I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

1. Espressione di tossici PolyQ-espansione proteine ​​nel lievito

Una analisi sistematica ha stabilito la precisa sequenza aminoacidica di una proteina polyQ espansione che è necessaria per produrre tossicità in lievito ^7. Questo tossico polyQ-espansione proteina contiene un amino-terminale FLAG-tag seguita da 17 amminoacidi dalla sequenza originale della proteina huntingtina, una regione polyQ, e un terminale carbossilico di fusione ad una proteina fluorescente (GFP sia o CFP, vedi Figura 1 a). L'espressione di proteine ​​con espansioni PolyQ glutamines di 46 o più (ad esempio 72 e 103 glutamines) produce tossicità in lievito quando espresso sotto il controllo del inducibile e relativo forte promotore GAL1 ^{7, 9.}

Come descritto in precedenza, tossicità polyQ in lievito è solo apparente in cellule che portano il Rnq1p proteina prionica nella sua conformazione, [RNQ +], ad esempio il ceppo di lievito W303 ^9. Il tossico polyQ-espansione proteina recapitulates aspetti centrali della polyQ-biologia nel lievito, come polyQ lunghezza-dipendente di tossicità (vedi sotto) e aggregazione (Figura 1 b). In particolare, tossici polyQ di espansione delle proteine ​​non uccidono le cellule di lievito immediatamente, ma piuttosto mettere in pericolo o arrestare il ciclo cellulare e devision cellulare, in modo da rallentare o inibire la crescita di colonie di lievito su piastre o colture liquide (i nostri dati non pubblicati).

2. Potenziali problemi con le cellule di lievito Esprimendo tossici PolyQ-espansione Proteine

Le cellule di lievito che esprimono le proteine ​​tossiche in caso contrario di espansione polyQ possono non mostrare alcun difetto di crescita del ^9. La natura genetica di questi soppressori di polyQ-tossicità non sembra basarsi su semplici mutazioni mendeliani e quindi possono verificarsi con frequenza relativamente elevata (i nostri risultati non pubblicati). Noi ipotizziamo che questi soppressori spontanei sono causati dalla polimerizzazione dei prioni non identificati che funzionano in modo simile a [RNQ +] nella determinazione toxicity.Thes polyQdi e soppressori spontanee di tossicità polyQ può compromettere il buon esito di qualsiasi esperimento che mira a caratterizzare la tossicità polyQ o per identificare e caratterizzare modificatori di tossicità polyQ.

Al fine di evitare il verificarsi frequente di questi soppressori spontanee, seguire le misure precauzionali descritte di seguito, che hanno dimostrato di essere molto efficace:

1. Utilizzare le cellule di lievito fresco per gli esperimenti di tossicità. Non conservare il lievito per lunghi periodi di tempo. Spesso recuperare colonie di lievito fresco da scorte congelate.
2. Spesso monitorare l'espressione e aggregazione di tossici polyQ-espansione proteine ​​mediante microscopia a fluorescenza.
3. Conservare le cellule di lievito in media che reprimere l'espressione della tossicità tossico polyQ in ogni momento (cioè in terreni selettivi contenenti glucosio come fonte di carbonio unica) Prima di eseguire le misure della tossicità.
4. Utilizzare almeno tre trasformanti indipendenti per ogni polyQ-tossicità esperimento. </ Li>

3. Saggi di crescita

1. Per ciascuna condizione sperimentale, inoculare una colonia ciascuno da tre trasformanti indipendenti di cellule di lievito che ospitano il tossico polyQ-espansione proteina in 3 ml di mezzo di lievito selettivi con glucosio come unica fonte di carbonio.
2. Incubare queste colture notte a 30 ° C. In queste condizioni, le cellule non sono esprimere la proteina polyQ-espansione perché il glucosio nel mezzo reprime la loro espressione. Non lasciate che questi overgrow culture; mantenere l'OD ₆₀₀ (assorbimento di luce di lunghezza d'onda 600 nm) delle culture notte inferiore a 1.
3. Noi abitualmente utilizzano tre diversi test per controllare i difetti di crescita di cellule di lievito che esprimono il tossico polyQ espansione delle proteine:

3,1 crescita su piastre

1. Diluire le colture di lievito durante la notte (cresciuto con 220 scuotimento rpm) ad un OD ₆₀₀ di 0.0005 (vale a dire una diluizione di 1:1000 a = 0,5 OD600 cultura) in selettiva meØ ⁷ contenente glucosio.
2. Uniformemente distribuito 50 microlitri (con conseguente ca. 700 colonie per piastra) di ogni cultura diluito su una piastra (diametro 10 cm) con terreno selettivo contenente glucosio come unica fonte di carbonio e una piastra con terreno selettivo contenente galattosio come unica fonte di carbonio.
3. Incubare le piastre per tre o quattro giorni a 30 ° C. Dopo l'incubazione, fotografare ciascuna piastra e contare il numero di colonie sul glucosio e il numero di colonie sulle piastre galattosio. In condizioni ideali, non ci dovrebbero essere o solo poche colonie sulla piastra galattosio quando si utilizzano cellule di lievito che esprime una altamente tossico polyQ espansione proteina (103q, Figura 2a).

3.2 saggi Spotting

Questo saggio è più quantitativa di saggio placcatura descritto sopra e può così rivelare anche sottili differenze di tossicità polyQ con lo stesso esperimento sulla stessa piastra.

