Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

1. Esenciales Experimental

Fabricación de electrodos

• Hay numerosos carbono microelectrodos de fibra métodos de fabricación ya que la mayoría son de fabricación propia. Por lo general lo que dicta los detalles de fabricación de electrodos es la técnica electroquímica que se aplica a los electrodos (por ejemplo, amperometría vs FSCV). Para FSCV, microelectrodos se pueden hacer en casa con el siguiente procedimiento de tres pasos. Para una descripción más completa de la fabricación de electrodos de fibra de carbono, consulte a un reciente artículo JOVE ^1. Sin embargo, tenga en cuenta que los electrodos se describe a continuación, de forma cilíndrica microelectrodos de fibra de carbono, que requieren menos pasos para la fabricación en comparación con los microelectrodos de fibra de carbono amperométrica del protocolo antes mencionado. Este protocolo simplificado no obliga a hervir la fibra de carbono en la acetona, el fuego y pulir los capilares de vidrio, o el uso de epoxy para sellar la unión de fibra de vidrio.
• Utilizando ASPIR succión al vacíocomió una fibra de carbono (un diámetro de 7 m; Goodfellow Oakdale, PA) en un capilar de vidrio de borosilicato con microfilamentos (longitud 10 cm, od 1,2 mm, 0,68 mm id, sistemas de AM, Carlsborg, WA).
• Coloque el capilar roscado en el extractor de electrodos (Narishige, Tokio, Japón), donde el capilar se tira por la mitad. Ajustes de salida para el extractor de electrodos varían de un laboratorio a otro. Como referencia, nuestra configuración de salida para el extractor son 90,7 imán principal, el 23,2 imán sub-, y 53,4 para el calentador. Los ajustes de salida debe ser empíricamente refinado para generar un cono de cristal que es de aproximadamente 4,4 mm de longitud, con un sello hermético alrededor de la fibra de carbono.
• Bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón), recortar la fibra de carbono (con una hoja de bisturí) se extiende desde la punta de vidrio que permite aproximadamente 50-200 micras de la fibra de carbono para salir de la interfaz cerrado herméticamente.

Preparación de la solución

Hay tres tipos de cera artificialcefalorraquídeo líquido (ACSF) las soluciones deben ser preparadas de antemano, todo en ultrapura (18 mW cm) de agua.

• Sacarosa LCRa se pueden preparar por lo menos un día antes del corte. El tampón de sacarosa LCRa se compone de (en mM): 180 sacarosa, 30 de NaCl, 4,5 KCl, 1,0 MgCl _2, 26 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, y 10 D-glucosa (pH 7,4) y debe ser oxigenada con 95 % O ₂ / 5% CO ₂ durante 15 minutos ^2. Si se prepara antes de tiempo, la solución puede conservarse refrigerado a 4 º C durante un máximo de 1 semana.
• ACSF solución para las grabaciones de voltamperometría debe estar preparado el día del experimento. La solución consiste en LCRa (en mM): NaCl 126, KCl 2,5, 2,4 CaCl _2, 1,2 MgCl _2, 25 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, 11 D-glucosa, ácido ascórbico 0,4 (pH 7,4). Durante el transcurso del experimento, por burbujeo de oxigeno con un 95% O2 / 5% CO ₂ a la temperatura ambiente.
• Modificado-LCRa solución para la calibración de electrodos contiene (en mM): 2,5 KCl, 126 NaCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 2,4 CaCl _2, 1,2 MgCl _2, y 25 NaHCO ₃ (pH 7,4) y se puede mantener durante un máximo de una semana, sin refrigeración o de oxigenación.

La calibración de electrodos

• La viabilidad del electrodo y la sensibilidad está determinada por pre-y post-calibración, respectivamente, con un flujo de "células T", que contiene tres puertos con un electrodo de referencia sellado (Ag / AgCl). El microelectrodo fabricados se baja en el flujo de "células T". El puerto de entrada está conectada a una bomba de inyección, lo que permite un flujo continuo de modificación-LCRa con un caudal de 2 ml / min. El tercer puerto de la "T-cell" está conectado a una jeringa llena de dopamina M 3, hecho en LCRa modificada.
• Para pre-calibración, permite modificar solución LCRa fluya durante unos 3-7 segundos, y luego manualmente se inyectan 1-2 ml de la norma de la dopamina 3 micras. Para cada electrodopara ser pre-calibrados, repita la calibración por lo menos 3 veces y media las corrientes máximas obtenidas de cada uno.
• Inmediatamente después del experimento de voltametría corte (ver sección 3), el electrodo es posterior a la calibración de la misma manera como se describió anteriormente.
• El factor de calibración (que más tarde utilizados durante el análisis de datos) se determina dividiendo la oxidación de la dopamina media actual (nA) por la concentración de la norma de la dopamina. Por ejemplo, la respuesta de la corriente se divide por 3 cuando se utiliza un nivel de dopamina 3 micras.

