Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Bjerling, P., Olsson, I., Meng, X. n. Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast. J. Vis. Exp. (59), e3454, doi:10.3791/3454 (2012).

Birkaç mikroskopi teknikleri, hücre içinde belirli bir proteinin tespit edebilir bugün mevcuttur. Son on yılda ilgi protein doğrudan bağlı Yeşil Floresan Protein (GFP) gibi fluorochromes kullanarak canlı hücre görüntüleme ¹ giderek daha popüler hale gelmiştir. GFP ve benzer fluorochromes kullanma proteinlerin hücre içi lezyonlar ve hareketleri bir floresan mikroskop tespit edilebilir. Ayrıca, bu tekniği kullanarak bir kromozomun belli bir bölgesine subnuclear lokalizasyon okudu olabilir. GFP Lac repressör protein (LacR) erimiş ve ektopik Laço dizisi tandem tekrarlar kromozom ² faiz bölgeye eklenmiştir hücrede ifade edilir. LacR-GFP Laço tekrarlar ve genom o bölgede, floresan mikroskop yeşil bir nokta olarak görülebilir yapışacaktır . Maya özellikle homolog yılından bu yana bu tür manipülasyon için uygundurrekombinasyon çok etkili olduğu ve böylece Laço tekrarlar ve GFP ³ ile mühendislik füzyon proteinleri hedeflenen entegrasyon sağlar. Burada fizyon maya canlı hücre analizi için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Fisyon maya canlı hücre analizi için ek protokoller bulunabilir, mayotik kromozom davranışları ⁴ bir film yapmak nasıl örneğin. Bu deneyde biz subnuclear organizasyon ve gen indüksiyonu sırasında nasıl etkilenir. Biz genleri çevresinde Laço bağlayıcı sitelerinin giriş Chr1 adlı bir gen kümesinin, etiketli. Gen küme fisyon maya ⁵ azot açlık sırasında erken uyarılan gen zenginleştirilmiştir. Gerilim nükleer membran (NM), kırmızı floresan sinyal sebebiyet veren NM proteini Cut11 mCherry eki etiketli. Mil Pole gövde (SPB) bileşik Sid4 Kırmızı Floresan Protein (Sid4-MRFP) ⁶ eritilir. NM 7 gömülü olan SPB bağlıdırlar . SPB NM büyük bir yuvarlak yapı olarak tanımlanır. Azot kaynağı tükenmesi önce görüntüleme ve 20 dakika sonra gen kümesi (GFP) ve NM / SPB arasındaki mesafe belirleyebilirsiniz. Azot tükenmesi öncesi ve sonrası ortalama veya medyan mesafeler karşılaştırılır ve böylece azot tükenmesi sonra gen küme hücre içi lokalizasyonu bir kayma var olup olmadığını ölçmek.

1. Fisyon maya kültürü

1. Edinburgh Minimal Medya (EMM) ve ammoniumchloride olmadan EMM (EMM-N) ⁸ hazırlayın. Otofloresans azaltmak için glukoz solüsyonu otoklava ama 0,2 mikron filtre ve daha sonra otoklava medya eklendi kullanarak sterilize yerine filtre olmamalıdır.
2. İnokülasyon fisyon maya hücreleri filtre sterilize glukoz ile EMM sıvı ortam 3 ml taze, ⁸ YEA, zengin medya ile bir agar plaka üzerinde büyüdü. Bir hücrelerin iyi bir havalandırma sağlamak için kapağı hafifçe itti 13mL tüpleri kullanın. 30 225 rpm sallayarak hücrelerin büyümesine izin ° C Hücreleri (1 X 10 ⁶ - 2 X 10 ⁷ hücre / ml) log fazı büyüyen tutun Burker odasına kullanarak onları sayarak 2 gün boyunca uygun seyreltme, her sabah ve akşam izledi.
3. Deney günü erken log fazı, 5 hücre olduğundan emin olun X 10 ⁶ - 1 X 10 ⁷ hücre / ml.
4. T açlıktan içinEMM-N medya EMM medya ile 20 dakika arasında geçiş sırasında azot hücreleri. Bu, daha hızlı bir hızda santrifüj olarak maksimum 1.5 RCF masa üstü santrifüj 1.5 ml Eppendorf tüp 3 ml hücre hasat yapılır fisyon ^maya 9 stres yanıtı neden olabilir . Çift iplik tekniği, anlam kullanın; ilk spin 2 dakika sonra Eppendorf tüp 180 ° döndürün ve 1.5 RCF 2 dk ¹⁰ için tekrar döndürün. Bu tüpün alt kısmındaki bir pelet tüm hücreleri toplamak için yardımcı olur. EMM-N ile bir kez yıkayın ve sonra EMM-N pelet çözülür ve 30 hücreleri az 15 dakika süreyle inkübe ° C'de 225 rpm'de sallayarak ve ardından 2 nokta devam. Örnek hazırlama.

