Presynaptische Dopamine Dynamiek in het striatum Brain Plakjes met Fast-scan cyclische voltammetrie

1. Experimentele essentials

Electrode Fabrication

• Er zijn tal van koolstofvezel micro-elektroden fabricagemethoden omdat de meeste zijn gemaakt in eigen huis. Typisch wat dicteert de elektrode fabricage details is de elektrochemische techniek die wordt toegepast op de elektrode (bijv. amperometrie versus FSCV). Voor FSCV, kunnen micro-elektroden worden in eigen huis gemaakt met behulp van de volgende drie-stappen procedure. Voor een meer volledige beschrijving van carbon fiber elektrode fabricage, zie een recent artikel ¹ Jove. Merk echter op dat de elektroden hieronder beschreven cilindrische carbon fiber micro-elektroden, die minder stappen te fabriceren ten opzichte van de amperometrische koolstofvezel micro-elektroden van de hierboven genoemde protocol nodig is. Deze vereenvoudigde protocol vereist niet dat het koken van het koolstofvezel in aceton, brand-polijsten van de glazen capillairen, of het gebruik van epoxy aan de glasvezel verbinding afdichting.
• Met behulp van vacuüm zuigkracht aspiraten een carbon fiber (diameter 7 micrometer, Goodfellow Oakdale, PA) in een borosilicaatglas capillair met microfilament (lengte 10 cm, od 1.2 mm, 0.68 mm id, AM-systemen, Carlsborg, WA).
• Plaats de schroefdraad capillaire in de elektrode trekker (Narishige, Tokyo, Japan), waar de capillaire wordt getrokken in de helft. Output-instellingen voor de elektrode trekker doen variëren van lab tot lab. Ter referentie, onze output instellingen voor de trekker zijn 90,7 belangrijkste magneet, 23.2 sub-magneet, en 53,4 voor de verwarming. De output instellingen moeten empirisch worden verfijnd om een ​​glas taper dat is ca. 4,4 mm lang, met een goede afdichting rond de carbon fiber te genereren.
• Onder een microscoop (Olympus, Tokyo, Japan), trim de carbon fiber (met behulp van een scalpel), dat zich uitstrekt van het glas topen waarna ongeveer 50 tot 200 micrometer van de koolstofvezel te steken van de goed gesloten interface.

Oplossing Voorbereiding

Drie soorten kunstmatige cerebrospinal vloeistof (aCSF) oplossingen dienen te worden voorbereid, allemaal in ultrapuur (18 MΩ cm) water.

• Sucrose-aCSF kan worden bereid ten minste een dag voor het snijden. De sucrose-aCSF buffer bestaat uit (in mm): 180 sucrose, 30 NaCl, KCl 4,5, 1,0 MgCl _2, 26 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, en 10 D-glucose (pH 7,4) en dienen te worden met behulp van zuurstof 95 % O ₂ / 5% CO ₂ gedurende 15 minuten ^2. Als van tevoren voorbereid, kan de oplossing worden gekoeld bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
• ACSF oplossing voor voltammetric opnames moeten worden voorbereid op de dag van het experiment. De aCSF oplossing bestaat uit (in mm): 126 NaCl, KCl 2,5, 2,4 _CaCl2, 1,2 MgCl _2, 25 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, 11 D-glucose, 0,4 ascorbinezuur (pH 7,4). In de loop van het experiment, door zuurstof te borrelen met 95% O2 / 5% CO ₂ bij kamertemperatuur.
• Modified-aCSF oplossing voor elektrode kalibraties bevat (in mm): 2,5 KCl, 126 NaCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 2,4 _CaCl2, 1,2 MgCl _2, en 25 NaHCO ₃ (pH 7,4) en kan gedurende maximaal een week, zonder koeling of oxygenatie.

