Planteæder-induceret Blueberry Flygtige stoffer og intra-anlæg Signaling

1. Lokale induktion af flygtige stoffer: planteæder skader

1. To grene af blåbær planter er i sække med en spundet polyester ærme.
2. Seks sigøjner-møl larver (2 ^nd -3 ^rd instars) er placeret inde i poser og lov til at leve af planter i 2 dage før flygtige kollektion. Kontrol planterne ikke modtager nogen larver.
3. Flygtige emissioner er indsamlet som beskrevet nedenfor (protokol # 7) på dag 3 (Figur 1). Polyester ærmer forblive på planterne for at forhindre insekter i at undslippe.

2. Lokale induktion af flygtige stoffer: mekaniske skader

1. Mekaniske skader på planter påføres ved at presse huller til at efterligne mængden af ​​bladareal fjernes ved sigøjner møl.
2. Fem blade per plante er såret med to 7-mm huller placeret i bunden og øvre del af blade i slutningen af ​​dag 1 og 2. Kontrollen behandling ikke får mekaniske skader.

3. Lokale induktion af flygtige stoffer: MeJA

1. Blueberry planter er behandlet med 10 ml af enten en 1 eller 1,5 mM opløsning af MeJA i en 0,1% Tween-20-løsning.
2. MeJA påføres med en 2-ounce sprayflaske. Kontrol planterne er sprøjtet med 10 ml af en 0,1% Tween-20-løsning.
3. Planter er behandlet kl 16:00 HR, og opbevares i drivhuset for 15 HR inde i en 17-cm i diameter og 35-cm høj plexiglas kammer før flygtige samlinger.
4. Flygtige emissioner er indsamlet som beskrevet nedenfor.

4. Systemisk induktion af flygtige stoffer: intern signalering

1. En lavere filial af et blåbær anlæg er i sække med en spundet polyester ærme og beskadiget ved at placere seks ^(2. -3 ^rd instars) sigøjner-møl larver inde i posen.
2. De beskadigede gren forbliver uden de volatile kollektionen kammeret, mens branches over det skadede filialen er placeret inde i kammeret (figur 2).
3. Larver er tilladt at fodre på den nederste gren i 2 dage.
4. Startende på dag 3, er flygtige indsamles fra de ubeskadigede del af beskadigede planter.
5. Flygtige stoffer er indsamlet i 7 dage i træk. Kontrol planter behandles på samme måde, men har ikke modtaget planteæder skader.

5. Vaskulære tilslutningsmuligheder

1. Denne undersøgelse bestemmes graden af ​​vaskulær konnektivitet mellem de forskellige grene inden for en blåbær plante.
2. Slutningen del af en lavere gren fra en plante er skÃ¥ret til at understøtte et blomstermotiv vand pick indeholdende 6 ml løsning af et Rhodamine-B (Sigma-Aldrich) farvestof (0,25% w / v), som beskrevet i Orians et al. ¹¹
3. Flytning af farvestoffet gennem anlægget overvåges dagligt i 7 dage.
4. Efter 7 dage er mængden af ​​røde pletter visuelt vurderes ud fra forskellige positioner af anlægget.

6. Udsættelse for HIPVs: eksternt udstyr

1. Filialer inden for en plante er enten udsat for HIPVs fra en tilstødende filial eller modtaget nogen udsættelse for HIPVs.
2. At udsætte grene til HIPVs, er en lavere gren i sække med en polyester ærme og seks (2 ^nd -3 ^rd instars) sigøjner-møl larver er placeret inde i poser (Figur 3).
3. Anlægget er i bur inde i en plexiglas kammer svarer til dem, der er beskrevet ovenfor. Insekter er tilladt at fodre på planter i 2 dage, således at tilstødende brancher er udsat for flygtige udsendes fra den inducerede gren.
4. Efter eksponering (dag 3), er udsat grene placeret inde i flygtige kollektionen kammer, forlader insekt-skadede gren uden for (som ses i Figur 2).
5. Flygtige stoffer fra HIPV-eksponerede grene er indsamlet som beskrevet nedenfor, og mængden af ​​bladareal forbruges fra den nederste gren måles ved hjælp af Scion Image Software.

