Синтез, монтаж, и характеристика монослоя охраняемые пленок золота наночастицы для Белки электрохимии монослоя

1. Hexanethiolate монослоя охраняемые Золотой Синтез кластеров

Hexanethiolate функционализированных монослоя защищены кластеров золота (ПДК) синтезируются следующих 2:01 1-hexanethiol (C6) для золотой пропорции моль для получения среднего структуры Au ₂₂₅ (C6) _75. ^4-9 Конкретные изменения в Браст реакции, как лигандов типа, конкретных тиоловых к золотым отношения, температуры и скорости реакции родов, или после синтеза лечения, ^9-11 могут дать разнообразные ПДК с различной основных размеров и функциональных защитных групп, соответственно. ⁴ приблизительный ПДК ( в среднем) композиции ПДК функционализированных с различными alkanethiol группы можно определить, протон ⁽¹ H), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) анализа йод-разлагается образцов.

1. Растворите 1,1 г tetraoctylammonium бромид (TOABr) в 30 мл толуола с соответствующими дыма вентиляционной вытяжки.
2. Растворить 0,38 г боргидрида натрия (NaBH ₄₎ в ~ 20 мл 18 Мом ultrapurified воды (до H ₂ O) и позволяют охлаждать со льдом в течение 30 мин.
3. Растворить 0,31 г водорода tetrachloroaurate (HAuCl ₄₎ в ~ 20 мл UP H ₂ O и количественно перенесите решение смеси TOABr-толуол решения с использованием дополнительных ~ 5 мл UP H ₂ O, чтобы межфазного водный золото Решение неводных решение. Движение строго в то время как слегка ограничен в течение 30 минут так оранжевый водных и неводных ясно фазы замешивая хорошо.
4. Передача как ясно водных и неводных оранжевый фазы в делительную воронку. Отменить водный (нижний) слой и слейте неводных (верхний) слой в чистую колбу.
5. Добавить С6 в соотношении 2:1 с HAuCl ₄ до неводных решение. Перемешать в течение 30 мин для формирования Au (I), полимер, как обнаружено изменение цвета от оранжевого до красновато бледно-желтый, почти бесцветный раствор.
6. Передача реакционной смеси до изолированных ледяной бане и охладите до 0 ° С в течение 30 мин при перемешивании.
7. Количественно и быстро добавить охлажденное NaBH ₄ решения реакционной смеси с целью снижения Au (I) для металлического золота в присутствии тиолов, мгновенно образуя густой черный решение ПДК при добавлении. Движение реакции на ночь при 0 ° C.
8. Передача реакционной смеси в делительную воронку, выбросьте водный (нижний) слой в стакан отходов и поворотные испаряются неводных (вверху) слой толуола почти полной сухости оставив тяжелый черный осадок в колбу.
9. Осадок ПДК, добавив ацетонитрила и позволяющий на ночь.
10. Сбор ПДК путем вакуумной фильтрации с помощью стеклянной фритты средней пористости с резиновой арматуры и побочные вооруженных колбу с аспиратором и смыть обильным количеством ацетонитрила.
11. Разрешить ПДК высохнуть на воздухе, взвешивают продукт, характеризуют методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и ЯМР-анализа и хранения ограничен для использования в будущем. Получить ПЭМ-изображения за каплей литья ПДК растворенного в толуоле на формвар / углерода поддержки пленки на медной сетке (400 меш) и операционной ТЕМ инструмента на 80-100 кВ. Средний размер ядра может быть оценена с помощью программного обеспечения для анализа изображений, таких как изображения J (бесплатный).

2. Фильм Ассамблеи: дитиола связанных MPC фильм Ассамблеи для Белки электрохимии монослоя

Золотой подложке первый электрохимически очищены и модифицированных C6 SAM перед погружением в переменном решения дисульфидных связей молекул и C6 изменение ПДК восполнить "провал цикла", которая повторяется несколько раз, чтобы в конечном счете, форма дитиола связанных MPC фильм сборки . Как описано в предыдущих исследованиях, ² оригинальных плазмиды для синегнойной палочкой azurin (AZ) белок был милостиво дает доктор Кори Уилсон из Университета Райса и А-Я был представлен в качестве очищенный и лиофилизированный порошок в Университете Ричмонда профессор, д-р Джонатан Dattelbaum, которая впоследствии была регидратации с 4,4 мМ калий-фосфатном буфере (КПБ, рН = 7.0, μ = 10 мм), чтобы создать 5-10 мкМ решение будет проверено ультрафиолетового видимым (UV-VIS) анализа.