Electrode Kalibratie

• Elektrode levensvatbaarheid en de gevoeligheid wordt bepaald door de pre-en post-kalibratie, respectievelijk, met behulp van een stroom 'T-cel "met 3 poorten met een vaste referentie-elektrode (Ag / AgCl). De gefabriceerde micro-elektrode wordt neergelaten in de stroom 'T-cel ". De inlaatpoort is verbonden met een spuit pomp, waardoor een continue stroom van gereguleerde aCSF bij een debiet van 2 ml / min. De derde haven van de "T-cel" is verbonden met een injectiespuit gevuld met 3 uM dopamine, gemaakt in aangepaste-aCSF.
• Om pre-kalibreren, zodat gewijzigd aCSF oplossing om stroom voor ongeveer 3 - 7 seconden, en vervolgens handmatig injecteren 1-2 ml van de 3 uM dopamine-norm. Voor elke elektrodete pre-gekalibreerd, herhaalt u de kalibratie minstens 3 keer en het gemiddelde van de maximale stroom verkregen uit elkaar.
• Direct na de slice voltammetrie experiment (zie hoofdstuk 3), de elektrode is post-gekalibreerd op dezelfde wijze als hierboven beschreven.
• De kalibratiefactor (later gebruikt tijdens de data-analyse) wordt bepaald door het gemiddelde dopamine oxidatie huidige (nA) door de concentratie van de dopamine-norm. Bijvoorbeeld, is de huidige reactie gedeeld door 3 bij het gebruik van een 3 uM dopamine-norm.

2. Slice voorbereiding

1. Giet 10 ml sucrose aCSF in een klein bekerglas en plaats in een ijsemmer. Bovendien, plaats direct lijm (Loctite 404) in het ijs emmer, binnen handbereik.
2. Bereid een scheermesje en de nodige tools die nodig zijn voor dissectie, zoals tangen, spatel, en scharen, schoon door ze schoon met een alcoholdoekje.
3. Offer muis door CO ₂ stikken in een kleine gas-chamber, gevolgd door een onmiddellijke onthoofding met een scherpe schaar. Snel te verwijderen van de hele hersenen. Plaats de hersenen in beker van ijs-koude sucrose aCSF gedurende ongeveer 10 minuten.
4. In de tussentijd bereiden Vibratome voor het snijden. Plaats eerst een aantal gemalen ijs in het monster bad. Plaats de monster kamer en draai om stevig op zijn plaats. Voeg meer ijs rond het monster kamer te vullen in de gaten, zorg ervoor dat er geen ijs komt in de kamer. Leg de schoongemaakte scheermes in het blad houder op de Vibratome en vul het monster kamer met ijskoude sucrose aCSF.
5. Voor het instellen van een werkoppervlak voor het bereiden van de hersenen, giet wat koud sucrose aCSF op een stuk keukenrol dat is geplaatst op een omgekeerde petrischaaltje. Met behulp van een tang overdracht van de hersenen op de voorbereide petrischaal. Voor coronale plakjes, snijd de kleine hersenen langs de mediale-laterale as met een scheermesje en gooi ze weg. Hierdoor ontstaat een vlakke basis die kan worden aangebracht op het Vibratome podium.
6. Plaatseen daling van de Loctite lijm (geplaatst in het ijs emmer in stap 1) op het monster podium. Onmiddellijk brengt hij de platte kant van de voorbereide hersenen op het podium, en houdt deze rechtop mogelijk te maken. Plaats het podium in de monster kamer en draai de schroef aan, ervoor te zorgen dat de hersenen volledig is ondergedompeld in de sucrose aCSF in de kamer.
7. Met behulp van de controles op de voorkant van de Vibratome aan te passen het podium, zodat het scheermesje lijnen met de bovenkant van de hersenen. Optimale parameters voor de Vibratome worden verkregen door het instellen van de frequentie en de snelheid te laag. Lagere snelheden hebben de voorkeur om de kracht van het blad te minimaliseren van kneuzingen in de hersenen, die wordt waargenomen bij hogere snelheden. Slice dikte is ingesteld op 400 um.
8. De eerste paar schijfjes bevatten geen van de striatum. Herhaal het snijden tot schijfjes met de striatum worden verkregen. Zodra de striatale regio is bereikt (bevestigd door anatomische oriëntatiepunten), gebruik dan een kwast aan de slice en plaats het in een beker met een liftzuurstof, kamertemperatuur aCSF. Normaal gesproken kan men bekomen 3-4 sneetjes met de striatale complex, zodat de caudate-putamen en de nucleus accumbens zijn inbegrepen.
9. Laat de plakjes in zuurstofrijk aCSF bij kamertemperatuur acclimatiseren voor ten minste 1 uur voordat u voor experimenten.

