verilerimiz basınç hızlı artışlar aynı zamanda bazal istikrarlı bir artış ortaya çıkarmak olduğunu göstermektedir [Ca ^{2 +]} _i transientler arasında. Bu artışa katkıda bulunabilirluminal basınç adım artışları aşağıdaki lenfatikler toplama gözlenen miyojenik daralma. Ancak, biz bu bazal artışların bir plato görülmektedir [Ca ^{2 +]} _i 6 miyojenik daralma değişik derecelerde +10 cm H ₂ O, değişen basınç adımlarla. Bu veriler, başka bir mekanizma, muhtemelen Ca ^{2 +} duyarlılaştırıcı mekanizma, ayrıca basınç miyojenik yanıt olarak dahil olduğunu göstermektedir.

Bir varsayım, bu çalışmalar ile ölçülen Ca ^{2 +} çoğunluğu düz kas bulunan olmasıdır. Ancak, Ca ^{2 +,} lenfatiklerde mevcut olabilir endotelyal hücreler ve diğer hücre türleri [Ca ² _{+] i,} bu nedenle ölçülen değerler muhtemelen düz kas bir abartma [Ca ² _+] i de genel gözlenen katkıda lenfatikler. Herhangi bir ^{Ca 2} + endotel ölçülen doğrudan katkı sağlaması bekleniyor .arteriol ¹⁶ önceki çalışmalara dayalı kas kasılması pürüzsüz. Bu sorun, lenfatikler endotel arındırılır, gelecek deneylerde ele alınacaktır.

Değerlendirmek oranlı metrik boyalar kullanarak [Ca ^{2 +]} _i hücre veya dokular, numune hareket eserler neden olabilir. Lenfatikler sözleşme hareket eserler en aza indirmek için, biz 340/380 oranları belirlemek için mümkün olduğu kadar geminin içeren bir yatırım getirisi kullanılmıştır. Ayrıca, sadece kendi kasılma döngüsü sırasında odakta kalmasını damarları çalışma. Çünkü damar hareketinden ortaya ziyade belirleyebilir potansiyel eserler mutlak [Ca ^{2 _+],} belirli bir siteye, biz geminin büyük bir alan için ortalama edinin. Biz ortalama nispi değişiklikler odaklanmak [Ca ^{2 +]} _i zaman ve nasıl bu değişiklikler gemilerin fazik ve tonik kasılması ile ilgili.

Özetle, determination izole toplama lenfatiklerde oranlı metrik görüntüleme [Ca ^{2 +]} _i güçlü bir araç deşifre Ca ^{2 +-bağımlı} ve Ca ^{2 +-duyarlaştırıcı} lenfatik kasılma döngüsü altında yatan mekanizmaları. temsil Bu yöntemde, çeşitli sinyal iletim yollarının seçici agonist veya inhibitörleri kullanan gelecekteki çalışmalar da lenfatik düz kas fazik karşı tonik kasılması altında yatan benzersiz bir moleküler mekanizmaları ayırt yardımcı olacaktır.