Vækstassays til Vurdere polyglutamine Toksicitet i gær

1. Angivelse af Giftige PolyQ-ekspansion proteiner i gær

En systematisk analyse har etableret den præcise aminosyre-sekvensen af en polyQ udvidelseskoefficient protein, der kræves for at frembringe toksicitet i gær ^7. Dette giftige polyQ udvidelseskoefficient protein indeholder en amino-terminal FLAG-tag, efterfulgt af 17 aminosyrer fra den oprindelige sekvens huntingtin protein, et polyQ region og en carboxy-terminal fusion til et fluorescerende protein (enten GFP eller CFP, se fig 1 a). Ekspressionen af proteiner med polyQ udvidelser af 46 glutamines eller flere (fx 72 og 103 glutamines) frembringer toksicitet i gær, når det udtrykkes under kontrol af den inducerbare og relativ stærk GAL1 promotoren ^{7, 9.}

Som tidligere beskrevet polyQ toksicitet i gær er kun synlige på celler, der bærer proteinet Rnq1p i prion konformation, [RNQ +], f.eks gærstammen W303 ^9. Den toksiske polyQ udvidelseskoefficient protein recapitulates centrale aspekter af polyQ-biologi i gær, såsom polyQ længde-afhængig toksicitet (se nedenfor) og aggregering (figur 1 b). Især ikke giftige polyQ-ekspansion proteiner ikke dræbe gærcellerne straks, de hellere forringe eller arrestere cellecyklus og celle devision, og dermed bremse ned eller hæmme væksten af ​​gær kolonier på plader eller flydende kulturer (vores upublicerede data).

2. Potentielle problemer med gærceller udtrykke Giftige PolyQ-ekspansion Proteiner

Gærceller, der udtrykker de ellers giftige polyQ ekspansion proteiner kan ikke vise nogen vækst defekt ^9. Den genetiske arten af ​​disse undertrykkere af polyQ-toksicitet synes ikke at være baseret på enkle mendelske mutationer og dermed kan forekomme med relativt høj frekvens (vores upublicerede resultater). Vi spekulere, at disse spontane suppressorer er forårsaget af hærdningen af ​​uidentificerede prioner, der fungerer på samme måde som [RNQ +] i bestemme polyQ toxicity.These spontane undertrykkere af polyQ toksicitet kan bringe det vellykkede resultat af et forsoeg, der sigter mod at karakterisere polyQ toksicitet eller til at identificere og karakterisere modifikatorer af polyQ toksicitet.

For at undgå den hyppige forekomst af disse spontane undertrykkere, skal du følge de forebyggende foranstaltninger er beskrevet nedenfor, som har vist sig at være meget effektive:

1. Anvendes friske gærceller for toksicitet eksperimenter. Må ikke opbevares gær i længere tid. Ofte hente friske gærkolonier fra frosne lagre.
2. Ofte overvåge udtryk og aggregering af giftige polyQ-ekspansion proteiner ved fluorescensmikroskopi.
3. Holde gærceller i medier, som undertrykker ekspressionen af ​​toksiske polyQ toksicitet på alle tidspunkter (dvs. i selektive medier indeholdende glucose som eneste carbonkilde) før nogen toksicitet målinger.
4. Brug mindst tre uafhængige transformanter for hver polyQ-toksicitet eksperiment. </ Li>

3. Vækstassays

1. For hver eksperimentel betingelse inokulere en koloni fra hver af tre uafhængige transformanter af gærceller indeholdende den toksiske polyQ udvidelseskoefficient protein i 3 ml selektive gær medium med glucose som eneste carbonkilde.
2. Inkuber disse kulturer natten over ved 30 ° C. Under disse betingelser, er cellerne ikke udtrykker polyQ udvidelseskoefficient protein, fordi glucose i mediet fortrænger deres ekspression. Lad ikke disse kulturer gro, holde OD ₆₀₀ (absorbansen af lys på 600 nm bølgelængde) af nattens kulturer under 1.
3. Vi anvender rutinemæssigt tre forskellige assays til at overvåge vækstdefekter af gærceller, der udtrykker den toksiske polyQ-ekspansion protein:

3,1 Vækst på plader

1. Fortyndes natten gærkulturer (dyrket med 220 rpm rystning) til en _OD600 på 0,0005 (dvs. en 1:1000 fortynding af en OD600 = 0,5 kultur) i selektiv migdia ⁷ indeholdende glucose.
2. Ligeligt 50 pi (resulterende i ca. 700 kolonier per plade) af hver fortyndet kultur på den ene plade (10 cm diameter) med selektivt medium indeholdende glucose som eneste carbonkilde og en plade med selektivt medium indeholdende galactose som den eneste carbonkilde.
3. Pladerne inkuberes i tre til fire dage ved 30 ° C. Efter inkubationen tage billeder af hver plade og tælle antallet af kolonier på glucose og antallet af kolonier på galactose pladerne. Under ideelle betingelser, bør der ikke være nogen eller kun meget få kolonier på galactose pladen ved anvendelse af gærceller udtrykker et stærkt giftigt polyQ-ekspansion protein (103q, figur 2a).

3.2 Spotting analyser

Dette assay er mere kvantitativ end klædningen assayet beskrevet ovenfor, og kan således afsløre selv små forskelle i polyQ toksicitet med det samme eksperiment på den samme plade.