3. Voltammetric opnamen van schijfjes

Terwijl de schijfjes zijn incuberen, kan de slice opname kamer worden voorbereid.

1. Neem de slang aangesloten op de overstroming opname kamer (Custom Scientific, Denver, CO) en plaats in zuurstof, kamertemperatuur aCSF. Stel de perfusie pomp (Watson Marlow Limited, Falmouth, Engeland) naar een debiet van 1 ml / min. Stel de temperatuurregelaar tot 32 ° C. Na aCSF vult de custom-built slice houder (gewijzigd mesh disc podium), te bereiden op de slice door het verwijderen van eventuele luchtbellen met behulp van een naald spuit (BD spinale naald).
2. Prime de slice bad door het tekenen van een vacuüm op deuitstroom buis (leidend tot glazen fles vloeibare afvalstoffen) met behulp van een injectiespuit te stromen te starten. Plaats een kimwipe op te treden als een lont aan de rand van de slice houder buffer overflow te controleren.
3. Na 1 uur incubatie, overdracht van de plakjes om de slice houder in de opname ruimte, die voortdurend wordt geperfuseerd met 95% O ₂ / 5% CO ₂ op kamertemperatuur aCSF.
4. Dompel de Ag / AgCl referentie-elektrode in de slice houder (geplakt deksel van slice kamer) en sluit de elektrode met behulp van een alligator clip op het hoofd podium.
   • De Ag / AgCl referentie-elektrode kan worden gemaakt in eigen huis door anodiseren (+1 V) een 250 micrometer zilverdraad (AM Systems, Carlsborg, WA) in 1 M HCl gedurende 5 minuten om een ​​dun laagje AgCl deponeren op het oppervlak van de zilverdraad.
5. Hoe lager de wolfraam elektrode (Plastics One, Roanoke, VA) aan het oppervlak van de striatale hersenen slice. De stimulerende elektrode contact maakt met de slice als het berust op de topvan, maar moet niet doorboren de slice. In onze experimentele opstelling, is de stimulatie gegenereerd door een neurologische stimulator.
6. De carbon fiber werken micro-elektrode is back-gevuld met een 150 mM KCl oplossing met behulp van een BD-spinale naald. Een lood draad is dan ingebracht (Squires Electronics, Cornelius, OR), die is aangesloten op het hoofd podium van de low-noise ChemClamp potentiostaat (Dagan Corporations, Minneapolis, MN) met behulp van een alligator clip. De werkende elektrode wordt geplaatst ongeveer 100 tot 200 micrometer uit de buurt van de bipolaire stimulatie-elektroden, ongeveer 75 micrometer diep in de slice.
7. Elektrische prikkels, met behulp van enkele (monofasische, 350 uA, 60 Hz, en 4 ms pulsbreedte) of meerdere (bijvoorbeeld 5 peulvruchten, 350 uA, 20 Hz, en 4 ms breed) pulsen, worden geleverd door de stimulerende elektrode neurotransmitter op te roepen release ^3.
8. Elektrisch opgewekt met behulp van dopamine FSCV te meten, is een driehoek golfvorm toegepast op de elektrode. Typische parameters voor de dopamine detectie: het potentieel van de koolstofvezel micro-elektrode wordt gehouden op -0,4 V ten opzichte van een Ag / AgCl referentie-elektrode, uitloopt tot een positieve limiet van +1.2 V, vervolgens teruggebracht naar -0,4 V bij een scan snelheid van 400 V / s .
9. Het schijfje wordt elektrisch gestimuleerd om de 5 minuten en voltammetric metingen van de resulterende dopamine efflux zijn gemaakt voor 15 seconden.
10. Na minstens drie stabiele elektrisch gestimuleerd dopamine-afgifte-opnamen (verschil tussen piek-hoogte <10%), is aCSF met farmacologische agent van belang geperfuseerde bij een debiet van 1 ml / min over de slice gedurende 30 minuten tot maximaal effect te verkrijgen. Elektrisch gestimuleerd dopamine-opnamen worden gemaakt om de 5 minuten tijdens de farmacologische perfusie.

