Herbivoor-geïnduceerde Blueberry Vluchtige stoffen en Intra-plant Signaling

1. Lokale inductie van vluchtige stoffen: herbivoor schade

1. Twee takken van bosbessen planten zijn in zakken met een gesponnen polyester mouw.
2. Zes zigeuner mot rupsen (2 ^{e -3} stadia) zijn aangebracht in de zakken en liet zich te voeden met planten voor twee dagen voorafgaand aan de vluchtige collectie. Controle planten krijgen geen rupsen.
3. Vluchtige emissies zijn verzameld, zoals hieronder beschreven (protocol # 7) op dag 3 (Figuur 1). Polyester mouwen achterblijven op planten om insecten te verhinderen te ontsnappen.

2. Lokale inductie van vluchtige stoffen: mechanische schade

1. Mechanische schade aan planten wordt veroorzaakt door het ponsen van gaten tot het bedrag van bladoppervlak verwijderd door gypsy mot na te bootsen.
2. Vijf bladeren per plant zijn verwond met twee 7-mm gaten gelegen aan de voet en het bovenste gedeelte van de bladeren aan het eind van dag 1 en 2. De controle behandeling ontvangt geen mechanische schade.

3. Lokale inductie van vluchtige stoffen: MeJA

1. Blueberry planten worden behandeld met 10 ml van ofwel een 1 of 1,5 mM oplossing van MeJA in een 0,1% Tween-20-oplossing.
2. MeJA wordt aangebracht met een 2-oz spuitfles. Controle planten worden besproeid met 10 ml van een 0,1% Tween-20-oplossing.
3. Planten worden behandeld om 16:00 uur, en hield in de kas voor 15 uur in een 17 cm diameter en 35 cm hoog plexiglas kamer voorafgaand aan vluchtige collecties.
4. Vluchtige emissies worden verzameld zoals hieronder beschreven.

4. Systemische inductie van vluchtige stoffen: interne signalering

1. Een lagere tak van een bosbes plant is in zakken met een gesponnen polyester hoes en beschadigd door het plaatsen van zes (2 ^{e -3} stadia) Gypsy Moth rupsen in de zak.
2. De beschadigde tak blijft buiten de vluchtige verzameling kamer, terwijl de branches boven de beschadigde tak zijn geplaatst in de kamer (figuur 2).
3. Rupsen mogen voeden op de onderste tak voor 2 dagen.
4. Beginnend op dag 3, worden vluchtige stoffen verzameld uit de onbeschadigde deel van beschadigde planten.
5. Vluchtige stoffen worden verzameld voor 7 opeenvolgende dagen. Controle planten worden behandeld op een soortgelijke manier, maar kreeg geen herbivoor schade.

5. Vasculaire connectiviteit

1. Deze studie bepaalden de mate van vasculaire connectiviteit tussen verschillende takken binnen een bosbes plant.
2. Het eindgedeelte van een lagere tak van een plant is gesneden een bloemig water halen met 6 ml oplossing van een Rhodamine-B (Sigma-Aldrich) kleurstof (0,25% w / v), zoals beschreven in Orians et al. ondersteunen. ¹¹
3. Beweging van de kleurstof door de plant wordt dagelijks gecontroleerd op 7 dagen.
4. Na 7 dagen, wordt het bedrag van rode vlekken visueel beoordeeld vanuit verschillende posities van de plant.

6. Blootstelling aan HIPVs: externe signalering

1. Branches binnen een plant zijn ofwel blootgesteld aan HIPVs vanuit een aangrenzende kantoor of ontvangen geen blootstelling aan HIPVs.
2. Blootstellen takken HIPVs, is een lagere tak in zakken met een polyester mouw en zes (2 ^{e -3} stadia) Gypsy Moth rupsen zijn aangebracht in zakken (figuur 3).
3. De plant is opgesloten in een plexiglas kamer gelijk aan die hierboven beschreven. Insecten zijn toegestaan ​​om op planten voer voor twee dagen, zodanig dat aangrenzende takken worden blootgesteld aan vluchtige stoffen uitgestoten uit de geïnduceerde tak.
4. Na blootstelling (dag 3), worden blootgesteld takken geplaatst in de vluchtige verzameling kamer, waardoor het insect-verwonde vestiging buiten (zoals te zien in figuur 2).
5. Vluchtige stoffen uit HIPV blootgestelde takken worden verzameld zoals hieronder beschreven, en de hoeveelheid bladoppervlak wordt verbruikt uit de onderste tak worden gemeten met behulp van Scion Image Software.