7. Udsættelse for HIPVs: grunding

1. At afgøre, om planterne er "primet" efter HIPV eksponering, er planter behandles som i protokol nr. 5.
2. Halvdelen af ​​planterne er udsat for HIPVs fra en induceret tilstødende gren, mens den anden halvdel er udsat for ubeskadiget filialer.
3. På dag 3, fire tidlige søjle ^2-instar sigøjner-møl larver er placeret på hver plante, og flygtige stoffer er indsamlet som beskrevet nedenfor (Figur 4).
4. Efter flygtige samlinger, forlader først beskadiget af sigøjner-møl larver, såvel som dem, der er beskadiget på dag 3, er skåret ud og mængder af bladareal forbruges måles.

8. Indsamling af flygtige stoffer

1. HIPV emissioner er udtaget i drivhuset med en push-pull system. Den overjordiske del af potteplanter (stamme, grene og blade), herunder larver i planteædere skaden behandling, er anbragt i en 4 L volatæppeflisekollektion kammer. En 2-piece guillotine understøtter bunden af ​​planter. Renset luft ind i toppen af ​​hvert kammer med en hastighed på 2 L / min.
2. Flygtige stoffer er indsamlet i fælder fyldt med 30 mg Alltech Super-Q adsorbent ved at trække luft fra kamre med en hastighed på 1 L / min.
3. De flygtige samling Apparatet består af fire kamre, der giver mulighed for samtidig samlinger af flygtige stoffer fra fire forskellige planter (Figur 1).
4. Samlinger udføres i dagtimerne fra 9:00 til 17:00 h.
5. Efter opsamlingen, er alle blade fra planter høstet, ovntørret ved 60 ° C, og vejes, og kamre er skylles med vand fra hanen og 70% ethanol.

9. Analyse af flygtige stoffer

1. De indsamlede flygtige stoffer fra Super-Q fælder elueres med dichlormethan (150 μl) og 400 ng af n-oktan er tilsat som intern standard.
2. Separation og kvantificering af stoffer sker på en Hewlett Packard 6890 SeriesGaskromatograf (GC) (Figur 5), der er udstyret med en flammeionisationsdetektor (FID) og en Agilent HP-1 kolonne (10 mx 0,53 mm x 2,65 m), og bruger han som bæregas (konstant flow = 5 ml / min , hastighed = 39 cm / sek). Temperaturen Programmet startede ved 40 ° C holdes i 1 min, øget ved 14 ° C / min til 180 ° C (2 min), derefter ved 40 ° C / min til 200 ° C og holdes ved 200 ° C i 2 min .
3. Tentativ identifikation af stoffer er foretaget på en Varian 3400 GC koblet til et Finnigan MAT 8230 massespektrometer (MS), der er udstyret med en Supelco MDN-5S kolonne (30 mx 0,32 mm x 0,25 m), og med han som bæregas. MS drives i elektron ionisering (EI) og total ion kromatogram (TIC) tilstand ved 250 ° C (kilde temperatur). Programmet startede ved 35 ° C (1 min), øget ved 4 ° C / min til 170 ° C, og derefter ved 15 ° C / min til 280 ° C.
4. Forbindelser er foreløbigt identificeret ved sammenligning af spektrale data med dem fra NIST bibliotek og by GC fastholdelse indeks, og ved at sammenligne deres retentionstider med dem kommercielt tilgængelige forbindelser.

