Herbivore-indusert Blueberry flyktige og Intra-plante signaleringsprotokoll

1. Lokale induksjon av flyktige: herbivore skade

1. To grener av blåbær planter er sikret med en spunnet polyester ermet.
2. Seks Gypsy Moth sommerfugllarver (2 ^nd -3 ^rd instars) er plassert på innsiden av poser og lov til å mate på planter i 2 dager før volatile samling. Kontroll plantene ikke får noen sommerfugllarver.
3. Flyktige utslipp er samlet som beskrevet nedenfor (protokoll # 7) på dag 3 (figur 1). Polyester ermene forbli på planter for å hindre insekter fra å rømme.

2. Lokale induksjon av flyktige: mekanisk skade

1. Mekanisk skade på planter er påført av punching hull å etterligne mengden av blad område fjernet av sigøyner møll.
2. Fem blader per plante er skadet med to 7-mm hull plassert på basen og øvre del av blader på slutten av dag 1 og 2. Kontrollen behandlingen får ikke mekaniske skader.

3. Lokale induksjon av flyktige: MeJA

1. Blueberry planter er behandlet med 10 ml av enten en 1 eller 1,5 mM løsning av MeJA i en 0,1% Tween-20-løsning.
2. MeJA påføres ved hjelp av en 2-oz sprayflaske. Kontroll planter er sprayet med 10 mL av en 0,1% Tween-20-løsning.
3. Planter behandles kl 16:00 hr, og holdt i drivhuset i 15 hr inne i en 17-cm diameter og 35 cm høy pleksiglass kammer før volatile samlinger.
4. Flyktige utslipp er samlet som beskrevet nedenfor.

Fire. Systemisk induksjon av flyktige: intern signalering

1. En lavere filial av blåbær anlegget er sikret med en spunnet polyester ermet og skadet ved å plassere seks ^(2. -3 ^rd instars) sigøyner møll larver inni posen.
2. Den skadede grenen forblir utenfor volatile samling kammeret, mens Brancheer over den skadede grenen er plassert inne i kammeret (Figur 2).
3. Sommerfugllarver har lov til å beite på den nederste grenen i 2 dager.
4. Starter på dag 3, er flyktige hentet fra uskadde delen av ødelagte planter.
5. Flyktige samles i 7 påfølgende dager. Kontroll plantene blir behandlet på en lignende måte, men fikk ikke herbivore skade.

5. Vaskulær tilkoblingsmuligheter

1. Denne studien bestemmes graden av vaskulær tilkoblingsmuligheter mellom ulike grener innen et blåbær plante.
2. Slutten del av en lavere gren fra en plante kuttes til Ã¥ støtte en floral vannoppsug inneholder 6 mL løsning av en Rhodamine-B (Sigma-Aldrich) fargestoff (0,25% w / v), som beskrevet i Orians et al. ¹¹
3. Bevegelse av fargestoff gjennom anlegget overvåkes daglig i 7 dager.
4. Etter 7 dager, er mengden av røde flekker visuelt vurdert fra ulike posisjoner av anlegget.

Seks. Eksponering for HIPVs: eksterne signalering

1. Grener innenfor en plante er enten utsatt for HIPVs fra et tilstøtende gren eller mottatt ingen eksponering mot HIPVs.
2. Å eksponere grener til HIPVs, er en lavere gren Bagasje med en polyester ermet og seks (2 ^nd -3 ^rd instars) sigøyner møll sommerfugllarver er plassert på innsiden poser (figur 3).
3. Anlegget er i bur inne i et pleksiglass kammer lik de som er beskrevet ovenfor. Insekter har lov til å beite på planter i 2 dager, slik at tilstøtende bransjer er utsatt for flyktige stoffer som slippes ut fra den induserte grenen.
4. Etter eksponering (dag 3), er utsatt grener plassert på innsiden av flyktige samling kammer, slik at insekt-skadet gren utenfor (som vist i Figur 2).
5. Flyktige fra HIPV eksponerte greiner samles som beskrevet nedenfor, og mengden av blad område konsumert fra nedre gren måles Scion Bilde Software.

7. Eksponering for HIPVs: priming

1. For å avgjøre om plantene er "primet" etter HIPV eksponering, er planter behandlet som i protokoll # 5.
2. Halvparten av plantene er utsatt for HIPVs fra en indusert tilstøtende gren, mens den andre halvparten er utsatt for uskadet grener.
3. Den 3. dagen, fire tidlig ^2.-Instar sigøyner møll sommerfugllarver er plassert på hver plante og flyktige stoffer er samlet inn som beskrevet nedenfor (figur 4).
4. Etter volatile samlinger, etterlater i utgangspunktet ødelagt av sigøyner møll sommerfugllarver, samt de som er skadet på dag 3, er excised og mengder av blad området forbrukes måles.

