Syntes, församling, och karakterisering av monolager skyddade guld nanopartiklar Films för protein monolager Elektrokemi

1. Hexanethiolate cellslager Skyddad guld kluster Syntes

Hexanethiolate functionalized cellslager skyddade guld kluster (Medelhavsländerna) syntetiseras efter en 2:01 1-hexanethiol (C6) till guld mullvad förhållandet att producera i genomsnitt struktur Au ₂₂₅ (C6) _75. ^4-9 särskilda ändringar i Brust reaktion, som ligand typ, särskilt thiol-to-guld nyckeltal, temperatur och reaktion leverans takt, eller efter syntes behandlingar, kan ^9-11 ger ett brett urval av partnerländerna i Medelhavsområdet med varierande kärna storlekar och funktionella skyddande grupperna. ⁴ MPC ungefärliga ( genomsnitt) kompositioner av Medelhavsländerna functionalized med olika alkanethiol grupper kan bestämmas genom proton ⁽¹ H) kärnmagnetisk resonans (NMR) analys av jod förmultnade-prover.

1. Lös 1,1 g tetraoctylammonium bromid (TOABr) i 30 ml toluen med lämpliga dragskåp ventilation.
2. Lös 0,38 g natrium borohydride (NaBH ₄₎ i ~ 20 ml 18 Mohm ultrapurified vatten (UP H ₂ O) och låt kyla över is i minst 30 min.
3. Lös upp 0,31 g väte tetrachloroaurate (HAuCl ₄₎ i ~ 20 ml UP H ₂ O och kvantitativt överföra den lösningen blandningen till TOABr-toluen-lösning med en extra ~ 5 ml UP H ₂ O för att fas-Överför vattenskiktet guld lösning på icke vattenhaltigt lösningen. Rör om noga, medan lätt utjämnade i 30 min så bränd orange vattenlösning och tydliga icke vattenhaltigt faser blandningskopp.
4. Överför både klar vattenlösning och bränd orange icke vattenhaltigt faser till en separationstratt. Häll bort vattenskiktet (botten) lager och dekantera icke vattenhaltigt (överst) lagret i en ren kolv.
5. Lägg till C6 i förhållandet 2:1 med HAuCl ₄ till icke vattenhaltigt lösningen. Rör om i 30 min för att bilda en Au (I) polymer, som upptäckts av en färgförändring från rött orange till en blekgul, nästan färglös lösning.
6. Överför reaktionsblandningen till en isolerad isbad och kyl till 0 ° C under minst 30 minuter under omrörning.
7. Kvantitativt och snabbt lägga det kylda NaBH ₄ lösning på reaktionsblandningen för att minska Au (I) till ett metalliskt guld i närvaro av tioler, omedelbart bilda en tjock svart lösning av Medelhavsländerna på tillägg. Rör reaktion över natten vid 0 ° C.
8. Överför reaktionsblandningen till en separationstratt, kasta vatten (botten) lager till ett slöseri bägare, och roterande avdunsta icke vattenhaltigt (överst) toluen lagret till nästan fullständig torrhet lämnar en tung svart slam i kolven.
9. Fällning Medelhavsländerna genom att lägga acetonitril och låta sitta över natten.
10. Samla Medelhavsländerna med vakuum filtreringen med hjälp av en fritta av medium porositet med gummi beslag och biverkningar beväpnade kolv med aspirator och skölj med mycket acetonitril.
11. Låt Medelhavsländerna lufttorka, väger produkt, karakterisera med transmissionselektronmikroskop (TEM) och NMR-analys, och lagra tak för framtida bruk. Skaffa TEM bilder genom drop-gjutning Medelhavsländerna löst i toluen på formvar / carbon support film på koppar rutnät (400 mesh) och rörelseresultatet TEM-instrumentet på 80-100 kV. Den genomsnittliga kärna storlek kan uppskattas med hjälp av programvara bildanalys som Bild J (freeware).

2. Film Montering: ditiol kopplade MPC Film församlingen för Protein monolager Elektrokemi

Guldet substrat är först elektrokemiskt rengöras och modifierats med en C6 SAM innan nedsänkning i omväxlande lösningar av ditiol koppla molekyler och C6 modifierad partnerländerna i Medelhavsområdet för att göra upp en "dip cykel", som upprepas flera gånger för att slutligen bilda en ditiol-linked MPC film montering . Som beskrivits i tidigare studier, den ursprungliga plasmiden för Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) protein ² var nådigt från Dr Corey Wilson av Rice University och AZ lämnades som renas och frystorkat pulver av University of Richmond Professor, Dr Jonathan Dattelbaum, som senare rehydreras med 4,4 mM kalium fosfatbuffert (KPB, pH = 7,0, μ = 10 mm) för att skapa en 5-10 mikroM lösning som kontrolleras av ultraviolett synliga (UV-VIS) analys.

