Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Bjerling, P., Olsson, I., Meng, X. n. Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast. J. Vis. Exp. (59), e3454, doi:10.3791/3454 (2012).

Несколько методов микроскопии, доступных сегодня, которые могут обнаружить специфического белка в клетке. В течение последнего десятилетия жить изображений клеток с использованием флуорохромами как зеленый флуоресцентный белок (GFP), непосредственно связанный с белком интересов становится все более популярным ^1. Использование GFP и аналогичные флуорохромами субклеточных локализаций и движений белки могут быть обнаружены в флуоресцентный микроскоп. Более того, также субъядерных локализации определенной области хромосомы могут быть изучены с помощью этой техники. GFP сливается с белком Lac-репрессора (LacR) и эктопически выражается в камеру, где тандемных повторов последовательности Laco был вставлен в область интереса на хромосоме ^2. LacR-GFP будет связываться с Laco повторяется, и что область генома будет виден как зеленая точка в флуоресцентный микроскоп. Дрожжи особенно подходит для такого рода манипуляций с гомологичнымирекомбинация является очень эффективным и тем самым позволяет целевых интеграции повторяет Laco и инженерно-технических белков слияния с GFP ^3. Здесь мы опишем количественный метод анализа жить ячейки деления дрожжей. Дополнительные протоколы для живых анализ ячейки делящихся дрожжей можно найти, например, как сделать фильм мейотических хромосомных ⁴ поведения. В данном эксперименте мы ориентируемся на субъядерных организации и как он влияет в геном индукции. Мы назвали кластера генов, названный Chr1, путем введения Laco сайты связывания в непосредственной близости от генов. Генных кластеров обогащенные для генов, которые вызваны на ранних стадиях азотного голодания деления дрожжевой ^5. В штамм ядерной мембраны (НМ) помечена крепления mCherry к Cut11 NM белка порождая красного флуоресцентного сигнала. Тела шпинделя полюса (СПБ) соединения Sid4 сливается с красный флуоресцентный белок (Sid4-mRFP) ⁶ 7. SPB определяется как большая круглая структура в NM. По изображения до и через 20 минут после истощения источника азота можно определить расстояние между кластера генов (GFP) и Н. М. / СПБ. Среднее или среднее расстояние до и после истощения азота сравниваются, и мы можем таким образом количественно или не происходит сдвиг в субклеточных локализации генов кластера после азота истощения.

1. Деление культуры дрожжей

1. Подготовка Эдинбурге Минимальная Media (EMM) и EMM без ammoniumchloride (EMM-N) ^8. Для уменьшения флуоресценции раствора глюкозы не должны обрабатываться в автоклаве, но вместо этого фильтра стерилизовать использованием 0,2 мкм, а затем добавляется в автоклаве СМИ.
2. Привить деления клетки дрожжей свежих, выращенных на агар пластины с мультимедиа, YEA ^8, в 3 мл EMM жидких сред с фильтром стерилизовать глюкозы. Используйте 13mL труб с слегка толкнул на крышку, чтобы обеспечить хорошую вентиляцию клеток. Пусть клетки растут, встряхивая их с 225 оборотов в минуту в 30 ° C. Держите клеток, растущих в журнале фазы (1 Х 10 ⁶ - 2 х 10 ⁷ клеток / мл) в течение 2 дней, считая их с помощью камеры Burker следуют соответствующего разбавления, каждое утро и вечер.
3. В день эксперимента убедитесь, что клетки в ранней стадии журнал, 5 х 10 ⁶ - 1 х 10 ^{7 клеток} / мл.
4. Чтобы голодать тОн клеток для азота в течение 20 минут переключиться с EMM СМИ EMM-N СМИ. Это делается путем сбора урожая 3 мл клеток в 1,5 мл трубки Эппендорф в настольной центрифуге при максимальной 1,5 RCF как центрифугирование с более высокой скоростью может вызвать стрессовую реакцию деления дрожжевой ^9. Использование двойных технике вращения, то есть, сначала спина в течение 2 мин, затем повернуть трубку Eppendorf 180 ° и спина опять за 1,5 RCF 2 мин ^10. Это поможет собрать все клетки в одну крупинку в нижней части трубы. Промыть раз с EMM-N, а затем растворяются в гранулах EMM-N и инкубировать клетки в течение 15 минут при 30 ° С при 225 пожимая оборотов в минуту, а затем продолжить в точку 2. Подготовка образцов.