2. Örnek hazırlama

1. Harvest 1.5 mL, daha hızlı bir hızda santrifüj olarak maksimum 1.5 RCF masa üstü santrifüj bir 1.5 ml Eppendorf tüp hücrelerin fisyon ^maya 9 stres yanıtı neden olabilir . Çift iplik tekniği, meani kullanın.ng 2 dakika süreyle ilk dönüşü, ardından Eppendorf tüp 180 ° döndürün ve 2 dk ¹⁰ 1.5 RCF tekrar döndürebilirsiniz. Bu tüpün alt kısmındaki bir pelet tüm hücreleri toplamak için yardımcı olur.
2. Süpernatantı, ama bırakın 10-15 mcL ve geri kalan medya hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, hücre pelletini tekrar süspansiyon, taze medya 10 mcL ekleyin.
3. Açık cam slaytlar ve cam kapak Yok (1.5) emin olun. Normalde bunları temizlemek için, ama toz dolu olmadığından emin değilsiniz.
4. Dondurucu filtresi sterilize edilmiştir 1mg/ml lektin bir stok solüsyonu bir kısım dışarı atın. Lektin çözüm birkaç kez refrozen olabilir. Lektin kapak cam maya hücreleri gidermek için kullanılır.
5. Place 5 objektif cam filtre sterilize glukoz ile EMM mcL.
6. 5 kapak cam köşesindeki lektin çözüm mcL yerleştirin. Sonradan lektin açılan aynı köşede, yani hücre kültürü 5 mcL. Pipetleme ve daha sonra birkaç kez karıştırın, uzun kenarı pipet kullanarak kapağı camı boyunca kültür-lektin karışımı hücre yayıldı. Her şeyi bırakın veya aşırı sıvı cam kapak ters köşe emmek hücre karışımı yoğunluğuna bağlı.
7. Bankta objektif cam ve diğer tarafta tek bir tarafı ile kapak cam, kontör, yerleştirin. Cam kapak, birkaç dakika için biraz kurumasını bekleyin. Kesinlikle tamamen kuru olmalıdır, ama çok fazla sıvı cam olmamalıdır.
8. EMM açılan objektif cam yaklaşık 70 ° melek ile cam kapak yerleştirin. EMM açılan yukarıdan aşağıya düşecek böylece kapak cam gidelim.
9. Silikon gres ile kenarları mühür için 2 ml şırınga hazırlar. 200 ul ucu geniş ucu ve şırınga ekleyin. Silikon gres yaklaşık 1 ml şırınga doldurun. Silikon ince bir çizgi hafifçe iltihap kapak cam kenarlarına uygulanırhing şırınga piston. Şimdi küçük bir büyüme odasına S. pombe hücreleri.