2. Cortar la preparación

1. Verter 10 ml de sacarosa LCRa en un vaso pequeño y colocar en un cubo de hielo. Además, el adhesivo lugar instantáneo (Loctite 404) en el cubo de hielo, a su alcance.
2. Prepare una hoja de afeitar y las herramientas necesarios para la disección, como pinzas, espátulas, tijeras, un trapo de limpiar con una gasa con alcohol.
3. Sacrificio del ratón por asfixia de CO ₂ en un cha de gas pequeñasmber, seguido por decapitación inmediata utilizando unas tijeras afiladas. Quite rápidamente el cerebro. Lugar del cerebro en el vaso de LCRa sacarosa helada durante 10 minutos aproximadamente.
4. Mientras tanto, prepare Vibratome para cortar. En primer lugar, coloque un poco de hielo triturado en el baño de la muestra. Posición de la cámara muestra y apriete para sostenerlo firmemente en su lugar. Agregue más hielo alrededor de la cámara muestra a llenar los vacíos, asegurándose de que el hielo no entra en la cámara. Coloque la hoja de afeitar limpia en el soporte de la cuchilla en el Vibratome y llenar la cámara muestra con LCRa sacarosa helada.
5. Para configurar una superficie de trabajo para preparar el cerebro, vierta un poco de frío LCRa sacarosa en un pedazo de toalla de papel que se ha colocado boca abajo sobre una placa de Petri. Mediante la transferencia de fórceps en el cerebro en el preparado placa de Petri. Para cortes coronales, cortar el cerebelo a lo largo del eje medio-lateral con una cuchilla de afeitar y desechar. Esto crea una base plana que puede ser colocada en la etapa de Vibratome.
6. Lugaruna gota del pegamento Loctite (colocados en el cubo de hielo en el Paso 1) en el escenario de la muestra. De inmediato, colocar el extremo plano del cerebro preparado en el escenario, se mantiene lo más derecho posible. Lugar la fase en la cámara de la muestra y apriete el tornillo, lo que garantiza que el cerebro está completamente inmerso en la LCRa sacarosa en la cámara.
7. Uso de los controles en la parte frontal de la Vibratome ajustar el escenario para que las líneas de una hoja de afeitar con la parte superior del cerebro. Parámetros óptimos para la Vibratome se obtienen mediante el establecimiento de la frecuencia y la velocidad a la baja. Velocidades más bajas son para reducir al mínimo la fuerza de la hoja de aplastar el cerebro, que se observa a altas velocidades. Grosor de corte se establece en 400 micras.
8. Las rebanadas primeras no contienen el cuerpo estriado. Repita el corte hasta que las rebanadas contienen el cuerpo estriado se obtienen. Una vez que la región del estriado se alcanza (confirmada por referencias anatómicas), utilice un pincel para levantar el corte y colocarlos en un vaso conoxigenada, a temperatura ambiente LCRa. Por lo general, se puede obtener de 3 a 4 rebanadas que contiene el complejo estriado, para que el caudado-putamen y el núcleo accumbens se incluyen.
9. Permita que los cortes de aclimatarse en ACSF oxigenada a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usar para los experimentos.

3. Grabaciones de voltamperometría de rebanadas

Mientras que los cortes están incubando, la cámara de grabación de corte se puede preparar.