7. Blootstelling aan HIPVs: priming

1. Om te bepalen of planten zijn "voorbereid" na HIPV blootstelling, zijn planten behandeld als in het protocol # 5.
2. De helft van de planten worden blootgesteld aan HIPVs van een geïnduceerde aangrenzende tak, terwijl de andere helft wordt blootgesteld aan onbeschadigd takken.
3. Op dag drie, vier vroege 2 ^e-instar zigeuner mot rupsen worden geplaatst op elke plant en vluchtige stoffen worden verzameld, zoals hieronder beschreven (Figuur 4).
4. Na vluchtige collecties, laat in eerste instantie beschadigd door gypsy mot rupsen, maar ook als degenen die beschadigd zijn op dag 3, worden weggesneden en de bedragen van de bladoppervlakte geconsumeerd worden gemeten.

8. Het verzamelen van vluchtige stoffen

1. HIPV emissies zijn bemonsterd in de kas met behulp van een push-pull systeem. Het bovengrondse deel van de potplanten (stam, takken en bladeren), met inbegrip van rupsen in de herbivoren schade behandeling, zijn aangebracht in een 4 L volategelcollectie kamer. Een 2-delig guillotine ondersteunt de basis van planten. Gezuiverde lucht komt in de top van elke kamer met een snelheid van 2 L / min.
2. Vluchtige stoffen worden verzameld in vallen gevuld met 30 mg van de Alltech Super-Q adsorbens door te trekken lucht uit de kamers met een snelheid van een L / min.
3. De vluchtige collectie apparaat bestaat uit vier kamers, waardoor gelijktijdige collecties van vluchtige stoffen uit vier verschillende planten (Figuur 1).
4. Collecties worden uitgevoerd overdag van 09:00 tot 17:00 uur
5. Na het verzamelen, alle bladeren van planten worden geoogst, oven gedroogd bij 60 ° C, en gewogen, en de kamers worden gespoeld met leidingwater en 70% ethanol.

9. Analyse van de vluchtige stoffen

1. De verzamelde vluchtige stoffen uit Super-Q traps worden geëlueerd met dichloormethaan (150 pi) en 400 ng van n-octaan wordt toegevoegd als interne standaard.
2. Scheiding en kwantificering van verbindingen wordt gedaan op een Hewlett Packard 6890 serieGaschromatograaf (GC) (figuur 5), uitgerust met een vlam ionisatie detector (FID) en een Agilent HP-1 kolom (10 mx 0,53 mm x 2,65 micrometer), en het gebruik van hij als draaggas (constante stroom = 5 ml / min , snelheid = 39 cm / sec). De temperatuur programma begon bij 40 ° C gehouden gedurende 1 minuut, steeg bij 14 ° C / min tot 180 ° C (2 min), daarna bij 40 ° C / min tot 200 ° C, en bewaard bij 200 ° C gedurende 2 minuten .
3. Poging tot identificatie van verbindingen wordt uitgevoerd op een Varian 3400 GC gekoppeld aan een Finnigan MAT 8230 massaspectrometer (MS), uitgerust met een Supelco MDN-5S kolom (30 mx 0,32 mm x 0,25 micrometer), en met He als draaggas. De MS wordt gebruikt in electron ionisatie (EI) en de totale ion chromatogram (TIC) mode bij 250 ° C (bron temperatuur). Het programma begon op 35 ° C (1 min), steeg bij 4 ° C / min tot 170 ° C, vervolgens bij 15 ° C / min tot 280 ° C.
4. Verbindingen zijn voorlopig geïdentificeerd door vergelijking van de spectrale gegevens met die van NIST bibliotheek en by GC retentie-index, en door het vergelijken van hun retentietijden met die van commercieel beschikbare verbindingen.