3. Mikroskopi

1. Cıva / ksenon lamba, mikroskop ve bilgisayar çevirerek floresan mikroskopi başlatın. Floresan mikroskop maya büyüme odasına yerleştirin. 63 X objektif veya NA = 1.3 veya daha yüksek 100 X amacı kullanın. Bir yağ hedefi ise, yağ ekleyin.
2. Hücreleri bulmak ve keskin bir görüntü elde etmek için parlak alanını kullanın.
3. Floresan mikroskopi için ayarları maya hücreleri mikroskop etiketlemek için kullanılan fluorochromes bağlı olarak değişir. 16-line ortalama düzlem tarama ayarı ile Plan-Apochromat 63x yağ objektif lens (NA = 1.4) ile konfokal mikroskop Zeiss LSM 700 Lazer Tarama Mikroskobu kullanın. Iğne deliği 0.8 mm optik bir dilim verir 1-1,1 Airy birimleri, ayarlanmış olmalıdır. Biz, böylece d Alexa 488 ile 582 nm dalga boyunda ışın ayırıcı filtre kümesi kullanarak Track 1 GFP tespit488 ve 582 nm arasındaki dalga boylarında etecting. İzinde 'de 2, böylece 578 ve 600 nm arasındaki dalga boylarında tespit 578 nm dalga boyunda ışın ayırıcı kullanarak mCherry için optimal bir filtre ayarını kullanın. Bu Parça 2 MRFP (SPB) ve NM (mCherry) tespit olacağı anlamına gelir.
4. Çok sayıda fotoğraf ve her bir suş için 60 farklı hücrelerde ölçebilmek için gerekli ele alalım. Genellikle 15 resim bağımsız mikroskopi alanları yeterli. Mikroskopi süresi 60 dakikayı aşarsa taze hücreler ile yeni bir büyüme odasına olduğunu tavsiye edilir.

4. Subselüler mesafelerin nicel ölçümü

1. Zeiss Zen Light Edition programı resim açın. Tüm sinyaller aynı odak düzlemli tüm hücrelerde farklı fluorochromes arasında mikron mesafe ölçümleri araç önlem kullanma. Floresan sinyal merkezini belirlemek için ışık yoğunluğu ve kontrastı ayarlayın. Bu basitleştirilmiş bir protokol sadece iki farklı c kullanırmüşahedeler ve dolayısıyla SPB ve NM aynı kanalda. SPB NM büyük yuvarlak bir yapı tarafından saydı. Mesafelerde bir not defteri sayfasına aktarın. En az 60 hücre ölçün. Mesafeyi ölçmek için, ImageJ diğer programlar da kullanılabilir, ancak Zeiss Zen Işık, yüksek resim çözünürlüğü ve bu programı kullanarak ve yakınlaştırmak için kolaylığı nedeniyle tercih edilir. ImageJ açıldı lsm formatında resimler birbirlerinin üstüne iki kanal olacaktır. Her iki kanal ile bir resim yapmak için, ilk iki kanal bölünmüş ve daha sonra bunları birleştirmek. Bundan sonra satırı aracı, yukarıda açıklandığı gibi mesafeleri ölçmek için kullanılabilir.
2. SigmaStat-3.5 yazılımını kullanarak, örneğin, bir istatistik programı kullanarak örneğin t-testi veya Mann-Whitney rank sum testi farklı suşları ve tedaviler arasında, ortalama ya da medyan hücre içi mesafeler karşılaştırın . Hücreler için daha kısa bir seçim olacaktır bu yana sık sık veri normal dağılıma sahip değildirtüm sinyaller bu yana floresan sinyalleri arasındaki mesafeler, aynı odak düzlemli ölçülecek olması gerekir. Bir t-testi, Mann-Whitney rank sum testi, normal dağılım eksikliği veri setleri karşılaştırma imkanı sağlarken, veri normal dağılıma sahip olduğunda sadece kullanılabilir. T-testi, Mann-Whitney Rank Sum Test medyan karşılaştırıldığında ise iki farklı veri setlerinin ortalama karşılaştırılır .