8. Innsamling av flyktige

1. HIPV utslipp er prøvetatt i drivhuset med en push-pull system. Ovennevnte bakken delen av potteplanter (stilk, greiner og blader), herunder sommerfugllarver i herbivore skaden behandling, er plassert inne i et 4 L Volateppeflisekolleksjon kammer. En 2-delt giljotin støtter bunnen av planter. Renset luft kommer inn i toppen av hvert kammer med en hastighet på 2 L / min.
2. Flyktige samles i feller fylt med 30 mg av Alltech Super-Q adsorbent ved å trekke luft fra kammer med en hastighet på 1 L / min.
3. Den flyktige samling apparater består av fire kamre, noe som åpner for samtidig samlinger av flyktige stoffer fra fire forskjellige planter (Figur 1).
4. Samlinger er gjennomført på dagtid 09:00 til 17:00 h.
5. Etter samlingen, er alle blader fra plantene høstes, ovnen tørkes ved 60 ° C og veies, og kamrene er skylt med vann fra springen og 70% etanol.

9. Analyse av flyktige

1. De innsamlede flyktige fra Super-Q fellene er elueres med diklormetan (150 mL) og 400 ng av n-oktan er lagt til som intern standard.
2. Separasjon og kvantifisering av forbindelser er gjort på en Hewlett Packard 6890 SeriesGasskromatograf (GC) (figur 5), utstyrt med en flamme ionisering detektor (FID) og en Agilent HP-1 kolonne (10 mx 0,53 mm x 2,65 mm), og bruke han som bæregass (konstant flow = 5 ml / min , hastighet = 39 cm / sek). Temperaturen programmet startet ved 40 ° C oppbevares i 1 min, økt ved 14 ° C / min til 180 ° C (2 min), deretter ved 40 ° C / min til 200 ° C, og holdes ved 200 ° C i 2 min .
3. Foreløpig identifikasjon av forbindelsene er utført på en Varian 3400 GC koblet til en Finnigan MAT 8230 massespektrometer (MS), utstyrt med en Supelco MDN-5S kolonne (30 mx 0,32 mm x 0,25 mm), og med han som bæregass. MS drives i elektron ionisering (EI) og totalt ion kromatogram (TIC) modus ved 250 ° C (kilde temperatur). Programmet startet ved 35 ° C (1 min), økt ved 4 ° C / min til 170 ° C, deretter ved 15 ° C / min til 280 ° C.
4. Forbindelser er tentativt identifisert ved sammenligning av spektrale data med de fra NIST bibliotek og by GC oppbevaring indeksen, og ved å sammenlikne deres oppholdstider med de kommersielt tilgjengelige forbindelser.

10. Representant Resultater:

Tjueto flyktige ble identifisert fra blåbær blader (figur 6). Figur 7 viser en representant Chromatograph av uskadet blåbær blader og løv skadet av fôring av sigøyner møll. Mekaniske skader og fôring av sigøyner møll sommerfugllarver økt flyktige utslipp lokalt fra blåbær blader sammenlignet med kontroller (Figur 8). Sammenlignet med caterpillar fôring, induserte MeJA behandling 11 av de 17 forbindelsene indusert av sigøyner møll (figur 9). Det var imidlertid ingen holdepunkter for systemisk induksjon av flyktige fra uskadde blader av sigøyner møll-skadet planter sju dager etter første fôring skader (dvs. mangel på intern signalering) (Figur 10). I tillegg, etter en uke, veldig treg flyttering av rødt fargestoff ble observert blant grenene av blåbær planter (Figur 11). Det var høy vaskulær tilkoblingsmuligheter blant bladene innenfor en enkelt gren. Men det var middels-til-lav-tilkobling mellom to grener vertikalt innenfor en skyter, og lav tilkobling mellom to greiner på motsatte sider av et skudd.

Det var ingen forskjell mellom mengder flyktige stoffer som slippes ut fra greinene utsatt for HIPVs versus de som ikke er utsatt for HIPVs (Figur 12). Men HIPVs fungere som ekstern defensive signaler i blåbær. Gypsy Moth larvene fôres på bladene tidligere eksponert for HIPVs konsumert 71% mindre leaf materiale enn gjorde de matet på ueksponerte kontroll blader (Figur 13). Videre ble mengder av flyktige stoffer som slippes ut per mengde blad område som forbrukes i HIPV eksponerte greiner fire ganger høyere sammenlignet med ueksponerte grener (Figur 14), som indikerer at bladene fra HIPV-ex poserte grenene var mer lydhør for herbivory (dvs. de var primet).