1. Tomar un tubo conectado a la cámara de grabación de inmersión (Custom Scientific, Denver, CO) y el lugar en la oxigenación, LCRa temperatura ambiente. Colocar la bomba de perfusión (Watson Marlow Limited, Falmouth, Inglaterra) a un caudal de 1 mL / min. Ajuste el regulador de temperatura a 32 ° C. Después de LCRa llena el titular de la corte a pedido (modificado etapa de malla de disco), se preparan para la división mediante la eliminación de las burbujas de aire con una jeringa de aguja (BD aguja espinal).
2. El primer corte del baño haciendo el vacío en latubo de salida (que conduce a contenedor de residuos de cristal líquido) con una jeringa para iniciar el flujo. Coloque una Kimwipe para actuar como una mecha en el borde del titular de la división para el control de desbordamiento de búfer.
3. Después de 1 hora de incubación, la transferencia de los cortes al titular de la corte en la cámara de grabación, que está continuamente perfundidos con 95% O ₂ / 5% CO ₂ LCRa temperatura ambiente.
4. Sumerja el Ag / AgCl del electrodo de referencia en el soporte de corte (pegado a la tapa de la cámara de corte) y conecte el electrodo con una pinza a la etapa de la cabeza.
   • El electrodo de referencia Ag / AgCl se puede hacer en casa por anodizado (+1 V) un alambre de plata 250 micras (PM Systems, Carlsborg, WA) en HCl 1 M durante 5 minutos para depositar una fina capa de AgCl en la superficie de la Alambre de plata.
5. Baje el electrodo de estimulación de tungsteno (plásticos One, Roanoke, VA) para la superficie de la porción del cerebro del cuerpo estriado. El electrodo de estimulación se pone en contacto con la rodaja, ya que descansa en la cimade ella, pero no debe perforar la tajada. En nuestro montaje experimental, la estimulación es generada por un estimulador neurológico.
6. El micro fibra de carbono de trabajo es rellenado con una solución 150 mM KCl con una aguja BD espinal. Un cable se inserta a continuación (Squires Electronics, Cornelius, OR), que está conectado a la etapa de la cabeza el ruido de baja ChemClamp potenciostato (Corporaciones Dagan, Minneapolis, MN), utilizando una pinza. El electrodo de trabajo se coloca alrededor de 100 a 200 m de distancia de los electrodos de estimulación bipolar, a unos 75 m de profundidad en el sector.
7. Estímulos eléctricos, ya sea utilizando un solo (monofásicas, 350 mA, 60 Hz, y 4 de ancho de pulso ms) o múltiples (pulsos por ejemplo, 5, 350 mA, 20 Hz, y 4 ms de ancho) legumbres, son entregados por el electrodo de estimulación para evocar neurotransmisor la versión ^3.
8. Para medir la dopamina evocada eléctricamente con FSCV, una forma de onda triangular se aplica a los electrodos. Parámetros típicos para dopamina de detección: el potencial de los microelectrodos de fibra de carbono se mantiene en -0,4 V en comparación con un electrodo de referencia Ag / AgCl, rampa de un límite positivo de 1,2 V, y traído de vuelta a -0,4 V a una velocidad de barrido de 400 V / s .
9. El corte es estimulado eléctricamente cada 5 minutos y las medidas de voltamperometría de flujo de salida de la dopamina como resultado se hizo durante 15 segundos.
10. Después de al menos tres grabaciones estables estimulado eléctricamente liberan dopamina (diferencia entre la altura del pico es <10%), que contiene LCRa agente farmacológico de interés es perfundido a un flujo de 1 mL / min durante el corte de 30 minutos para obtener el máximo efecto. Estimulado eléctricamente grabaciones de la dopamina se hacen cada 5 minutos durante la perfusión farmacológico.

4. Análisis de datos

Resultante huellas actuales en función del tiempo obtenidos a partir de la porción puede ser en forma de regresión no lineal a un conjunto de Michaelis-Menten ecuaciones basadas, según lo descrito por Wightmany sus colegas en el software escrito en LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) ^4-6. En este programa, las huellas de corriente en función del tiempo puede ser instalado por dos parámetros diferentes, V _max (nM / s, correspondiente a la tasa de absorción por el transportador de dopamina, como lo demuestra la fase descendente de la traza) y la concentración de dopamina por impulso (nM , que corresponde a la máxima altura del pico). El valor de K _m, el reflejo de la afinidad de la dopamina para el transportador de la dopamina, se encuentra a 160 nM y no ha cambiado. El electrodo de post-factor de calibración que se determina después de que el experimento se requiere antes de la instalación. El software LabVIEW contiene el coeficiente de determinación (R ²⁾ parámetro para determinar la bondad del ajuste (R ² valores> 0,8 se utilizan).