5. Temsilcisi Sonuçlar

Gerilme PJ1185: (h ⁺ his7 ^+: dis1placR - GFP Chr1 [: ura4 ⁺ leu1 hphMX6 Laço] sid4-MRFP: kanMX6 cut11 mCherry: natMX6 ura4-D18-32 ade6-DN / N) EMM yetiştirildi . Bir örnek çekilmiş ve küçük bir büyüme odasında monte ve resimleri (Şekil 1A + N) alınmıştır. Daha sonra büyüme ortamı EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N) ile değiştirilir ve hücreleri g edildi.sallayarak ise 15 dakika boyunca rown. Azot hasret hücreler daha sonra EMM-N ve resimler ile bir büyüme odasında monte edilmiştir (Şekil 1A-N) alınmıştır. Lokus (GFP) ve SPB (Şekil 1B ve Tablo 1) arasındaki mesafeyi ölçmek için ölçme aracı kullanılmıştır. Buna ek olarak, odağı (GFP) ve NM arasındaki mesafe ölçüldü (Şekil 1B ve Tablo 2). Azot tükenmesi öncesi ve sonrası medyan Subselüler mesafeler SigmaStat 3.5 yazılımı (Tablo 3) kullanılarak karşılaştırıldı. SBP doğru NM uzak hareketli gen küme lokalizasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir kayma vardı. GFP ve SBP arasındaki mesafe ölçme veri olabilir dolayısıyla bir normal dağılım ve ortalama mesafeleri (1,777 mikron + N ve 1.587 mm-N), t-testi (Tablo 1 ve 3) kullanılarak karşılaştırıldı . Iki ortalama değerleri (p = 0.008, t-testi) arasında anlamlı bir fark yoktu. GFP ve NM arasındaki mesafe ölçüm verileri normal bir di yoktustribution ve bu nedenle medyan mesafeleri (0 mikron + N ve 0.390 mm-N), Mann-Whitney Rank Sum testi (Tablo 2 ve 3) kullanarak karşılaştırıldı. Iki medyan değerleri (p <0.001, Mann-Whitney Rank Sum testi) arasında anlamlı bir fark yoktu.

Şekil 1: GFP ile işaretlenmiş Chr1 adlı genlerin bir küme lokalizasyonu, azot açlıktan sonra değişti. (A) Sol sütun, + N, EMM sağ sütunda yetişen bir hücre,-N, EMM-N yetişen bir hücre bir temsilci hücre çekirdeğinde bir temsilci hücre çekirdeği. Yeşil Chr1 küme etiketleme GFP sinyali, kırmızı MRFP ve mCherry sırasıyla, SPB ve NM etiketleme. (B) Aynı hücre çekirdeği olarak (A) ama şimdi ölçülen subnuclear mesafeler; sarı: hücre çekirdeğinin çapı, mavi: SPB ve GFP sinyal ve pembe arasındaki mesafe: GFP sinyal ve nükleer membran arasındaki mesafe.

(Tablo 1). EMM yetiştirilen PJ1185 suşu mikron subnuclear mesafeleri ölçülür. İlk satır, hücre (d), ikinci satır, GFP ve SPB arasındaki mesafe, üçüncü sıra, GFP ve NM arasındaki mesafe çapı.

(Tablo 2). EMM-N yetiştirilen PJ1185 suşu mikron subnuclear mesafeleri ölçülür. İlk satır, hücre (d), ikinci satır, GFP ve SPB arasındaki mesafe, üçüncü sıra, GFP ve NM arasındaki mesafe çapı.

Tablo 3 gerginlik PJ1185 gözlenen subnuclear mesafelerin Tanımlayıcı istatistikler azot açlık önce (+ N) ve (N) 'den sonra. Birinci sıra: hücre sayısı, ikinci satır ölçülen ortalama çapı (d), üçüncü satır: medyan çapı (d), dördüncü satır: GFP ve NM arasında medyan mesafeleri: GFP ve SPB, beşinci satır arasındaki mesafe demek.