1. Montera elektrokemiska (echem) smörgås cell i följande ordning från botten till toppen: först Lucite Nedhållarplatta, guld substrat som arbetar elektrod, mässing elektrisk kontakt till guld arbeta elektrod, först gummipackning, Viton o-ring som definierar elektroderna (0,32 cm ^2), glas cellkroppen, andra gummipackning, och andra Lucite Nedhållarplatta. Hela cellen hålls samman av gängstänger och noggrant åtdragna vingmuttrar. Cellen är utrustad med en kommersiellt inköpt referenselektrod som rymmer ett glas fat med en mättad M KCl, Ag / AgCl-referens tråd, och en Pt extra elektrod tråd.
2. Elektrokemiskt ren the guld substrat genom att utföra cyklisk voltammetry (CV) i potentiella fönstren från 0,2 till 0,9 V, 0,2 till 1,2 V och 0,2 till 1,35 V (kontra Ag / AgCl, KCl) vid 100 mV / S i en lösning av 0,1 MH ₂ SO ₄ och 0,01 M KCl.
3. Mät laddningsström på den rengjorda nakna guld substrat genom att utföra CV på "standardvillkor", inklusive en potentiell fönster från 0,1 till 0,4 V (kontra Ag / AgCl, KCl) skannas på 100 mV / si KPB. ¹ Kasta KPB och skölj successivt med UPP H ₂ O, etanol (EtOH), en ökning H ₂ O, och EtOH.
4. Exponera rengöras guld substratet till ~ 300 l 5 mm C6 lösning i EtOH och låt sitta över natten för att bilda en ordnad C6 SAM. Kasta C6 lösning från cellen och skölj successivt med EtOH, UPP H ₂ O, EtOH och upp H ₂ O.
5. Mät laddningsström av SAM vid normalt. Kasta KPB och skölj successivt med UPP H ₂ O, EtOH, UP H ₂ O, och EtOH. Laddningsströmmen måste bli avsevärt minskat från den kala guld mätningen (steg 2,3). ¹
6. Exponera SAM ändrade guld substrat till ~ 300 l 5 mm 1,9-nonanedithiol (OFP) lösning i EtOH och låt det sitta i 1 timme till interdisperse OFP koppla molekyler inom C6 SAM. Kasta OFP lösningen och skölj successivt och grundligt med EtOH, UPP H ₂ O, EtOH, UP H ₂ O, och metylenklorid (CH ₂ Cl _2).
7. Exponera guldet substratet till en MPC lösning av CH ₂ Cl ₂ (~ 1 mg / ml) med upprördhet genom att långsamt bubblande med N ₂ gas för 1 tim. Om nödvändigt, byt ut avdunstade MPC lösning med mer CH ₂ Cl _2. Detta är den förankring MPC lagret av filmen montering. Kasta MPC lösning och åter skölj successivt med CH ₂ Cl _2, upp H ₂ O, och KPB.
8. Mät laddningsström av MPC skiktet under standardförhållanden. Kasta KPB och skölj successivt med UPP H ₂ O och CH ₂ Cl _2.
9. Exponera guldet substratet till ~ 300 l 5 mm NDT lösning av CH ₂ Cl ₂ med upprördhet genom att långsamt bubblande med N _2-gas i 20 min.
10. Kasta OFP och skölj noggrant med CH ₂ Cl _2. Upprepa steg 2,7 och 2,8 för att sätta in den andra MPC skiktet av filmen montering.
11. Att sätta in ytterligare MPC lager, steg 2,9 och 2,10 upprepas. Med varje ytterligare MPC lager en motsvarande ökning av laddningsströmmen observeras.
12. Efter nätverk MPC filmen är klar, skölj filmen ändrade underlaget med KPB. AZ protein adsorberas på MPC filmen monteringen genom att injicera ~ 150 mikroliter av ~ 5-10 mikroM A-Ö lösning av KPB i echem smörgås cellen och gör det möjligt att sitta tak och kylskåp i minst 1 timme.
13. Ta bort echem cellen ur kylskåpet och låt den återgå till rumstemperatur. Skölj noga med KPB, fylla echem cell med KPB och bubbla KPB med N _2-gas i 10 min.
14. Protein cellslager elektrokemiska studier utförs som en CV på potentiella fönster från -0,25 V till 0,25 V (kontra Ag / AgCl, KCl) skannas på 100 mV / sek i KPB.