5. Resultados representante

FSCV se utilizó para examinar un solo pulso, la liberación de dopamina estimula eléctricamente y la absorción en el caudado-puestoAmén (CPU), el núcleo accumbens (NAc) central, y el NAC shell en ratones. Los resultados representativos se muestra en la Figura 1 muestran las parcelas actuales (o concentración) en función del tiempo. La flecha roja indica que la estimulación eléctrica se aplica a la división seguida de un aumento correspondiente en la cantidad de corriente atribuible a cambios en la concentración de dopamina en el microelectrodo de fibra de carbono. El proceso predominante durante la estimulación eléctrica es la liberación de dopamina, pero otros procesos como la absorción y la difusión contribuyen a la altura del pico observado en general también. La fase descendente del pico se atribuye principalmente a la reabsorción del neurotransmisor por su transporte ya que la estimulación neuronal se ha detenido ^7. Sin embargo, la decadencia de pico no se limita a la recaptación, como la difusión y el metabolismo también contribuyen a la disminución en la corriente. Se ha postulado que, desde la escala de tiempo de las mediciones electroquímicas es una cuestión de segundos, FSCV es demasiado rápido para medir contributions del metabolismo ^7. En estos vestigios actuales en función del tiempo, el eje y se convierte en la concentración (M) con el factor de calibración después de la experiencia. El recuadro de la Figura 1A es el fondo respectivo resta voltamogramas cíclico de las huellas de corriente en función del tiempo. Trazado de la corriente medida (eje Y) contra el potencial aplicado al electrodo (eje x), la dopamina es una sustancia químicamente identificados con un pico de oxidación observada en 0,6 V y un pico correspondiente reducción de la dopamina-orto-quinona se observa en - 0,2 V frente a un electrodo de referencia Ag / AgCl. La tercera representación de los datos utiliza una imagen tridimensional pseudo-color parcela (Figura 1B), que combina la información tanto de la traza actual en función del tiempo y el Voltamograma cíclico para formar una sola parcela. En el representante pseudo-color trama, el tiempo se representa en cuestión de segundos a lo largo del eje x, la tensión aplicada a la fibra de carbono microelectrodo de trabajo se representa a lo largo del eje, y la corriente se representa como falsí color a lo largo del eje z. Debido al pequeño tamaño de microelectrodos de fibra de carbono (menos de 7 m de diámetro), estimulado eléctricamente dinámica de la dopamina pueden ser detectados en regiones anatómicas discretas del cuerpo estriado (núcleo CPU en comparación con NAC frente al shell NAC; Figura 2).

Una de las ventajas de la utilización de cortes coronales del estriado es que elimina las contribuciones de los cuerpos celulares de dopamina, y permite una investigación de la dinámica de la dopamina presináptica. El control presináptico de la liberación de dopamina y la captación no se limita estrictamente a autorreceptores de dopamina o las funciones del transportador como otros han demostrado ^{16, 17.} Heterorreceptores de otros sistemas de neurotransmisores de dopamina también modulan la dinámica de ^{18, 19.} Rastros actual representante en función del tiempo se muestra en la Figura 3 demuestran que cuando las rebanadas son tratados con M quinpirole 1 (D2/D3 agonista de los receptores) durante 30 minutos, una disminución en la liberación de dopamina eléctricamente evocados se observa. Por otro lado, cuando un sustratopara el transportador de dopamina, como la metanfetamina, es perfundido por el corte durante 30 minutos, no hubo diferencia en la liberación de dopamina se observa (Figura 3B). La decadencia de pico se desplaza a la derecha, que suele estar asociado con alteraciones en la cinética del transportador de dopamina (K _m) ^3. Finalmente, la Figura 3C es un seguimiento de representante de la traza actual en función del tiempo una vez que el corte se ha bañado en un 100 ng / mL cerebro factor neurotrófico derivado (BDNF), solución que ha planteado la hipótesis de influir en la dinámica de la liberación de dopamina ^{20, 21.} De esta traza representante, se puede observar que el BDNF tiene la capacidad de mejorar la liberación de dopamina evocados eléctricamente. En conjunto, estos tratamientos farmacológicos hincapié en la utilidad de FSCV para investigar la dinámica de la dopamina en el estriado.

La principal limitación de la utilización de cortes de cerebro para investigar la dinámica presináptica de dopamina por FSCV es que la neuro-a partir de un cerebro intacto se ha perdido.Con FSCV rebanada es imposible estudiar los efectos de los neurotransmisores de otras regiones del cerebro, lo que hace difícil comprender las contribuciones de estos sistemas en la funcionalidad de la región que se investiga (por ejemplo, el cuerpo estriado) o para evaluar no estimulado los niveles de dopamina. Sin embargo, los últimos avances técnicos en FSCV ha permitido la dopamina medidas transitorias (con y sin estimulación eléctrica) se mueven libremente en las ratas en respuesta a una manipulación farmacológica, la auto-administración, o la novedad ^{22 a 24.} En general, el tramo FSCV proporciona información valiosa sobre la dinámica de la dopamina presináptica, y el acoplamiento resultados rebanada FSCV a técnicas complementarias como la neuroquímica de microdiálisis, la electrofisiología, y / o se mueven libremente FSCV ofrece una visión más completa del funcionamiento de los neurotransmisores en el cerebro.