1. Fortynd overnøjre kulturer dyrket i medium med glucose til en _OD600 på 0,1.
2. Pipetter 200 ul af disse fortyndede kulturer i sterile 96-brøndsplader og forberede fem femdobbelt seriefortyndinger i sterilt vand ved anvendelse af en multi-kanal pipette.
3. Ved hjælp af en Frogger, (også kaldet en spotter med 8 x 6 stifter til overførsel af cellesuspensioner) overfører cellesuspensionerne på plader indeholdende selektive medier med glucose som eneste carbonkilde og plader indeholdende selektive medier med galactose som den eneste carbonkilde.
4. Tillader pladerne tørre før inkubering af dem ved 30 ° C i tre til fire dage.
5. Efter inkubationen tage billeder af hver plade (figur 2b).

3,3. Overvågning polyQ toksicitet i gær ved vækst i flydende kulturer

Denne protokol er den mest kvantitative (OD600 numre) for de tre assays beskrevet her, og kan endda detektere meget små forskelle i polyQ toksicitet. Den førnævnte occurrence af spontane suppressorer kan imidlertid potentielt give misvisende resultater. I anbefaler derfor kombinere dette assay med mindst én af de to plettering ovenfor beskrevne assays. Foreslår vi at anvende BioscreenC instrument til disse eksperimenter. Den BioscreenC er et instrument, der måler automatisk den optiske densitet af gærkulturer i 100-brønds plader, mens inkuberet ved definerede temperaturer med defineret omrøring. Andre metoder til dyrkning af gærceller og måling af deres optiske tæthed kan også anvendes.

1. Vask gærcellerne fra minimale medier indeholdende glucose som eneste carbonkilde tre gange i 3 ml sterilt vand.
2. Fortyndes overnatskulturer dyrket i medium med galactose til _en OD600 på 0,1.
3. Fylde hver brønd i 100-brønds BioscreenC plade med 300 gl af gærkulturer.
4. Åbn Easy Bioscreen Experiment program. Bestem antallet af prøver, du ønsker at overvåge (herunder emner og mellemstore kunkontroller), indstille temperaturen til 30 ° C, indstille længden af ​​forsøgene til 3 dage, indstille måletidspunkterne til 15 minutter, skal du indstille filteret til 600 nm / Brown, og indstil ryste mode til 15 sekunder før hver måling på medium styrke.
5. Det BioscreenC instrumentet og den tilknyttede software vil producere Excel-regneark for hvert datapunkt taget under eksperimentet.
6. Forberede vækstkurver i Excel for hver prøve og sammenligne væksten af ​​forskellige prøver (figur 2C). En detaljeret beskrivelse af den analyse af data produceret af BioscreenC eksperimenter er blevet leveret inden ^10.

4. Repræsentative resultater

Figur 1. Gæren polyQ model. a) Skematisk repræsentation af toksiske polyQ-ekspansion protein. b) Fluorescensmikroskopi viser gærceller, der udtrykker et kort, ikke-toksisk polyQekspansion protein (25Q, venstre panel) og gær-celler udtrykker en lang toksisk polyQ-ekspansion protein (103q, højre panel).

Figur 2. Repræsentative resultater af vækstassays af gærceller, der udtrykker polyQ-ekspansion proteiner. a) Plating assay. 700 gærceller blev spredt ud på pladerne og inkuberet i tre dage ved 30 ° C. Den øvre panel viser en plade indeholdende glucose medium, dvs ekspressionen af det toksiske polyQ-ekspansion protein (103q) ikke induceres. Det nederste panel viser en gær plade indeholdende galactose medium, dvs ekspressionen af det toksiske polyQ udvidelseskoefficient protein induceres. Bemærk, at i forsøget er vist her, uden spontane suppressor forekom. B) Spotting assay. Fem serielle fem ganges fortyndinger af gærceller indeholdende enten et ikke-toksisk polyQ protein (25Q) eller et toksisk polyQ udvidelseskoefficient protein (103q) blev spottet på glucose plader, der undertrykker ekspressionen af ​​proteinerne (venstre panel) eller galactose plader, der inducerer deres ekspression. Pladerne blev derefter inkuberet i tre dage ved 30 ° C. c) BioscreenC eksperiment. Væksten af kulturer af gærceller, der udtrykker enten en ikke-toksisk polyQ protein (25Q) eller et toksisk polyQ-ekspansion protein (103q) blev overvåget ved BioscreenC instrument. De eksperimentelle betingelser og analyse af de BioscreenC eksperimenter er beskrevet i hovedteksten.

Dette håndskrift skitserer tre komplementære eksperimentelle metoder til at måle polyQ-toksicitet i model organisme gær baseret på reduceret vækst af gærceller, der udtrykker giftige polyQ-ekspansion proteiner. Arbejde i gær har tilbudt dybtgående indsigt i de grundlæggende cellulære og molekylære mekanismer af protein misfoldning og dens efterfølgende toksicitet, herunder misfoldning og toksicitet af polyQ-ekspansion proteiner ^9,11,12. Eksperimenter baseret på de protokoller, der præsenteres her, har allerede bidraget til at identificere og karakterisere genetiske forstærkere eller undertrykkere af polyQ toksicitet, lille molekyle modifikatorer af polyQ toksicitet og cellulære mekanismer der understøtter polyQ toksicitet ^5-8,13,14.

De præsenterede protokoller kan let tilpasses til at undersøge andre modifikatorer af polyQ toksicitet såsom forskellige vækstbetingelser eller genetiske mutationer, som enten reducerer eller forværre polyQ toksicitet. Endvidere præsenterede eksperimentelle protokollet kan justeres til at teste toksiciteten af ​​andre toksiske fejlfoldede proteiner i gær.