2. Пробоподготовка

1. Урожай 1,5 мл клеток в 1,5 мл Eppendorf трубки в настольный центрифуге при максимальной 1,5 RCF как центрифугирование с более высокой скоростью может вызвать стрессовую реакцию деления дрожжевой ^9. Использование двойных технике вращения meaniнг; первый спин в течение 2 мин, затем повернуть трубку Eppendorf 180 ° и спина опять за 1,5 RCF в течение 2 минут ^10. Это поможет собрать все клетки в одну крупинку в нижней части трубы.
2. Удалить супернатант, но оставить 10-15 мкл и ресуспендирования клеток в оставшихся средствах массовой информации. Кроме добавить 10 мкл свежей информации к ресуспендируют осадок клеток.
3. Убедитесь в том, чтобы ясно стеклянные и покровного стекла (не 1,5). Обычно вы не должны чистить их, но убедитесь, что они не полны пыли.
4. Выньте из морозильника аликвоту исходного раствора 1mg/mL лектин, который был фильтром стерилизовать. Лектин решение может быть замораживать несколько раз. Лектина используется для фиксации дрожжевых клеток на покровного стекла.
5. Место 5 мкл EMM с фильтром стерилизовать глюкозы на цели стекла.
6. Место 5 мкл лектина решение в углу покровного стекла. Впоследствии место 5 мкл клеточной культуре в том же углу, т.е. в лектин падение. Смешайте с помощью пипетки несколько раз, а затем распространилась культура клеток-лектин смесь всей покровного стекла с помощью длинной стороне кончика пипетки. В зависимости от плотности вашего мобильного смесь оставить все или поглощать избыток жидкости в противоположном углу покровного стекла.
7. Место покровного стекла, пополнить, с одной стороны, с целью стекла и другую сторону на скамейке запасных. Пусть покровного стекла подсушить в течение нескольких минут. Следует абсолютно не быть полностью сухой, но это не должно быть слишком много жидкости на стекло.
8. Место покровного стекла с приближенными 70 ° Ангел с целью стекла капли EMM. Отпусти покровного стекла так, что она упадет сверху вниз в каплю EMM.
9. Чтобы скрепить края с силиконовой смазки подготовить 2 мл шприц. Вырезать широком конце 200 мкл наконечник и прикрепите его к шприц. Заполните шприц с примерно 1 мл силиконовой смазки. Тонкая грань кремния наносится на края покровного стекла, аккуратно гнойасафетиды поршня шприца. Теперь у вас есть небольшая камера роста S. ротЬе клеток.

3. Микроскопия

1. Инициализации флуоресцентной микроскопии, включив ртути / ксеноновой лампы, микроскоп и компьютер. Место камере рост дрожжей в флуоресцентный микроскоп. Используйте 63 X объективным или 100 X объектива с NA = 1,3 или выше. Если нефть цели используется, добавьте масло.
2. Используйте яркие, чтобы найти клетки и получить четкое изображение.
3. Настройки для флуоресцентной микроскопии зависит от флуорохромов используется для обозначения дрожжевых клеток и микроскоп. Мы используем конфокальной микроскопии Zeiss LSM 700 лазерного сканирующего микроскопа с планом-Apochromat 63x объектив нефти (NA = 1,4) с 16-линия среднем настройки сканирования плоскости. Отверстие должно быть установлено в 1-1,1 Эйри единиц, что дает оптический срез 0,8 мм. Мы обнаружить GFP в Трек 1, используя набор фильтров для Alexa 488 с светоделитель на 582 нм, что гetecting длин волн между 488 и 582 нм. В Track 2 мы используем набор фильтров для оптимального использования mCherry светоделитель при 578 нм, что обнаружение длин волн между 578 и 600 нм. Это означает, что в обоих Трек 2 mRFP (СПБ) и Н. М. (mCherry) будут обнаружены.
4. Возьмите столько снимков, необходимо уметь измерять в 60 различных клеток для каждого штамма. Обычно 15 фотографий из независимых полей микроскопии достаточно. Рекомендуется, чтобы новые камеры роста со свежими клетками производится, если ваш микроскопии время превышает 60 минут.