Figura 1. Eléctricamente evocado dopaminaliberación e medido utilizando FSCV siguientes un solo pulso de estimulación en rodajas CPV dorsal de ratones C57BL/6J. (A) La concentración frente a curva del tiempo en el que se evocó la liberación de dopamina por un solo pulso (flecha roja). El asterisco representa los factores que contribuyen al aumento de la concentración, que es predominantemente la liberación de dopamina, pero el consumo y la difusión que contribuyan también. El doble asterisco representa el pico de la señal de regresar a base, principalmente debido a la absorción, pero también contribuye la difusión. El recuadro muestra el voltamogramas cíclico correspondiente. (B) representa Representante de color de la pantalla de tiempo de CPU dorsal (eje x), potencial aplicado a los microelectrodos de fibra de carbono en comparación con el electrodo de referencia Ag / AgCl (eje Y), y la corriente en pseudo-color.

Figura 2. Liberan dopamina provocada por un impulso de estimulación eléctrica individual (indicado por la flecha roja) en el núcleo de NACy la cáscara de los ratones C57BL/6J. (A y C) La concentración frente a las huellas del tiempo y su voltamogramas cíclico correspondiente (recuadro) desde el núcleo y la cáscara NAC. (B y D) Como se describió anteriormente, parcelas representativas color del núcleo y la cáscara NAC.

Figura 3 se hace después de que el representante de corte fue tratado con un agente farmacológico durante 30 minutos,. En todos los casos, un solo impulso se utiliza para evocar la liberación de dopamina en la CPU. (A) Aplicación de los agonistas de los receptores D2 de la dopamina, quinpirole (rojo traza) en comparación con el tratamiento previo (rastro negro). (B) la perfusión de metanfetamina (traza púrpura) en comparación con el tratamiento previo (rastro negro). (C) La capacidad del factor neurotrófico derivado del cerebro que influyen en la dinámica de dopamina (azul traza) en comparación con el tratamiento previo (rastro negro).

El protocolo que aquí se presenta muestra cómo preparar y usar rodajas de cerebro de ratón coronal para experimentos FSCV. Aunque este método es específico para la obtención y medición de la dinámica de la dopamina, neurotransmisores tales como la adenosina, el peróxido de hidrógeno, norepinefrina y serotonina han sido controlados en vivo o in vitro con FSCV ^{3, 8 - 11.} FSCV se puede utilizar para controlar algunos de estos neuroquímicos otras modificaciones simples de la forma de onda aplicada al electrodo de trabajo ^{3, 11.} Dado que muchas de estas especies tienen potenciales similares neuroquímicos la oxidación, el voltamogramas cíclico generado por proporcionar una huella digital química única para cada especie oxidable, que permite la identificación química. Además, FSCV se ha utilizado en varias especies, de moscas de la fruta a los primates no humanos, para lograr una mejor comprensión de la neurotransmisión en estos organismos modelo ^{12 - 15.} Una de las principales razones que ha FSCV been utilizado en una variedad de especies se debe a que el pequeño diámetro de los microelectrodos de fibra de carbono, por lo general menos de 7 m de diámetro. Como resultado, estos microelectrodos que sea posible tomar muestras de tejido de ambientes muy pequeños, como en el caso de la mosca de la fruta del cerebro (hemisferio norte), o discriminar de discreto sub-regiones anatómicas como el núcleo NAC frente a la concha de las especies más grandes ^{12 -14.}

En conclusión, los resultados presentados aquí demuestran que voltametría rebanada es una invaluable herramienta de electroquímica para investigar la dinámica de presináptica de dopamina en el estriado del ratón. Los datos representativos se centra en la perfusión de los agentes farmacológicos más de una porción del cerebro de una "normal o saludable de control y la capacidad de caracterizar los parámetros de la liberación de dopamina y la captación. Además, FSCV se puede utilizar para evaluar las diferencias en la liberación estimulada eléctricamente y los parámetros de absorción de los animales modificados genéticamente o tratados por su propia cuenta o después de Pharmactratamiento metodológico ^{15 a 16.} Rebanada FSCV ofrece una oportunidad única para investigar la dinámica de la neurotransmisión de dopamina en regiones anatómicas discretas que ocurren en una escala temporal de milisegundos. En general, la técnica electroquímica de FSCV proporciona una mayor resolución espacial y temporal en comparación con otras técnicas neuroquímicas.