4. Data-analyse

Als gevolg de huidige versus de tijd sporen verkregen van de slice kan worden geschikt door de niet-lineaire regressie naar een set van Michaelis-Menten gebaseerde vergelijkingen, zoals beschreven door Wightmanen zijn collega's in de software geschreven in LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) ^4-6. In deze software kan de huidige functie van de tijd sporen worden voorzien door het variëren van twee parameters, V _max (nM / s, overeenkomt met de koers van de opname door de dopamine transporter, zoals blijkt uit de dalende fase van de sporen) en dopamine concentratie per puls (nM , die overeenkomt met de maximale piekhoogte). De K _m waarde, een afspiegeling is van de affiniteit van dopamine voor de dopamine transporter, is ingesteld op 160 Nm en niet veranderd. De elektrode post-kalibratiefactor dat wordt bepaald na het experiment wordt voorafgaand vereist om fitting. De LabView software bevat de determinatiecoëfficiënt (R ²⁾ parameter om de goodness of fit (R ^2-waarden> 0,8 worden gebruikt) te bepalen.

5. Representatieve resultaten

FSCV werd gebruikt om enkele puls, elektrisch gestimuleerd dopamine-afgifte en opname in de Spiegelse-put te onderzoekenamen (CPU), nucleus accumbens (NAC) kern, en NAC shell in muizen. Representatieve resultaten weergegeven in figuur 1A aan te tonen huidige (of concentratie) versus tijd percelen. De rode pijl geeft aan wanneer elektrische stimulatie wordt toegepast op de slice, gevolgd door een overeenkomstige stijging van de hoeveelheid stroom toe te schrijven aan veranderingen in dopamine concentratie bij de koolstofvezel micro-elektrode. De overheersende proces tijdens elektrische stimulatie is dopamine release, maar ook andere processen zoals opname en verspreiding bijdragen aan het algemeen waargenomen piekhoogte ook. De dalende fase van de piek is voornamelijk toe te schrijven aan de neurotransmitter heropname door de vervoerder, omdat de neuronale stimulatie is gestopt ^7. Echter, is de piek verval niet beperkt tot heropname, als diffusie en de stofwisseling dragen ook bij aan de daling van de stroom. Het is gepostuleerd dat sinds de tijdschaal van elektrochemische metingen is een kwestie van seconden, FSCV is te snel om contributio metenns uit metabolisme ^7. In deze huidige versus de tijd sporen, is de y-as omgezet in concentratie (uM) met de post-experiment kalibratiefactor. De inzet voor de figuur 1A is de respectieve achtergrond afgetrokken cyclische voltammogrammen voor de huidige versus tijd sporen. Het plotten van de gemeten stroom (y-as) tegen de toegepaste potentieel om de elektrode (x-as), is dopamine chemisch geïdentificeerd met een waargenomen oxidatie piek bij +0.6 V en een overeenkomstige vermindering piek van dopamine-ortho-chinon wordt waargenomen bij - 0,2 V versus een Ag / AgCl referentie-elektrode. De derde voorstelling van de gegevens maakt gebruik van een drie-dimensionale pseudo-color plot (Figuur 1B) het combineren van de informatie van zowel de huidige versus tijd sporen en de cyclische voltammogram tot een plot vormen. In de representatieve pseudo-color plot, de tijd is uitgezet in seconden langs de x-as, is de aangelegde spanning van de koolstofvezel werkende micro-elektrode getekend langs de y-as, en de huidige wordt voorgesteld als false kleur langs de z-as. Vanwege de kleine omvang van koolstofvezel micro-elektroden (~ 7 micrometer in diameter), kan elektrisch gestimuleerd dopamine dynamiek worden gedetecteerd in discrete anatomische gebieden van de striatum (CPU versus NAC kern versus NAC schaal; figuur 2).