3. Film Montering: ditiol kopplade MPC Film Sammansatta komponenter för optiska Tracking

Innan växande MPC filmer för optisk bedömning, glasskiva sektioner förrengöras med Piranha lösning (OBS! 02:01 koncentrerad H ₂ SO ₄ och H ₂ O ₂₎ och behandlas med (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane (3-MPTMS ). ^1-2 MPC filmer sedan monteras på dessa ändrade glasskivor med "dip cykeln" teknik som tidigare beskrivits ovan.

1. Skölj en 3-MPTMS modifierad glasskiva med CH ₂ Cl ₂ och placera den i en MPC lösning av CH ₂ Cl ₂ (~ 1 mg / ml) för en timme medan agiterande på en shaker i låg hastighet. Detta avslutar den första MPC lagret av filmen monteringen genom att förankra Medelhavsländerna till merkaptaner endgroups av silan. Skölj bilden grundligt med CH ₂ Cl _2, och torka med N ₂ gas. Ta en UV-Vis spektrum (400 till 1000 nm) av bilden, och skölj igen med CH ₂ Cl _2.
2. Placera bilden i en 5 mm OFP lösning av CH ₂ Cl ₂ för 1 timme medan agiterande på en shaker i låg hastighet. Skölj glaset med CH ₂ Cl _2.
3. Placera bilden i en MPC lösning för en timme medan agiterande på en shaker i låg hastighet. Detta avslutar den andra MPC skiktet av filmen montering. Skölj bilden grundligt med CH ₂ Cl _2, torr med N _2-gas, och tar en UV-Vis spektrum (400 till 1000 nm) i bilden. Den absorbans över hela spektrumet bör öka som ytterligare MPC lager adsorberas till filmen montering.
4. Att sätta in ytterligare MPC lager, steps 3,2-3,3 upprepas.

4. Karakterisering av cellslager skyddade guld församlingar Cluster Film av tvärsnittsarea transmissionselektronmikroskopi

TEM tvärsnitt förbereds genom att åter bädda en face inbäddade filmer. ^{2, 12} Detta görs genom att först ansluta en MPC film monterad på en modifierad 3-MPTMS glasskiva på en ren, standard objektglas med Bädda 812 epoxiharts för att möjliggöra förbättrad hantering under förfarandet nedan. Var försiktig med den tillämpade värme som högre temperaturer sönderfaller Medelhavsländerna inom filmen.

1. Blanda Bädda 812 epoxiharts och låt tjockna under minst 12 tim.
2. Fyll en "00" BEEM kapsel med epoxiharts och invertera på toppen av MPC filmen urvalet (upprättad i avsnitt 3). Sätt press på kapseln så att en bubbla stiger till toppen av kapseln, vilket skapar en tätning mellan epoxiharts och MPC film prov. Låt polymerisera under minst 18 tim vid 60 ° C och sedan kyler monterade diabilder till rumstemperatur.
3. Värme monterade diabilder i 20 sek på en gjuten aluminium värmeplatta vid 200 ° C för att underlätta avlägsnandet av blocket med bifogade MPC En Face film.
4. Klipp provet innehåller filmen bort av BEEM kapseln blocket med hjälp av en juvelerare såg.
5. Re-bädda in den borttagna delen i en kisel platta form med MPC filmen uppåt mot det inre av kisel väl. Fyll kisel väl med epoxi vid rumstemperatur och låt polymerisera under minst 18 tim vid 60 ° C. Kyl provet till rumstemperatur.
6. Skaffa tunna prov sektioner på 60-80 nm på en Leica UCT ultramicrotome med hjälp av en diamant kniv att skära avsnitt vinkelrätt mot knivens egg.
7. Placera skivade avsnitten om formvar / carbon support film på koppar nätet (400 mesh) och ta TEM bilder av beredd tvärsnitt av MPC film församlingar.

5. Representativa resultat:

Figur 1 Dubbla lager laddningsström övervakning av MPC film tillväxt för totalt 5 doppa cykler (alternerande exponering för MPC och OFP lösningar). Laddström ökat systematiskt med varje doppning cykel, och tillade "lager" av MPC till filmen (Fig. 2). Den cykliska voltammograms samlades in med hjälp av en potentiell fönster från 0,1 till 0,4 V (kontra Ag / AgCl, KCl) skannas på 100 mV / si 4,4 mM kalium fosfatbuffert (pH = 7,0, μ = 10 mm). Omtryckt med tillstånd från ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lawrence, ML Trawick, och MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

Figur 2 (a) Schematisk bild av AZ protein adsorberas till en ditiol-linked MPC film montering. (B) Typiska cykliska voltammogram för AZ adsorberas till MPC filmen montering in med hjälp av en potentiell fönster från -0,25 till 0,25 V (kontra Ag / AgCl, KCl) skannas på 100 mV / si 4,4 mM kalium fosfatbuffert (pH = 7,0, μ = 10 mm).