Figur 1. En push-pull-systemet brukes til å samle flyktige stoffer fra blåbær planter. Planter er plassert inne glass kamre og ren luften er gått over dem. Et filter som inneholder et absorberende materiale var festet til siden av hvert kammer å fange flyktige stoffer som slippes ut fra anlegget. Et vakuum brukes til å trekke luft fra innsiden av kammeret gjennom filteret.

Figur 2. For å studere systemiske flyktige respons fra blåbær planter, var lavere blåbær grener enten skadet av sigøyner møll sommerfugllarver (til høyre kammer) eller venstre uskadet (venstre kammer). Etter 2 dager (på dag 3), ble det flyktige fra uskadde øvre grener fra skadet og uskadet planter innsamlet.

ontent ">
Figur 3. For å teste om blader fra uskadde grener svare på HIPVs fra skadede greiner, Bagasje jeg en av grenene i hver av blåbær planter. Jeg deretter plassert sigøyner møll sommerfugllarver inne i poser med halvparten av plantene. Posene jeg brukte tillate bevegelse av flyktige stoffer fra innsiden til utsiden av poser. Planter ble plassert inne i pleksiglass kamre å eksponere uskadet grener til HIPVs. Flyktige ble deretter samlet inn fra utsatte bransjer.

Figur 4. For å teste om blader fra uskadde grener er "primet" etter eksponering for HIPVs, Forsøkene ble gjentatt som beskrevet i figur 3, men sigøyner møll sommerfugllarver ble plassert på HIPV-eksponert og ueksponert grener innenfor hver volatile samling kammer.

g "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Etter volatile samlinger, er prøver injisert på en gasskromatograf (GC) til å identifisere og kvantifisere flyktige stoffer som slippes ut fra blåbær planter.

Figur 6. Minst 22 forbindelser avgis fra blåbær blader.

Figur 7. Typiske chromatographs fra uskadde blåbær blader og løv skadet av sigøyner møll sommerfugllarver. Flyktige stoffer slippes ut ved svært lave beløp fra uskadde blåbær blader. Men når bladene er skadet av sigøyner møll sommerfugllarver, økt utslipp av flyktige dramatisk.

Figur 8. Grafen viser mengder av hver av 22 flyktige stoffer som slippes ut fra uskadde blader, mechanically-skadet blader, og bladene skadet av sigøyner møll sommerfugllarver. Kunstig skade å etterligne mengden av blad område fjernet av sommerfugllarver økt volatile utslipp fra blåbær blader men responsen var forskjellig fra de volatile responsen av bladene til sigøyner møll fôring.

Figur 9. Testet om JA pathway regulerer volatile utslipp i blåbær blader. Planter ble sprayet med ulike mengder MeJA. Jeg fant at økende konsentrasjoner av eksogent-anvendt MeJA økte utslipp av flyktige stoffer fra blåbær blader.

Figur 10. Grafen viser den samlede flyktige stoffer som slippes ut fra kontroll blåbær grener og fra uskadde greiner fra sigøyner møll skadede planter (systemisk respons). Flyktige ble samlet for en tilTal på 7 påfølgende dager. Jeg fant ingen systemisk induksjon av flyktige selv 7 dager etter første skade på nedre grener av planter.

Figur 11.. Jeg brukte rhodamine-B (rødt fargestoff) for å fastslå graden av vaskulær tilkoblingsmuligheter blant grenene innen blåbær planter. Jeg fant at ca. 80%, 20%, 5% og 0% av blader fra grener som inneholder fargestoff, grenene rett over grenen som inneholder fargestoff, grener over grenen som inneholder fargestoff, og grener plassert i en annen skyte innen en blåbær plante, henholdsvis, ble fullt farget med fargestoff.

Figur 12. Grafen viser mengden flyktige stoffer som slippes ut fra greinene utsatt for HIPVs og ueksponert grener. Jeg fant ut at eksponering for HIPVs ikke påvirker flyktige utslipp i nabolandkjedelig uskadet blåbær grener.

Figur 13. Grafen viser mengden fôring av sigøyner møll sommerfugllarver på blåbær grener utsatt for HIPVs og ueksponert grener. Sommerfugllarver på HIPV-eksponerte greiner forbrukes mindre beløp av løvverk sammenlignet med dem på ueksponerte grener.

Figur 14. Når jeg beregnet utslipp per området konsumert, fant jeg ut at HIPV eksponerte greiner hadde økt utslipp forekomst av flyktige stoffer sammenlignet med ueksponerte grener, noe som indikerer at eksponering for HIPVs primet bladene i blåbær grener for økt volatile respons.