Een voordeel van het gebruik van striatale coronale slices is dat het bijdragen elimineert uit de dopamine cellichamen, en zorgt voor een onderzoek naar de presynaptische dopamine dynamiek. Presynaptische controle van de dopamine-afgifte en opname is niet strikt beperkt tot dopamine autoreceptor of de vervoerder fungeert als anderen hebben aangetoond ^{16, 17.} Heteroreceptors van andere neurotransmittersystemen ook moduleren dopamine dynamiek van ^{18, 19.} Vertegenwoordiger van de huidige versus de tijd sporen weergegeven in figuur 3A te tonen dat wanneer schijfjes worden behandeld met 1 uM quinpirole (D2/D3 receptor agonist) gedurende 30 minuten, een daling van de elektrisch opgewekte dopamine release wordt waargenomen. Aan de andere kant, wanneer een substraatvoor de dopamine transporter, zoals methamfetamine, is doorbloed over de slice voor 30 minuten, is geen verschil in dopamine-afgifte waargenomen (Figuur 3B). De piek verval is naar rechts verschoven, die doorgaans wordt geassocieerd met veranderingen in dopamine transporter kinetiek (K _m) ^3. Tot slot, Figuur 3C is een vertegenwoordiger spoor van de huidige versus tijd te traceren nadat de slice is badend in een 100 ng / mL brain-derived neurotrophic factor (BDNF) oplossing, die is verondersteld dat dopamine-afgifte beïnvloeden de dynamiek ^{20, 21.} Van deze vertegenwoordiger traceren, is te zien dat BDNF de mogelijkheid om elektrisch opgewekte dopamine los te verbeteren is. Tezamen bieden deze farmacologische behandelingen benadrukken het nut van FSCV aan dopamine dynamiek probe in het striatum.

De belangrijkste beperking van het gebruik van de hersenen plakjes op presynaptische dopamine dynamiek te onderzoeken door FSCV, is dat de neurocircuitry van een intacte hersenen verloren is gegaan.Met slice FSCV is het onmogelijk het bestuderen van de effecten van de neurotransmitters uit andere hersengebieden, waardoor het moeilijk is om bijdragen van deze systemen te begrijpen van de functionaliteit van de regio wordt onderzocht (bijvoorbeeld de striatum), of aan niet-gestimuleerde dopamine niveau te beoordelen. Echter, recente technische vooruitgang in FSCV toegestaan ​​voor dopamine tijdelijke metingen (met en zonder elektrische stimulatie) in vrij bewegende ratten in reactie op een farmacologische manipulatie, zelfbestuur, of novelty ^{22 tot 24.} Over het algemeen slice FSCV geeft waardevolle informatie over presynaptische dopamine dynamiek, en koppeling slice FSCV resultaten tot aanvullende neurochemische technieken zoals microdialyse, elektrofysiologie, en / of vrij bewegende FSCV biedt een meer uitgebreid overzicht van de neurotransmitter functioneren in de hersenen.

Figuur 1. Elektrisch opgewekte dopaminee los gemeten met behulp van FSCV volgende single-pulse stimulatie in dorsale CPU segmenten van C57BL/6J muizen. (A) De concentratie versus tijd te traceren waarin dopamine release werd opgeroepen door een enkele puls (rode pijl). De single sterretje staat voor de factoren die bijdragen aan de stijging van de concentratie, die voornamelijk is dopamine release, maar de opname en verspreiding ook bijdragen. De dubbele asterisk staat voor de piek-signaal terug te keren naar de uitgangswaarde, voornamelijk als gevolg van de opname, maar ook de verspreiding bijdraagt. Inzet toont de bijbehorende cyclische voltammogrammen. (B) Representatieve kleur percelen van de dorsale-CPU tijd (x-as), toegepast potentieel om de koolstofvezel micro-elektrode ten opzichte van Ag / AgCl referentie-elektrode (y-as), en de stroom in pseudo-kleur.