1. Diluire il overnculture ight coltivate in terreno con glucosio ad una OD ₆₀₀ di 0,1.
2. Pipettare 200 ul di queste culture diluiti in sterili a 96 pozzetti e preparare cinque diluizioni seriali di cinque volte in acqua sterile utilizzando una pipetta multicanale.
3. Utilizzando un frogger, (chiamato anche spotter, con 8 x 6 perni per il trasferimento di cellule in sospensione) trasferire le sospensioni cellulari su piastre contenenti terreni selettivi con glucosio come unica fonte di carbonio e piastre contenenti terreno selettivo con galattosio come unica fonte di carbonio.
4. Lasciare le piastre asciugare prima incubati a 30 ° C per tre o quattro giorni.
5. Dopo l'incubazione, scattare fotografie di ogni disco (Figura 2b).

3,3. Monitoraggio tossicità polyQ nel lievito da una crescita di colture liquide

Questo protocollo è il più quantitativa (OD600 numeri) dei tre saggi descritti qui e può anche rilevare differenze molto sottili di tossicità polyQ. Il suddetto occurrence di soppressori spontanee, comunque, potenzialmente in grado di produrre risultati fuorvianti. Pertanto consigliamo di combinare questo test con almeno uno dei due saggi placcatura sopra descritti. Noi proponiamo di utilizzare lo strumento BioscreenC per questi esperimenti. Il BioscreenC è uno strumento che misura automaticamente la densità ottica delle colture di lieviti a 100-pozzetti mentre incubate a temperature definite con agitazione definito. Altri metodi per la coltivazione di cellule di lievito e misurare la loro densità ottica possono anche applicare.

1. Lavare le cellule di lievito da un supporto minimo contenente glucosio come unica fonte di carbonio per tre volte in 3 ml di acqua sterile.
2. Diluire le culture notte coltivate in terreno con uno di galattosio OD ₆₀₀ di 0,1.
3. Riempire ciascun pozzetto della piastra di ben 100 BioscreenC con 300 ml delle colture di lieviti.
4. Aprire il programma Easy Experiment Bioscreen. Determinare il numero di campioni che si desidera controllare (compresi gli spazi e le medie solocontrolli), impostare la temperatura a 30 ° C, impostare la durata degli esperimenti a 3 giorni, impostare gli intervalli di misura per 15 minuti, impostare il filtro a 600 nm / Brown, e impostare la modalità di agitazione a 15 secondi prima di ogni misurazione forza media.
5. Lo strumento BioscreenC e il software in dotazione produrrà fogli di calcolo Excel di ogni punto dati ricavati durante l'esperimento.
6. Preparare curve di crescita con Excel per ciascun campione e confrontare la crescita di diversi campioni (figura 2c). Una descrizione dettagliata di analisi dei dati ottenuti da esperimenti BioscreenC è già stata fornita ^10.

4. Risultati rappresentativi

Figura 1. Il modello di lievito polyQ. a) Rappresentazione schematica del tossico polyQ espansione delle proteine. b) la microscopia a fluorescenza che mostra cellule di lievito che esprimono una breve, non tossico polyQcellule proteina espansione (25q, pannello di sinistra) e lievito che esprime una lunga, polyQ tossico-espansione proteina (103q, pannello di destra).

Figura 2. Risultati rappresentativi dei saggi di crescita di cellule di lievito che esprimono polyQ-espansione proteine. a) saggio placcatura. Circa 700 cellule di lievito sono state ripartite su piastre e incubate per tre giorni a 30 ° C. Il pannello superiore mostra una piastra contenente terreno di glucosio, cioè l'espressione del tossico polyQ-espansione proteina (103q) non viene indotta. Il pannello inferiore mostra una piastra di lievito contenente mezzo galattosio, ossia l'espressione del tossico polyQ-espansione proteina viene indotta. Si noti che nell'esperimento qui, non soppressore spontanea si è verificato. B) Individuazione del dosaggio. Cinque serie di cinque diluizioni di cellule di lievito ospitare sia un non-proteina tossica polyQ (25q) o un tossico polyQ espansione Protein (103q) sono stati depositati su piastre di glucosio che reprimono la espressione delle proteine ​​(pannello sinistro) o su piastre galattosio che inducono la loro espressione. Le piastre sono state poi incubate per tre giorni a 30 ° C. c) esperimento BioscreenC. La crescita di colture di cellule di lievito che esprimono sia una proteina non-tossico polyQ (25q) o tossica polyQ-espansione proteina (103q) sono stati controllati dal strumento BioscreenC. Le condizioni sperimentali e l'analisi degli esperimenti BioscreenC sono descritti nel testo principale.

Questo manoscritto descrive tre approcci complementari sperimentali per misurare polyQ-tossicità nel lievito organismo modello basato sulla crescita ridotta di cellule di lievito che esprimono tossici polyQ-espansione proteine. Il lavoro nel lievito ha offerto profonde intuizioni sui meccanismi cellulari e molecolari di base di misfolding e la sua tossicità conseguente, compreso il misfolding e la tossicità del polyQ-espansione proteine ^{​​9,11,12.} Esperimenti basati sui protocolli presentati qui hanno già contribuito a identificare e caratterizzare esaltatori genetiche o soppressori di tossicità polyQ, modificatori di piccole molecole di tossicità polyQ e dei meccanismi cellulari alla base della tossicità polyQ ^5-8,13,14.

I protocolli presentati può essere facilmente adattato per esplorare altri modificatori di tossicità polyQ come le condizioni di crescita differenti o mutazioni genetiche che ridurre o aggravare la tossicità polyQ. Inoltre, il protocollo sperimentale presentatopuò essere facilmente regolata per testare la tossicità di altre proteine ​​tossiche misfolded in lievito.