10. Representatieve resultaten:

Tweeëntwintig vluchtige stoffen werden geïdentificeerd uit blueberry bladeren (figuur 6). Figuur 7 toont een vertegenwoordiger van de gaschromatograaf onbeschadigd bosbessen bladeren en bladeren beschadigd door het voeren van gypsy mot. Mechanische schade en het voeden van gypsy mot rupsen verhoogde uitstoot van vluchtige stoffen ter plaatse van de blauwe bes bladeren in vergelijking met controles (figuur 8). Vergeleken met de rups voeden, de MeJA behandeling geïnduceerde 11 van de 17 verbindingen veroorzaakt door gypsy mot (Figuur 9). Er was echter geen bewijs van systemische inductie van vluchtige stoffen uit onbeschadigde bladeren van zigeuner mot beschadigde planten zeven dagen na de eerste voeding schade (dat wil zeggen, gebrek aan interne signalering) (figuur 10). Daarnaast, na een week, zeer traag bewegenment van de rode kleurstof werd waargenomen bij takken van blueberry planten (figuur 11). Er was een hoge vasculaire connectiviteit tussen vertrekt binnen een enkel bijkantoor. Er was echter intermediate-to-low verbinding tussen twee takken verticaal uitgelijnd binnen een shoot, en een lage connectiviteit tussen twee takken aan beide zijden van een shoot.

Er was geen verschil tussen de bedragen van de vluchtige stoffen uitgestoten door takken zijn blootgesteld aan HIPVs ten opzichte van degenen die niet worden blootgesteld aan HIPVs (figuur 12). Echter, HIPVs fungeren als externe defensieve signalen in bosbessen. Zigeuner mot rupsen gevoed op bladeren eerder zijn blootgesteld aan HIPVs verbruikt 71% minder bladmateriaal dan heeft die gevoed onbelichte controle bladeren (figuur 13). Bovendien hoeveelheden vluchtige stoffen uitgestoten per hoeveelheid bladoppervlak verbruikt wordt in HIPV blootgestelde takken werden 4-voudig hoger in vergelijking met niet-blootgestelde takken (figuur 14), wat aangeeft dat de bladeren van HIPV-ex stelde filialen werden meer reageren op herbivorie (dat wil zeggen, ze waren geprimed).

Figuur 1. Een push-pull systeem wordt gebruikt om vluchtige stoffen uit blueberry planten te verzamelen. Planten zijn geplaatst in glazen kamers en schone lucht wordt doorgegeven over hen. Een filter met een absorberend materiaal werd aan de zijkant van elke kamer op te vangen vluchtige stoffen die uit de plant. Een vacuüm wordt gebruikt om de lucht te trekken van de binnenkant van de kamer door het filter.

Figuur 2. Om de systemische vluchtige reactie van bosbes planten studie, waren lager bosbessen takken of beschadigd door gypsy mot rupsen (rechts kamer) of links onbeschadigd is (linker kamer). Na 2 dagen (op dag 3), werden vluchtige stoffen uit onbeschadigd bovenste takken van beschadigde en onbeschadigde planten verzameld.

Figuur 4. Om te testen of de bladeren van takken niet beschadigd zijn "voorbereid" na blootstelling aan HIPVs, experimenten werden herhaald, zoals beschreven in figuur 3, maar zigeuner mot rupsen werden geplaatst op HIPV-belichte en onbelichte takken in elke vluchtige verzameling kamer.

g "alt =" Figuur 5 "/>
Figuur 5. Na vluchtige collecties, monsters worden geïnjecteerd op een gaschromatograaf (GC) te identificeren en kwantificeren van de vluchtige stoffen uitgestoten door bosbes planten.

Figuur 6. Ten minste 22 stoffen worden uitgestoten door bosbessen bladeren.

Figuur 7. Typische gaschromatografen uit onbeschadigd bosbessen bladeren en bladeren beschadigd door gypsy mot rupsen. Vluchtige stoffen worden uitgestoten bij zeer lage bedragen uit onbeschadigd bosbessen bladeren. Echter, wanneer de bladeren beschadigd worden door gypsy mot rupsen, emissie van vluchtige stoffen enorm toegenomen.

Figuur 8. De grafiek toont de hoeveelheden van elk van 22 vluchtige stoffen uitgestoten door onbeschadigde bladeren, mechanically beschadigde bladeren en bladeren beschadigd door gypsy mot rupsen. Kunstmatige schade aan de hoeveelheid bladoppervlak verwijderd door rupsen na te bootsen meer vluchtige emissie van bosbessen bladeren, maar de reactie was anders dan de vluchtige reactie van de bladeren op zigeuner mot voeden.