Figuur 2. Dopamine-afgifte opgeroepen door een enkele elektrische stimulatie puls (aangegeven met de rode pijl) in de kern van NACen shell uit C57BL/6J muizen. (A en C) De concentratie versus tijd sporen en de bijbehorende cyclische voltammogrammen (inzet) van de NAC-kern en schil. (B en D) Zoals eerder beschreven, vertegenwoordiger kleur plots uit de NAC-kern en schil.

Figuur 3 Vertegenwoordiger sporen na de slice was behandeld met een farmacologische stof gedurende 30 minuten. In alle gevallen, een enkele puls werd gebruikt om dopamine los te roepen in de CPU. (A) Toepassing van de dopamine D2 receptor agonist, quinpirole (rode spoor) in vergelijking met vóór de behandeling (zwart trace). (B) Methamfetamine perfusie (paars spoor) in vergelijking met vóór de behandeling (zwart trace). (C) Het vermogen van brain-derived neurotrophic factor dopamine dynamiek beïnvloeden (blauw trace) in vergelijking met vóór de behandeling (zwart trace).

Het protocol hier gepresenteerde laat zien hoe voor te bereiden en de muis coronale de hersenen plakjes te gebruiken voor FSCV experimenten. Hoewel deze methode is specifiek voor het verkrijgen en het meten van dopamine dynamiek, andere neurotransmitters zoals adenosine, hebben waterstofperoxide, noradrenaline en serotonine zijn gemonitord in vivo of in vitro met FSCV ^{3, 8 - 11.} FSCV kan worden gebruikt om sommige van deze andere neurotransmitters monitor door eenvoudige aanpassingen van de golfvorm toegepast op de werkende elektrode ^{3, 11.} Aangezien veel van deze neurochemische soorten hebben soortgelijke oxidatie potenties, de gegenereerde cyclische voltammogrammen zorgen voor een unieke chemische vingerafdruk voor elke oxideerbare soorten, die chemische identificatie mogelijk maakt. Daarnaast is FSCV is gebruikt in diverse soorten, van fruitvliegen naar niet-menselijke primaten, om een beter begrip van de neurotransmissie te krijgen in deze modelorganismen ^12-15. Een van de belangrijkste redenen dat FSCV heeft bEEN-gebruikt op een verscheidenheid van soorten is te wijten aan de kleine diameter van de koolstofvezel micro-elektroden, gewoonlijk minder dan 7 micrometer in diameter. Als gevolg hiervan zijn deze micro-elektroden maken het mogelijk om weefsel van zeer kleine omgevingen, zoals in het geval van de fruitvlieg hersenen (NL), of om te onderscheiden van discrete sub-anatomische gebieden, zoals de NAC kern ten opzichte van de schaal in de grotere soorten ^{12 -14.}

Kortom, de hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat slice voltammetrie is een waardevol hulpmiddel om elektrochemische presynaptische dopamine dynamiek sonde in de muis striatum. De vertegenwoordiger van gegevens richt zich op perfuseren farmacologische middelen over een brein slice van een 'normale of gezonde' controle en de mogelijkheid om parameters van de dopamine-afgifte en opname te karakteriseren. Bovendien kan FSCV worden gebruikt om verschillen in elektrisch gestimuleerde afgifte en opname parameters in genetisch gemodificeerde of behandelde dieren op hun eigen of na Pharmac evaluerensche behandeling ^{15 - 16.} Slice FSCV biedt een unieke gelegenheid om dopamine neurotransmissie dynamiek te onderzoeken binnen de discrete anatomische regio's die zich voordoen op een tijdschaal van milliseconden. Algemeen, de techniek van elektrochemische FSCV biedt zowel verbeterde ruimtelijke en temporele resolutie in vergelijking met andere neurochemische technieken.