1. Соберите электрохимической (echem) сэндвич ячейки в следующем порядке снизу вверх: сначала фиксатор Lucite пластина, золотой подложки в качестве рабочего электрода, латунь электрический контакт с золотом рабочем электроде, в первую резиновую прокладку, Viton о-кольцо, которое определяет площадь электрода (0,32 см ^2), стеклянная клетка тела, во-вторых резиновую прокладку, и второй фиксатор Lucite пластины. Всей клетки держится на резьбовых шпилек и тщательно затянуты гайками. Ячейка оснащена промышленно электрод сравнения, что дома стеклянной бочке с 1 М KCl насыщенный, Ag / AgCl ссылкой провода, и Pt вспомогательных электродной проволокой.
2. Электрохимически чистой йэлектронной золотой подложке, выполняя циклической вольтамперометрии (CV) в потенциальной окна от 0,2 до 0,9 В, 0,2 до 1,2 В и 0,2 В до 1,35 (против Ag / AgCl, KCl) при 100 мВ / с в раствор 0,1 М H ₂ SO ₄ и 0,01 М KCl.
3. Измерьте ток заряда очищены обнаженного субстрата золото, выполняя резюме на «стандартных условиях», в том числе потенциальных окна от 0,1 до 0,4 В (против Ag / AgCl, KCl) сканируется на 100 мВ / с в КПБ. ¹ Discard КПБ и промойте последовательно UP H ₂ O, этанола (этанол), УП H ₂ O, а также этанола.
4. Expose очищены золотой подложке до ~ 300 мкл 5 мМ C6 раствора в этаноле и позволяют сидеть быстро сформировать упорядоченные C6 SAM. Отменить решение C6 из клетки и промыть последовательно этанолом, УП H ₂ O, EtOH, и до H ₂ O.
5. Измерьте ток зарядки SAM при стандартных условиях. Отменить КПБ и промыть последовательно UP H ₂ O, EtOH, УП H ₂ O, а также этанола. Зарядного тока должна быть заметно снизилась с, что из голой измерения золота (шаг 2,3) ^1.
6. Expose золото SAM изменение подложки ~ 300 мкл 5 мМ 1,9-nonanedithiol (NDT) раствор в этаноле и позволить сесть за 1 ч до interdisperse NDT связи молекул в С6 SAM. Отменить решение неразрушающего контроля и промыть последовательно и тщательно этанолом, УП H ₂ O, EtOH, УП H ₂ O, и метиленхлорид (CH ₂ Cl _2).
7. Expose золотой подложки для решения ПДК CH ₂ Cl ₂ (~ 1 мг / мл) при перемешивании при медленно кипит N ₂ газ в течение 1 часа. При необходимости замените испарились MPC решение с более CH ₂ Cl _2. Это якорь MPC слоя пленки сборки. Отменить решение MPC и снова промыть последовательно CH ₂ Cl _2, УП H ₂ O, и КПБ.
8. Измерьте ток заряда слой ПДК при стандартных условиях. Отменить КПБ и промыть последовательно UP H ₂ O и CH ₂ Cl _2.
9. Expose золотой подложки ~ 300 мкл 5 мМ NDT решение CH ₂ Cl ₂ с агитации медленно кипит N ₂ газ в течение 20 мин.
10. Отменить неразрушающего контроля и тщательно промыть CH ₂ Cl _2. Повторите шаги 2.7 и 2.8 для нанесения второго слоя ПДК фильм сборки.
11. Для нанесения дополнительных слоев MPC, шаги 2.9 и 2.10 повторяются. С каждым дополнительным слоем MPC соответствующего увеличения зарядного тока не наблюдается.
12. После фильма сетевых MPC завершена, промойте фильм изменение подложки с КПБ. Я белка, адсорбированного на монтажной пленки ПДК инъекционных ~ 150 мкл ~ 5-10 мкМ AZ решения КПБ в клетку сэндвич echem и позволяет сидеть закрыт крышкой, а в холодильнике как минимум 1 час.
13. Удалить ячейки echem из холодильника и дайте ему вернуться в ближайшее комнатной температуре. Тщательно промыть КПБ, заправка echem ячейки с КПБ, и пузырь КПБ с N ₂ газ в течение 10 мин.
14. Белки монослоя электрохимические исследования выполнены в виде резюме на потенциальных окно от -0,25 В до 0,25 В (против Ag / AgCl, KCl) сканируется на 100 мВ / с в КПБ.

3. Фильм Ассамблеи: дитиола связанных MPC фильм Ассамблеи для оптического слежения

До ПДК растущей пленки для оптических оценку, разделы стекле предварительно очищают Piranha решение (Внимание! 2:01 сосредоточены H ₂ SO ₄ и H ₂ O ₂₎ и обрабатывают (3-меркаптопропил)-trimethoxysilane (3-MPTMS ). ^1-2 ПДК фильмы затем собраны на этих модифицированных стекол использовании "провал цикла" техники, как ранее описано выше.