Figuur 9. Getest of de JA pad vluchtige emissie in blauwe bes bladeren regelt. Planten werden besproeid met verschillende hoeveelheden MeJA. Ik vond dat toenemende concentraties van exogeen aangebrachte MeJA uitstoot van vluchtige stoffen is gestegen van bosbessen bladeren.

Figuur 10. De grafiek toont het totale bedrag van vluchtige stoffen uitgestoten van controle bosbessen takken en onbeschadigd uit takken van gypsy mot beschadigde planten (systemische reactie). Vluchtige stoffen werden verzameld voor een teTal van 7 opeenvolgende dagen. Ik vond geen systemische inductie van vluchtige stoffen zelfs 7 dagen na de eerste schade aan de onderste takken van de planten.

Figuur 11. Ik gebruikte rhodamine-B (rode kleurstof) om de mate van vasculaire connectiviteit tussen takken binnen de bosbes planten te bepalen. Ik vond dat ca.. 80%, 20%, 5% en 0% van de bladeren van takken die de kleurstof bevat, takken direct boven de tak die de kleurstof bevat, takken over de tak met kleurstof, en bijkantoren in een andere shoot in een bosbes plant, werden respectievelijk volledig gekleurd met de kleurstof.

Figuur 12. De grafiek toont de hoeveelheid vluchtige stoffen uitgestoten door takken zijn blootgesteld aan HIPVs en onbelicht takken. Ik vond dat blootstelling aan HIPVs niet vluchtige emissies in buurlanden van invloed zijnsaaie onbeschadigd bosbessen takken.

Figuur 13. De grafiek toont de hoeveelheid van het voeden door gypsy mot rupsen op Blueberry takken blootgesteld aan HIPVs en onbelicht takken. Rupsen op HIPV-blootgestelde takken verbruikt minder hoeveelheid blad in vergelijking met die op onbelicht takken.

Figuur 14. Toen ik de emissie per verbruikte oppervlakte die wordt berekend, vond ik dat HIPV belichte takken had uitstoot tarieven van de vluchtige stoffen gestegen in vergelijking met niet-belichte takken, wat aangeeft dat de blootstelling aan HIPVs gegrond bladeren in blauwe bessen takken voor een verhoogde vluchtige reactie.

De push-pull vluchtige verzameling apparaten die hier beschreven is een standaardmethode voor headspace verzamelingen van planten vluchtige stoffen. Dit apparaat werd gebruikt om de vluchtige reactie van bosbessen bladeren om herbivorie door gypsy mot rupsen te bepalen en ook kon ik nieuw bewijs voor de rol van HIPVs in de intra-plant signalering te bieden.

De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat rups voeden, exogeen aangebracht MeJA, en mechanische verwonden vluchtige emissies stegen op de plaats van schade, zij het anders. Deze resultaten geven aan dat de JA pad een belangrijke rol speelt bij de inductie van HIPVs in bosbessen.

HIPV blootstelling veroorzaakte geen vluchtige emissies. Echter, HIPV belichte takken waren klaar voor een verhoogde respons op vluchtige zigeuner mot voeden. Reageren op HIPVs door een toename van de vluchtige emissies in de afwezigheid van herbivoren zou kunnen oplopen ecologische en fysiologische costs, omdat HIPVs zouden onbetrouwbare informatie verstrekken aan de herbivoren 'natuurlijke vijanden. In plaats daarvan, zou een meer adaptieve strategie zijn voor planten om zich eerste voor een verhoogd vluchtige reactie na blootstelling aan HIPVs. Deze verhoogde snelheid van vluchtige emissie van HIPV blootgestelde bladeren kunnen dienen als een indirecte verdediging door bij voorkeur het aantrekken van de natuurlijke vijanden van herbivoren of kan een directe verdediging rol dienen sinds enkele vluchtige stoffen veroorzaakt door gypsy mot in bosbessen kunnen hebben afstotend effect op rupsen ^12.

In het kort, mijn resultaten laten zien dat bladeren van beschadigde blueberry takken informatie door te geven door middel van vluchtige stoffen die insecten voeden schade en eerste vluchtige emissies in de ontvangende bladeren van aangrenzende takken te minimaliseren. Deze resultaten, gecombineerd met die van anderen te geven sterke aanwijzingen dat HIPVs een rol spelen in het intra-plant signalering en verder aan te tonen van de multi-functionele rol van HIPVs.