4. Количественные измерения расстояний субклеточных

1. Откройте фото в программе Zeiss Zen издание Света. Использование мерой измерения расстояния инструмент в мкм между различными флуорохромами во всех клетках, где все сигналы находятся в одной фокальной плоскости. Отрегулируйте интенсивность света и контраста для определения центра флуоресцентного сигнала. Этот упрощенный протокол использует только две сolours и, следовательно, СПБ и Н. М. находятся в том же канале. SPB выделяется своими большими круглыми структуры в NM. Передача расстояния до блокнота листе. Мера, по крайней мере на 60 клеток. Другие программы, такие как ImageJ также может быть использован для измерения расстояния, но Zeiss Zen Свет является предпочтительным из-за его более высокое разрешение изображения и простоту для увеличения и с помощью этой программы. Картинки в формате LSM открыт в ImageJ будет иметь два канала друг на друга. Для того, чтобы изображение с обоих каналов, во-первых разделить два канала, а затем объединить их. После этого строки могут быть использованы для измерения расстояний, как описано выше.
2. Сравните среднее или среднее субклеточных расстояния между различными штаммами и процедур с использованием статистической программы, например, т-тест или Манна-Уитни ранг Сумма испытаний, например, с помощью SigmaStat-3.5 программного обеспечения. Часто данные не нормально распределенных так как не будет выбора для клеток с более короткимРасстояния между флуоресцентные сигналы, так как все сигналы должны быть в той же фокальной плоскости должны быть измерены. Т-тест может быть использован только, когда данные нормального распределения в то время как Манна-Уитни ранг Сумма тест позволяет сравнении наборов данных, которые не имеют нормального распределения. В т-тест означает двух разных наборов данных, а в сравнении Манна-Уитни Сумма ранг средний сравнивается.

5. Представитель Результаты

Штамм PJ1185: (А ^{+ +} his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 ⁺ hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) был выращен в EMM . Образец был снят и смонтирован в небольшую камеру роста и фотографии были сделаны (рис. 1А + N). Впоследствии рост средств массовой информации была заменена EMM без ammoniumchloride (EMM-N), и клетки гrown в течение 15 минут при встряхивании. Азота от голода клетки затем монтируется в ростовой камере с EMM-N и фотографии были сделаны (рис. 1А-N). Измерительный инструмент был использован для измерения расстояния между локус (GFP) и SPB (рис. 1B и таблицу 1). Кроме того, расстояние между локус (GFP) и Н. М. был измерен (рис. 1B и таблицу 2). Средний субклеточных расстояния до и после истощения азота сравнивались с использованием SigmaStat-3.5 программного обеспечения (табл. 3). Существовал статистически значимое изменение в локализации генов кластера отходит от М. к СБП. Данные измерения расстояния между GFP и САД было нормальное распределение и, следовательно, средние расстояния (1,777 мкм + N и 1587 мкм-N), могут быть сравнены с использованием Т-теста (табл. 1 и 3). Существовал существенной разницы между двумя средними значениями (р = 0,008, т-тест). Данные измерения расстояния между GFP и Н. М. не было нормального диstribution и, следовательно, среднее расстояние (0 мкм + N и 0,390 мкм-N) сравнивали с помощью Манна-Уитни ранг Сумма теста (табл. 2 и 3). Существовал существенной разницы между двумя средними значениями (Р <0,001, Манна-Уитни ранг Сумма теста).

Рисунок 1. Локализации кластера генов, названный Chr1, отмеченный GFP, изменилась после азотного голодания. (А) Левая колонка, + N, представитель клеточное ядро ​​из клетки, выращенные в EMM правой колонке,-N, представитель клеточное ядро ​​из клетки, выращенные в EMM-N. Зеленый сигнал GFP маркировки кластеров Chr1, красный mRFP и mCherry маркировки СПб и Н. М., соответственно. (Б) То же ядре клетки в виде (), но теперь с измеренными субъядерных расстояния; желтый: диаметр ядра клетки, синий: расстояние между СПБ и GFP сигнала и розовый: расстояние между сигнал GFP и ядерной оболочки.

Таблица 1. Субъядерных измеряется расстояние в мкм PJ1185 штамма выращивают в EMM. Первый ряд, диаметр ячейки (г), второй ряд, расстояние между GFP и СПБ, третий ряд, расстояние между GFP и NM.