10. Repræsentative resultater:

Toogtyve flygtige stoffer blev identificeret fra blåbær blade (figur 6). Figur 7 viser en repræsentant kromatografen af ubeskadiget blåbær blade og blade beskadiget ved fodring af gypsy møl. Mekaniske skader og fodring af sigøjner-møl larver øget flygtige emissioner lokalt fra blåbær blade i forhold til kontrolgruppen (Figur 8). Sammenlignet med Caterpillar fodring, induceret af MeJA behandling 11 ud af de 17 stoffer induceret af sigøjner-møl (figur 9). Der var dog ingen tegn på systemisk induktion af flygtige stoffer fra ubeskadigede blade af sigøjner-møl-beskadigede planter syv dage efter første fodring skade (dvs. manglende intern signalering) (Figur 10). Hertil kommer, efter en uge meget langsomt bevæge sigling af den røde farve blev observeret blandt grene af blåbær planter (Figur 11). Der var høje vaskulære tilslutning mellem bladene i en enkelt gren. Men der var mellemliggende-til-lave forbindelsen mellem to grene lodret linje inden for en skyde, og lave forbindelsen mellem to afdelinger på hver sin side af et skud.

Der var ingen forskel mellem mængder af flygtige stoffer udledt fra filialer udsættes for HIPVs versus dem, der ikke er udsat for HIPVs (Figur 12). Men HIPVs fungere som ekstern defensive signaler i blåbær. Gypsy møl larver fodret med blade tidligere har været udsat for HIPVs forbrugt 71% mindre bladmateriale end gjorde dem fodret med ueksponerede kontrol blade (figur 13). Desuden mængder af flygtige stoffer der udledes pr mængden af bladareal forbruges i HIPV-eksponerede grene var 4 gange højere sammenlignet med ueksponerede grene (Figur 14), hvilket indikerer, at blade fra HIPV-ex stillet grene var mere lydhøre over for herbivory (dvs. de var primet).

Figur 1. En push-pull-system bruges til at indsamle flygtige stoffer fra blåbær planter. Planter er placeret inde glas kamre og ren luft er gået over dem. Et filter, der indeholder en absorberende materiale blev fastgjort til siden af ​​hvert kammer for at fange flygtige udsendes fra anlægget. Et vakuum bruges til at trække luft fra indersiden af ​​kammeret gennem filteret.

Figur 2. At studere den systemiske flygtige svar fra blåbær planter, var lavere blåbær grene enten beskadiget af sigøjner-møl larver (højre kammer) eller venstre ubeskadiget (venstre kammer). Efter 2 dage (på dag 3), blev flygtige stoffer fra uskadte øverste grene fra beskadigede og ubeskadigede planter indsamlet.

Figur 4. For at teste, om blade fra ubeskadiget grene er "primet" efter udsættelse for HIPVs, eksperimenter blev gentaget som beskrevet i figur 3, men sigøjner-møl larver blev placeret på HIPV-eksponerede og ueksponerede grene inden for hver flygtige kollektion kammer.

g "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Efter flygtige kollektioner, er prøverne injiceres på en gaskromatograf (GC) for at identificere og kvantificere de flygtige stoffer der udledes fra blåbær planter.

Figur 6. Mindst 22 stoffer, der udsendes fra blåbær blade.

Figur 7. Typiske chromatografer fra ubeskadiget blåbær blade og blade beskadiget af sigøjner-møl larver. Flygtige stoffer udledes ved meget lave beløb fra ubeskadiget blåbær blade. Men når bladene bliver skadet af sigøjner-møl larver, udledning af flygtige stoffer steget dramatisk.

Figur 8. Grafen viser de beløb, hver af 22 flygtige stoffer der udledes fra ubeskadigede blade, mechanically-beskadigede blade, og efterlader beskadiget af sigøjner-møl larver. Kunstig skade at efterligne mængden af ​​bladareal fjernes ved larver øget flygtige emission fra blåbær blade, men svaret var forskellig fra de flygtige svar af blade til sigøjner-møl fodring.