Hücresel olayları izlemek için canlı hücre görüntüleme kullanımı son on yılda giderek daha popüler hale gelmiştir. Bu denizanası Aequorea victoria Yeşil Floresan Protein kullanımı ile başladı ve şimdi birçok farklı fluorochromes kadar kırmızı (648 nm) ¹¹ cyan (475 nm) geniş bir spektrumları yoluyla yayan floresan mevcuttur. Immünofloresan üzerinden canlı hücre görüntüleme en önemli avantajlarından biri, hücreleri, dolayısıyla tespit süreci mümkün eserler kaçınarak mikroskopi önce formaldehit veya etanol / aseton tedavisi sabit değildir olduğunu. Buna ek olarak, tek tek hücrelerin izleyin ve hücresel ^olaylar 12 film elde etmek için mümkün kılan, inkübasyon saat veya gün boyunca sık aralıklarla fotoğraf çekmek için, canlı hücre görüntüleme imkanı sunar . Memeli hücreleri gibi yaklaşık 3-4 çapında küçük maya hücresi ile karşılaştırıldığında yaklaşık 100 mm çapları, daha büyük bir boyuta sahip olmanın avantajına sahipMu; m. Öte yandan, maya ile avantajı kolayca manipüle genom. Homolog rekombinasyon maya çok verimli bir şekilde ortaya çıkar ve farklı ^{fluorochromes} 3 ilgi proteinleri kaynaştırmak için kullanılır . Ayrıca, Laço LacR-GFP protein dizileri ve daha sonraki ifade hedeflenen entegrasyon kullanarak belirli bir kısmının, hücre ^çekirdeği 2 içinde genom algılanmasını sağlar . S. Kullanımı mikroskopi pombe hücreleri düşük maliyetli hücre kültürü koşullarında hızlı bir nesil zaman yetişen doğal tek hücreli organizmalar olduğundan ek avantajları vardır. Ayrıca, S. metazoan homolog genler beri pombe mükemmel ökaryotik bir model organizmadır.

Bu tekniğin en önemli sınırlamaları Bir gerçek sinyal algılama rahatsız maya hücre otofloresans. Bu sorun, filtre sterilize glikoz minimal büyüme ortamını kullanarak yerine otoklava üstesinden gelinebilir. IçindeAyrıca maya hücreleri, bunları montaj log fazı 2 gün önce yetiştirilen edilmelidir. Burada sunulan protokol maya hücre içindeki proteinlerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek için nispeten basit, ama henüz nicel bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, farklı zaman noktalarında fotoğraf çekmek hücresel olayları takip edebilirsiniz.

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Profesör Hiraoka Biz bize suşları göndermek için teşekkür ederim. Biz Goran Gustafssons Vakfı ve İsveç Kanser Derneği (2008/939) desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız.

1. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802 (1994).
2. Robinett, C.C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135 (6 Pt 2), 1685 (1996).
3. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943 (1998).
4. Asakawa, H. & Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53 (2009).
5. Alfredsson-Timmins, J., et al. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118 (1), 99 (2009).
6. Kristell, C., et al. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20 (3), 361 (2010).
7. West, R.R., et al. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9 (10), 2839 (1998).
8. Tomlin, G.C., Morrell, J.L., & Gould, K.L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13 (4), 1203 (2002).
9. Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., & Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121 (5), 961 (1993).
10. Moreno, S., Klar, A., & Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795 (1991).
11. Soto, T., et al. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153 (Pt 5), 1519 (2007).
12. Hagan, I.M. & Ayscough, K.R. In: Fluorescence microscopy in yeast, Allan, V.J., ed., Oxford University Press, Oxford, 179 (2000).
13. Tsien, R.Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (31), 5612 (2009).
14. Mackay, D.R., Ullman, K.S., & Rodesch, C.K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878, DOI: 10.3791/1878 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.