Figur 3 representant UV-Vis spektrala övervakning av en ditiol-linked MPC film tillväxt på en modifierad 3-MPTMS glasskiva. Ett dopp cykel består av en exponering av glaset bild till OFP länkaren lösning följde en exponering mot MPC lösning. Varje efterföljande dopp resulterar i tillväxt i skikttjocklek och en samtidig absorbans ökning. Eftersom antalet dopp cykler ökar, är ytan plasmon bandet gradvis definieras på ~ 520 nm. Omtryckt med tillstånd från ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lawrence, ML Trawick, och MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

Figur 4 transmissionselektronmikroskop (TEM) tvärsnittsarea bildanalys av ett ditiol-linked MPC film montering. Infälld: Typiska TEM bild av hexanethiolate functionalized Medelhavsländerna används i filmen församlingen. TEM analys bestäms en genomsnittlig diameter guld kärnan i Medelhavsländerna att vara ~ 2 nm med analys Image J. Omtryckt med tillstånd från ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lawrence, ML Trawick, och MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

Protein cellslager elektrokemi är en effektiv teknik som används för att studera interaktioner mellan redox proteiner och syntetiska adsorptiva plattformar. Effekten av denna strategi är dock beroende av förmågan att konstruera en adsorption gränssnitt med en hög grad av molekylär nivå kontroll. MPC-baserade plattformar som skapats av detta protokoll utgör utvecklats särskilt plattformar som kan ge en mer homogen proteinadsorption miljö ³ och underlätta ET över en längre sträcka ² jämfört med traditionella PME system anställa alkanethiolate Sams. En styrka i MPC filmen församling som en elektrokemisk gränssnitt är dess mångsidighet och anpassningsförmåga till andra redoxproteiner av olika storlek och ytkemi / funktion, olika nanomaterial, och alternativa konfigurationer elektroden också. Till exempel är den beskrivna metoden lätt anpassas till ET studier av cytokrom c (Cyt c) genom att använda enkla ställe för utbyte av reaktioner på det yttersta lagret av Medelhavsländerna infogas i aggregatet. ¹¹ Som Cyt C är katjoniska och kan binda till substrat elektrostatiskt kan karboxylsyra-terminerad alkanethiols tioler finnas plats växlas in i perifera ligander i Medelhavsländerna består av den modifierade elektroden gränssnitt för att underlätta en elektrostatisk driven fixering av proteinet, med efterföljande elektrokemiska analysen är identisk med den som beskrivs här. ¹ att justera Storleken på Medelhavsländerna för att tillgodose olika storlekar av proteiner, justeringar av Brust syntes, till exempel ändra thiol-to-guld nyckeltal, reaktion temperatur / leverans taxa, avkastning ett brett utbud av MPC diametrar som matchar den ungefärliga diametern på en riktad protein . ^9-10

Det allmänna förfarande, främst repetitiva cykler av exponering för partiklar och länka molekyler (lager-för-lager) har framgångsrikt använts för att skapa tunna filmer som innehåller en rad olika nanomaterial. Till exempel har vattenlösning nanopartiklar (NPS) med olika skyddande beläggningar och unika optiska egenskaper varit nätverksanslutna i filmer som är kopplade uteslutande med elektrostatiska interaktioner mellan NPS och polyelektrolyt broar. ¹³ Samma strategi har också använts till att bygga mycket optiskt känsliga film församlingar med nano skal eller ihåliga NPS.

Medan det förfarande som beskrivs här använder specialdesignade elektrokemiska celler och guld substrat, är det lätt att anpassa till mer generiska elektroder, elektrokemiska konfigurationer och electroanalytical tekniker. Förutom alla de filmer som beskrivs att kunna byggas på avdunstat guld elektroder och diabilder glas, har filmerna också enkelt monteras på vanliga elektroder guld disk som är lätt tillgängliga från CH Instrument eller Bioanalytiska Systems (BAS). Även cykliska voltammetry fortsätter att vara den primära elektrokemiska tekniken i PME, har vi nyligen framgångsrikt analyserat protein cellslager ET med en mängd andra elektrokemiska tekniker, inklusive steg, puls och impedans tekniker. ¹⁴

Forskning och utveckling av nanomaterial-baserade gränssnitt för proteinadsorption pågår men MPC filmen församlingar beskrivs i denna rapport utgör en effektiv och förbättrad strategi för PME studier. Förfarandet är relativt enkelt och kan utföras av studenter och forskare på alla nivåer, vilket skapar mycket mångsidig filmer som lätt kan anpassas till specifika proteiner mål om det behövs.