1. Промыть 3-MPTMS изменение стекло с CH ₂ Cl ₂ и поместить его в раствор ПДК CH ₂ Cl ₂ (~ 1 мг / мл) в течение 1 часа при перемешивании на качалке на низкой скорости. Это завершает первый слой ПДК фильм сборки, привязывая к ПДК меркаптанов концевых групп из силана. Промыть тщательно слайд с CH ₂ Cl _2, и сухой с N ₂ газ. Возьмите UV-VIS спектра (от 400 до 1000 нм) слайд, и снова промыть с CH ₂ Cl _2.
2. Место слайда в 5 мМ NDT решение CH ₂ Cl ₂ в течение 1 часа при перемешивании на качалке на низкой скорости. Промыть слайд с CH ₂ Cl _2.
3. Место слайда в решении ПДК в течение 1 часа при перемешивании на качалке на низкой скорости. Это завершает второй слой ПДК фильм сборки. Промыть тщательно слайд с CH ₂ Cl _2, насухо N ₂ газ, а также принять UV-VIS спектра (от 400 до 1000 нм) слайду. Поглощения по всему спектру должны увеличиваться в качестве дополнительного слоя MPC адсорбируются на фильм сборки.
4. Для нанесения дополнительных слоев MPC, улEPS 3.2-3.3 повторяются.

4. Характеристика монослоя охраняемые Золото Ассамблеи кластера Фильм поперечного сечения просвечивающей электронной микроскопии

TEM сечения готовят повторное вложение в фас встроенных фильмов. ^{2, 12} Это делается путем присоединения первого фильма MPC собран на 3-MPTMS изменение стекло на чистую, стандартные предметные стекла использованием Добавить 812 эпоксидной смолой для обеспечения улучшенная обработка во время процедуры ниже. Будьте осторожны с применяется тепло, как более высокие температуры будут разлагаться ПДК в фильме.

1. Смешать 812 Вставить эпоксидной смолы и позволяют утолщаются, по крайней мере 12 часов.
2. Заполните "00" Беем капсула с эпоксидной смолой и инвертировать в верхней части образца MPC пленки (подготовлен в раздел 3). Место давление на капсулу, так что пузырь поднимается в верхнюю часть капсулы, создавая уплотнение между эпоксидной смолой и MPC пленочного образца. Разрешить для полимеризации, по крайней мере 18 часов при температуре 60 ° С, а затем прохладной слайдов до комнатной температуры.
3. Тепло слайдов на 20 сек на литых алюминиевых плитке при 200 ° С с целью облегчения удаления блока с прикрепленным MPC фильм лице еп.
4. Cut образца, содержащего фильм от блока Беем капсулы использованием видел ювелира.
5. Повторное вставлять удалены часть в кремнии плоские формы со стороной MPC фильм столкнемся интерьер кремния хорошо. Заполните кремния хорошо с эпоксидной смолой при комнатной температуре и позволяют полимеризации, по крайней мере 18 часов при температуре 60 ° C. Прохладный образца до комнатной температуры.
6. Получить тонких срезов образца 60-80 нм на Leica UCT ультрамикротоме с помощью алмаза нож, чтобы вырезать разделы перпендикулярно к кромке ножа.
7. Место нарезанный разделы по формвар / углерода поддержки пленки на медной сетке (400 меш) и принять ПЭМ-изображения подготовленных сечений сборки MPC фильм.

5. Представитель Результаты:

На рисунке 1 двойной слой зарядный ток мониторинг роста пленки ПДК для общей сложности 5 погружений циклов (переменного воздействия ПДК и неразрушающего решений). Ток зарядки систематически увеличивать с каждым погружением цикла, добавив: "слои" ПДК для пленки (рис. 2). Циклических вольтамперограммы были собраны, используя потенциал окна от 0,1 до 0,4 В (против Ag / AgCl, KCl) сканируется на 100 мВ / с в 4,4 мМ буфера фосфата калия (рН = 7.0, μ = 10 мм). Переизданный с разрешением от ML Варго, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB знаков, NT Лоуренс, Л. Trawick, а МС Леопольд, Ленгмюра 26 (1), 560-569. Copyright 2010 Американского химического общества.