Figur 9. Testet hvorvidt JA vejen regulerer flygtige emission i blåbær blade. Planterne blev sprøjtet med forskellige mængder af MeJA. Jeg fandt, at stigende koncentrationer af eksogent-anvendte MeJA øget udledning af flygtige stoffer fra blåbær blade.

Figur 10. Grafen viser de samlede mængder af flygtige stoffer udledt fra kontrol blåbær filialer og fra ubeskadiget grene fra sigøjner-møl beskadigede planter (systemisk reaktion). Flygtige stoffer blev indsamlet for en tilTal for 7 dage i træk. Jeg fandt ingen systemiske induktion af flygtige stoffer, selv 7 dage efter første skade på nederste grene af planter.

Figur 11. Jeg brugte rhodamine-B (rød farve) til at bestemme graden af vaskulær tilslutning mellem afdelinger inden for blåbær planter. Jeg fandt, at ca. 80%, 20%, 5% og 0% af blade fra grene, der indeholder farvestoffet, grene lige over den gren, der indeholder farvestoffet, filialer på tværs af branchen, der indeholder farvestoffet, og filialer i en anden skyde i en blåbær plante, henholdsvis var fuldt farvet med farvestoffet.

Figur 12. Grafen viser mængden af flygtige stoffer der udledes fra grene udsat for HIPVs og ueksponerede filialer. Jeg fandt, at udsættelse for HIPVs ikke påvirkede flygtige emissioner i nabolandenekedelige ubeskadiget blåbær filialer.

Figur 13. Grafen viser mængden af fodring af sigøjner-møl larver om blåbær grene udsat for HIPVs og ueksponerede filialer. Larver på HIPV-udsatte brancher forbruges mindre mængde af blade sammenlignet med dem på eksponerede filialer.

Figur 14. Da jeg beregnede udledning pr forbrugt området, opdagede jeg, at HIPV-eksponerede grene havde øget udledning satser af flygtige stoffer sammenlignet med eksponerede grene, hvilket indikerer, at eksponering for HIPVs primet blade i blåbær grene for en øget flygtige respons.

Push-pull flygtige samling apparatur beskrevet her repræsenterer en standardmetode for headspace samlinger af plante-flygtige stoffer. Dette apparat blev brugt til at bestemme flygtige reaktion blåbær blade til herbivory af sigøjner møl, larver og også givet mig mulighed for at levere nye beviser for den rolle, HIPVs i samhandelen inden for plante signalering.

Resultaterne præsenteres her viser, at Caterpillar fodring, eksogent-anvendte MeJA, og mekaniske sårede øget flygtige emissioner på stedet af skader, men anderledes. Disse resultater tyder på, at JA vej spiller en central rolle i induktion af HIPVs i blåbær.

HIPV eksponering inducerede ikke flygtige emissioner. Men HIPV-eksponerede filialer blev primet for en øget flygtige svar på sigøjner-møl fodring. Som svar på HIPVs af en stigning i flygtige emissioner i mangel af planteædere kan pådrage økologiske såvel som fysiologiske costs, fordi HIPVs kan give upålidelige oplysninger til planteædere 'naturlige fjender. I stedet kan en mere adaptiv strategi for planter til at prime sig for en øget flygtige reaktion efter udsættelse for HIPVs. Denne øgede sats af flygtige emission fra HIPV-eksponerede blade kan tjene som et indirekte forsvar ved fortrinsvis at tiltrække de naturlige fjender planteædere eller kan tjene en direkte forsvar rolle, da flere flygtige induceret af sigøjner-møl i blåbær kan have frastødende virkning på larver ^12.

Sammenfattende viser mine resultater, at blade fra beskadigede blåbær grene videregive oplysninger gennem flygtige stoffer, der minimerer insekt fodring skader og prime flygtige emissioner i den modtagende bladene af tilstødende filialer. Disse resultater sammen med dem, som andre giver stærke beviser for, at HIPVs spille en rolle i intra-anlæg signalering og yderligere at demonstrere den multi-funktionelle roller HIPVs.