Vekst Analyser å vurdere Polyglutamine giftighet i Gjær

1. Expression of Toxic PolyQ-utvidelse Proteiner i Gjær

En systematisk analyse har etablert presise aminosyre sekvens av en polyQ-utvidelse protein som er nødvendig for å produsere toksisitet i gjær ^7. Denne giftige polyQ-utvidelse protein inneholder en amino-terminal FLAG-tag etterfulgt av 17 aminosyrer fra den opprinnelige sekvensen av huntingtin protein, en polyQ region, og en karboksy-terminal fusjon til et fluorescerende protein (GFP enten eller CFP, se figur 1 a). Uttrykket av proteiner med polyQ utvidelser av 46 glutamines eller mer (f.eks 72 og 103 glutamines) produserer toksisitet i gjær da uttrykte under kontroll av induserbar og relativ sterk GAL1 promoter ^{7, 9.}

Som beskrevet tidligere, er polyQ toksisitet i gjær bare tilsynelatende i celler som bærer protein Rnq1p i sin prion konformasjon, [RNQ +], f.eks gjær belastningen W303 ^9. Den giftige polyQ-utvidelse protein recapitulates sentrale aspekter ved polyQ-biologi i gjær, som polyQ lengde-avhengig toksisitet (se nedenfor) og aggregering (figur 1 b). Spesielt ikke giftige polyQ-utvidelse proteiner ikke drepe gjærceller umiddelbart, de heller svekke eller arrestere cellen syklus og celle devision, og dermed bremse ned eller hemme veksten av gjær kolonier på tallerkener eller flytende kulturer (våre upubliserte data).

2. Potensielle Problemer med gjærceller Uttrykke Giftige PolyQ-utvidelse Proteiner

Gjærceller uttrykker de ellers giftige polyQ utvidelse proteiner kan ikke vise noen vekst defekt ^9. Den genetiske naturen av disse suppressors av polyQ-toksisitet synes ikke å være basert på enkel mendelsk mutasjoner og dermed kan oppstå med relativt høy frekvens (våre upubliserte resultater). Vi spekulerer i at disse spontane suppressors er forårsaket av herding av uidentifiserte prioner som fungerer på samme måte som [RNQ +] for å bestemme polyQ toxicity.These spontane suppressors av polyQ toksisitet kan true det vellykkede resultatet av ethvert eksperiment som har som mål å karakterisere polyQ toksisitet eller å identifisere og karakterisere modifikatorer av polyQ toksisitet.

For å unngå den hyppige forekomsten av disse spontane suppressors, følg forholdsregler som er beskrevet nedenfor, som har vist seg å være svært effektiv:

1. Bruk friske gjærceller for toksisitet eksperimenter. Ikke oppbevar gjær for lengre perioder. Ofte hente fersk gjær kolonier fra frosne aksjer.
2. Ofte overvåke uttrykk og aggregering av giftige polyQ-utvidelse proteiner ved fluorescens mikroskopi.
3. Hold gjærceller i media at undertrykke uttrykket av den giftige polyQ giftighet til alle tider (dvs. i selektive medier som inneholder glukose som eneste karbonkilde) før eventuelle giftighet målinger.
4. Bruk minst tre uavhengige transformants for hver polyQ-toksisitet eksperiment. </ Li>

3. Vekst Analyser

1. For hver eksperimentell betingelse, vaksinere en koloni hvert fra tre uavhengige transformants av gjærceller huser den giftige polyQ-ekspansjon protein i 3 ml av selektive gjær medier med glukose som eneste karbonkilde.
2. Inkuber disse kulturene over natten ved 30 ° C. Under disse forholdene, blir cellene ikke uttrykker polyQ-utvidelsen protein fordi glukose på mellomlang undertrykker sitt uttrykk. Ikke la disse kulturene overgrow; holde OD ₆₀₀ (absorbansen lys av 600 nm bølgelengde) av natten kulturer under ett.
3. Vi rutinemessig bruker tre ulike metoder for å overvåke vekst defekter i gjærceller uttrykker giftig polyQ-utvidelse protein:

3.1 Vekst på platene

1. Fortynne natten gjær kulturer (vokst med 220 rpm risting) til en OD ₆₀₀ av 0,0005 (dvs. en 1:1000 fortynning av en OD600 = 0,5 kultur) i selektive megdia ⁷ inneholder glukose.
2. Jevnt fordelt 50 mL (resulterer i ca. 700 kolonier pr plate) av hver fortynnet kultur på en plate (10 cm diameter) med selektivt medium som inneholder glukose som eneste karbon kilde og en plate med selektivt medium som inneholder galaktose som eneste karbonkilde.
3. Inkuber platene i tre til fire dager ved 30 ° C. Etter inkubasjon ta bilder av hver tallerken og telle antall kolonier på glukose og antall kolonier på galaktose platene. Under ideelle forhold, bør det være ingen eller bare svært få kolonier på galaktose tallerkenen når du bruker gjærceller uttrykker en svært giftig polyQ-ekspansjon protein (103Q, 2a figur).

3.2 Spotting analyser

Denne analysen er mer kvantitativ enn platekledning analysen beskrevet ovenfor, og kan dermed avsløre selv små forskjeller i polyQ toksisitet med samme eksperiment på samme plate.