Рисунок 2 (а) Схематическое изображение белка А-Я адсорбированных на дитиола связанных монтажная пленка ПДК. (Б) Типичные voltammogram циклический А-Я адсорбированных на MPC фильм сборке собраны, используя потенциал окно от -0,25 до +0,25 V (против Ag / AgCl, KCl) сканируется на 100 мВ / с в 4,4 мМ фосфата калия буфером (рН = 7,0, μ = 10 мм).

Рисунок 3 представителя UV-VIS спектральный мониторинг дитиола связанных MPC роста пленки на 3-MPTMS изменение стекло. Падение цикл состоит из экспозиции стекло для неразрушающего контроля компоновщик решение следует воздействием решение ПДК. Каждый последующий провал в результатах роста толщины пленки и одновременное увеличение абсорбции. По мере увеличения числа циклов падения увеличивается, группа поверхностных плазмонов постепенно определены при ~ 520 нм. Переизданный с разрешением от ML Варго, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB знаков, NT Лоуренс, Л. Trawick, а МС Леопольд, Ленгмюра 26 (1), 560-569. Copyright 2010 Американского химического общества.

Рисунок 4 просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) поперечного сечения анализ образа дитиола связанных монтажная пленка ПДК. Врезка: Типичные изображения ПЭМ из hexanethiolate функционализированных ПДК используются в фильме сборки. ПЭМ анализа определяется средний диаметр основной золото ПДК составляет ~ 2 нм с использованием анализа изображения J. Переизданный с разрешением от ML Варго, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB знаков, NT Лоуренс, Л. Trawick, а МС Леопольд, Ленгмюра 26 (1), 560-569. Copyright 2010 Американского химического общества.

Электрохимии белка монослоя является эффективным методом для изучения взаимодействий между редокс-белков и синтетических адсорбционных платформ. Эффективность этой стратегии, однако, зависит от способности инженера интерфейс адсорбции с высокой степенью молекулярного уровня управления. MPC-платформ, созданные этим протоколом представляют собой специально разработан платформ, которые способны обеспечить более однородной среде адсорбции белка ³ и облегчить ET на большем расстоянии ^{2 по} сравнению с традиционными системами PME использованием alkanethiolate SAM. Прочность всей конструкции MPC фильм в качестве интерфейса электрохимических является его универсальность и приспособляемость к других окислительно-восстановительных белков разного размера и поверхностной химии / функции, различные наноматериалы и альтернативную конфигурацию электродов, а также. Например, описанная процедура легко адаптированы к ET исследования цитохром с (цит с) с использованием простой место-обменные реакции на внешний слой ПДК включены в сборку. ¹¹ Как цит с-катионных и способен связываться с субстратами электростатически, карбоновые кислоты с завершающим alkanethiols тиолов может быть место, обменять на периферические лигандов ПДК включающий модифицированный электрод для облегчения электростатического приводом иммобилизации белка, с последующим анализом электрохимической быть идентична описанной здесь. ¹ Для регулировки Размер ПДК для размещения различных размеров белков, корректировка Браст синтеза, например, изменение тиоловых к золотым отношения, температуры реакции / доставка ставка, доходность широком диапазоне диаметров MPC, которые будут соответствовать приблизительный диаметр целевых белков . ^9-10

Общем порядке, в первую очередь повторяющихся циклов воздействия частиц и связи молекул (слой за слоем) успешно используется для создания тонких пленок включения различных наноматериалов. Например, водный наночастиц (НЧ) с различными защитными покрытиями и уникальные оптические свойства были объединены в фильмы, которые связаны исключительно с электростатическими взаимодействиями между НП и полиэлектролитных мостов. ¹³ же стратегия применяется также к построению высоко оптически чувствительную пленку Благодаря нано сборки корпуса или полых наночастиц.

Хотя процедура, описанная здесь используются специально созданных гальванических элементов и золота субстратов, он легко адаптируется к более общим электродов электрохимических конфигурациях и электроаналитических техники. В дополнение ко всем фильмах описаны возможности быть построен на испарились золотые электроды и стеклянные слайды, фильмы были также легко монтируется на общих золотой диск электроды, которые легко доступны из инструментов СН или Биоаналитическая систем (БАС). Хотя циклической вольтамперометрии продолжает быть основной метод электрохимического в PME, недавно мы успешно проанализированы белка монослоя ET с множеством других электрохимических методов, в том числе шагом, пульс, и импеданс методы на основе ^14.

Исследование и разработка наноматериалов-интерфейсы для адсорбции белка продолжаются, но фильм MPC сборки, описанные в данном отчете, представляют собой эффективные и улучшенные стратегии PME исследований. Процедура достаточно проста и может быть в исполнении студентов и ученых всех уровней, создавая универсальный фильмов, которые могут быть легко приспособлены к конкретным белковые мишени, если необходимо.