Таблица 2. Субъядерных измеряется расстояние в мкм PJ1185 штамма выращивают в EMM-N. Первый ряд, диаметр ячейки (г), второй ряд, расстояние между GFP и СПБ, третий ряд, расстояние между GFP и NM.

Таблица 3. Описательная статистика наблюдается субъядерных расстояния в штамме PJ1185 до (+ N) и после (-N) азотного голодания. Первый ряд: число клеточных измерить, второй ряд: средний диаметр (D), третья строка: средний диаметр (D), четвертый ряд: среднее расстояние между GFP и СПБ, пятой строки: медиана расстояния между GFP и NM.

В течение последнего десятилетия в использовании живого изображения ячейки для контроля клеточных событий становится все более популярным. Все началось с использованием зеленого флуоресцентного белка из медузы Aequorea Виктория и теперь много различных флуорохромов имеются излучающие флуоресценции с помощью широкого спектра от голубого (475 нм) до дальнего красного (648 нм) ^11. Одним из основных преимуществ живого изображения ячейки более иммунофлюоресценции является то, что клетки не являются фиксированными формальдегидом или этанол / ацетон лечение до микроскопии, следовательно, избежать возможных артефактов из фиксации процесса. Кроме того, живая клетка изображений предлагает возможность наблюдать отдельные клетки и сделать снимки через определенные промежутки времени в течение часов или дней инкубации, что дает возможность получить фильмы клеточных событий ^12. Клетки млекопитающих имеют преимущество наличия большего размера, диаметром около 100 мкм, по сравнению с меньшими дрожжевой клетки с диаметром около 3-4 &му; м. С другой стороны, преимуществом дрожжи легко манипулировать геномом. Гомологичной рекомбинации происходит очень эффективно в дрожжах и используется для предохранителя белки, представляющие интерес для различных флуорохромов ^3. Кроме того, используя целевые интеграции последовательностей Laco и последующее выражение LacR-GFP белка позволяет обнаружение определенной части генома в ядре клетки ^2. Использование С. ротЬе клеток в микроскопии имеет дополнительные преимущества, поскольку они являются естественными одноклеточных организмов, которые растут с быстрым временем поколения в недорогих условиях культуры клеток. Кроме того, С. ротЬе является отличным эукариотических организмов модель, поскольку она имеет многоклеточных гомологичных генов.

Одним из главных ограничений этого метода является аутофлюоресценция в дрожжевых клеток тревожные выявление истинного сигнала. Эту проблему можно преодолеть, используя минимальное количество питательной среды с фильтром стерилизовать глюкозы, а не в автоклаве. ВКроме того, дрожжевые клетки должны быть выращены в течение 2 дней в лог-фазе до их монтирования. Протокол, представленные здесь предложения относительно простой, но все же количественный метод, чтобы определить внутриклеточную локализацию белков внутри дрожжевой клетки. Более того, принимая фотографии в различные моменты времени мы можем следовать клеточных событий.

Нам нечего раскрывать.

Мы благодарим профессора Хираока за отправку штаммов. Мы признаем, поддержка со стороны Горан Gustafssons фонда и Шведское общество рака (2008/939).

1. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802 (1994).
2. Robinett, C.C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135 (6 Pt 2), 1685 (1996).
3. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943 (1998).
4. Asakawa, H. & Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53 (2009).
5. Alfredsson-Timmins, J., et al. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118 (1), 99 (2009).
6. Kristell, C., et al. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20 (3), 361 (2010).
7. West, R.R., et al. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9 (10), 2839 (1998).
8. Tomlin, G.C., Morrell, J.L., & Gould, K.L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13 (4), 1203 (2002).
9. Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., & Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121 (5), 961 (1993).
10. Moreno, S., Klar, A., & Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795 (1991).
11. Soto, T., et al. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153 (Pt 5), 1519 (2007).
12. Hagan, I.M. & Ayscough, K.R. In: Fluorescence microscopy in yeast, Allan, V.J., ed., Oxford University Press, Oxford, 179 (2000).
13. Tsien, R.Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (31), 5612 (2009).
14. Mackay, D.R., Ullman, K.S., & Rodesch, C.K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878, DOI: 10.3791/1878 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.