1. Fortynn overnight kulturer vokst i medium med glukose til en OD ₆₀₀ på 0,1.
2. Pipetter 200 mL av disse fortynnede kulturene inn i sterile 96-brønns plater og forberede fem femdoblet seriefortynning i sterilt vann ved hjelp av en flerkanals pipette.
3. Bruke en Frogger, (også kalt en spotter, med 8 x 6 pins for overføring av cellesuspensjoner) overfører cellesuspensjoner på plater som inneholder selektive medier med glukose som eneste karbonkilde og plater som inneholder selektive medier med galaktose som eneste karbonkilde.
4. La platene tørke før ruger dem ved 30 ° C i tre til fire dager.
5. Etter inkubasjon ta bilder av hver plate (Figur 2b).

3.3. Overvåking polyQ toksisitet i gjær av vekst av flytende kulturer

Denne protokollen er den mest kvantitative (OD600 tall) av de tre analysene er beskrevet her, og kan selv oppdage svært små forskjeller i polyQ toksisitet. Den nevnte oCcurrence av spontane suppressors, derimot, kan potensielt gi misvisende resultater. Jeg anbefaler derfor å kombinere denne analysen med minst ett av de to plating analysene som er beskrevet ovenfor. Vi foreslår å bruke BioscreenC instrument for disse eksperimentene. Den BioscreenC er et instrument som måler automatisk den optiske tettheten av gjær kulturer i 100-brønns plater mens inkubert ved definerte temperaturer med definert agitasjon. Andre metoder for dyrking gjærceller og måle deres optisk tetthet kan også søke.

1. Vask gjærceller fra minimale medier som inneholder glukose som eneste karbonkilde tre ganger i 3 ml sterilt vann.
2. Fortynne natten kulturer dyrkes i medium med galaktose til en OD ₆₀₀ på 0,1.
3. Fyll hver brønn på 100-brønnen BioscreenC plate med 300 mL av gjær kulturer.
4. Åpne Easy Bioscreen Experiment program. Bestem antall prøver du ønsker å overvåke (herunder emner og middels barekontroller), sett temperaturen til 30 ° C, angi lengden av eksperimentene til 3 dager, setter måleintervaller til 15 minutter, satt filteret til 600 nm / Brown, og sette risting modus til 15 sekunder før hver måling på medium styrke.
5. Den BioscreenC instrument og den vedlagte programvaren vil produsere Excel-regneark for hvert datapunkt tatt under forsøket.
6. Forbered vekstkurver med Excel for hver prøve og sammenligne veksten av ulike prøver (figur 2c). En detaljert beskrivelse av analysen av data produsert av BioscreenC eksperimenter har blitt gitt før ^10.

4. Representative Resultater

Figur 1. Den gjær polyQ modell. a) Skjematisk fremstilling av giftige polyQ-utvidelse protein. b) Fluorescensmikroskopi viser gjærceller uttrykker en kort, ikke-giftig polyQekspansjon protein (25Q, venstre panel) og gjærceller uttrykke en lang, giftig polyQ-ekspansjon protein (103Q, høyre panel).

Figur 2. Representative resultater av vekst analyser av gjærceller uttrykker polyQ-utvidelse proteiner. a) Plating analysen. Ca 700 gjærceller ble spredt på plater og ruges i tre dager ved 30 ° C. Den øvre panelet viser en plate som inneholder glukose medium, dvs. uttrykk for giftige polyQ-ekspansjon protein (103Q) er ikke indusert. Den nederste panelet viser en gjær plate som inneholder galaktose medium, dvs. uttrykk for giftige polyQ-utvidelse protein er indusert. Merk at i forsøket vist her, skjedde ingen spontan suppressor. B) Spotting analysen. Fem serielle femdoblet fortynninger av gjærceller harboring enten en giftfri polyQ protein (25Q) eller en giftig polyQ-utvidelse protein (103Q) ble oppdaget på glukose plater som undertrykke uttrykket av proteiner (venstre panel) eller på galaktose plater som induserer deres uttrykk. Platene ble deretter inkubert i tre dager ved 30 ° C. c) BioscreenC eksperiment. Veksten av kulturer av gjærceller uttrykker enten en giftfri polyQ protein (25Q) eller en giftig polyQ-ekspansjon protein (103Q) ble overvåket av BioscreenC instrument. De eksperimentelle forhold og analyse av BioscreenC eksperimenter er beskrevet i hovedteksten.

Dette manuskriptet skisserer tre komplementære eksperimentelle tilnærminger for å måle polyQ-toksisitet i modellen organismen gjær basert på redusert vekst av gjærceller uttrykker giftige polyQ-utvidelse proteiner. Arbeid i gjær har tilbudt dype innsikt i grunnleggende cellulære og molekylære mekanismer av protein misfolding og dens påfølgende toksisitet, inkludert misfolding og toksisitet av polyQ-utvidelse proteiner ^9,11,12. Eksperimenter basert på protokollene som presenteres her har allerede bidratt til å identifisere og karakterisere genetiske enhancers eller supressorer av polyQ toksisitet, lite molekyl modifikatorer av polyQ toksisitet, og cellulære mekanismer som ligger til grunn polyQ toksisitet ^5-8,13,14.

De presenterte protokoller kan enkelt tilpasses til å utforske andre modifikatorer av polyQ toksisitet for eksempel ulike vekstvilkår eller genetiske mutasjoner som enten reduserer eller forverre polyQ toksisitet. Videre presenterte forsøksprotokollkan enkelt justeres for å teste giftigheten av andre giftige misfolded proteiner i gjær.