The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Department of Biology, University of Florida, 2UF Genetics Institute, University of Florida, 3Plant Molecular & Cellular Biology Program, University of Florida
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.16.17.90, User IP: 50.16.17.90, User IP Hex: 839913818
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes. J. Vis. Exp. (60), e3465, doi:10.3791/3465 (2012).
تقييم البروتينات باستخدام كبريتات الصوديوم بولكرلميد دوديسيل الهلام الكهربائي (SDS-PAGE) التحليل هو التقنية المستخدمة من قبل الباحثين الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية 1-4. بالنسبة للمختبرات التي تقوم بإجراء التحاليل اليومية من البروتينات، يمكن أن تكلفة المواد الهلامية بولكرلميد المتاحة تجاريا (~ $ 10/gel) أن تكون كبيرة بمرور الوقت. للتخفيف من هذه التكاليف، وبعض الباحثين تعد المواد الهلامية التي بولكرلميد الخاصة. الطرق التقليدية في صب هذه المواد الهلامية تستخدم عادة المعدات المتخصصة وألواح الزجاج هلام التي يمكن أن تكون باهظة الثمن ويحول دون صب المواد الهلامية كثير وتخزينها لاستخدامها في المستقبل. وعلاوة على ذلك، يمكن التعامل مع لوحات من الزجاج أثناء التنظيف أو هلام صب يؤدي إلى كسر عرضي خلق يشكل خطرا على السلامة، والتي قد تحول دون استخدامها في الصفوف الجامعية مختبر. بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، وماجستير غير مكلفةاستنباط مواد تم شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. ويمكن من خلال إعادة استخدام الأشرطة هلام البلاستيك من المواد الهلامية المتاحة تجاريا، ومختبرات المواد الهلامية التي تعمل بروتين متكرر توفير تكاليف كبيرة ويساعد في تحسين البيئة. وبالإضافة إلى ذلك، والأشرطة هلام البلاستيك هي مقاومة جدا للكسر، الأمر الذي يجعلها مثالية لقاعات الدراسة الجامعية مختبر.
1. إعداد أشرطة الكاسيت
2. صب جل حل
3. صب جل التراص
4. تخزين هلام
5. إعداد العينات
6. تشغيل هلام
7. تلطيخ الجل
8. تنظيف الأشرطة
9. ممثل النتائج
لان الايبوكسي ستشكل ختم المياه ضيق، (الشكل 1)، فإن أشرطة الكاسيت لا تسرب عندما يتم سكب مادة الأكريلاميد في حل منها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لأشرطة هلام فتحت بسهولة لاسترداد هلام لتلطيخ، ويمكن مقشر والايبوكسي الخروج من أشرطة الكاسيت للسماح المستمر إعادة استخدامها. كما هو مبين في الشكل 2، وهلام ويبين فصل واضح من علامات البروتين وشرائح عينة مناسبة للبروتين الكهربائي الروتيني.
الشكل 1. تطبيق صحيفةالكاتيون من الايبوكسي لختم أشرطة minigel. يتم تطبيق طبقة رقيقة من الايبوكسي إلى حافة واحدة من أشرطة الكاسيت قبل التجميع. لتسليط الضوء على الايبوكسي، كانت كاذبة اللون الأحمر في هذه الصورة.
الشكل 2. صب فصل البروتينات على هلام SDS-تريس، جليكاين باستخدام إعادة استخدام الأشرطة minigel. تم تنفيذ SDS-PAGE على النحو المبين أعلاه. الكهربائي التالية تم إزالة جل من كاسيت minigel، ملطخة في SafeStain SimplyBlue وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وتصويرها باستخدام الضوء الأبيض المنقولة. حارة M يحتوي على بروتين SeeBlue المعايير Plus2 قبل الملون. يشار إلى الأوزان الجزيئية للبروتينات في M ممر على الجانب الأيمن من هلام في kilodaltons (قده). الممرات الأخرى تظهر من البروتينات المحللة تطهيرها من البكتيريا تعبر عن الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (ضريبة المبيعات) الموسومة بروتين. البروتينات هي تلك التي تظهر غسلها من زالخرز lutathione قبل شطف من البروتين ضريبة السلع والخدمات الموسومة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
بروتين الكهربائي للهلام هو وسيلة لا غنى عنها للمختبرات البيولوجيا الجزيئية الأكثر. minigels المتاحة تجاريا توفير مستوى عال من الراحة، ولكن يمكن أن يكون مكلفا. هنا نبين كيفية إعادة استخدام الأشرطة minigel من ماركة شعبية من minigels متاحة تجاريا. هذا الأسلوب يحتفظ الراحة من وجود مصدر الجاهزة من المواد الهلامية، ولكن في جزء صغير من تكلفة minigels متاحة تجاريا. ومن الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء هو تطبيق المبلغ الصحيح للالايبوكسي لاغلاق تماما الكاسيت قبل إضافة مادة الأكريلاميد unpolymerized لمنع التسرب. استخدام الايبوكسي فقط أن يتم تصنيف لصناعة البلاستيك، والسماح بوقت كاف للبلمرة من الايبوكسي كما هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة. واضاف للراحة، ويمكن أن تكون مختومة الأشرطة متعددة وتخزينها قبل صب المواد الهلامية. عندما صب جل حل، ومن المؤكد ان تترك مجالا كافيا للهلام التراص، عادة حوالي 0.5 سم أكثر من ارتفاع تيانه يستخدم مشط لتشكل الآبار. خلال البلمرة من هلام حل، والحفاظ على هلام مثل تستقيم أن المنطقة العازلة المشبعة 1-بيوتانول ستشكل على التوالي، وسطح مستو لتشكل في الجزء العلوي من جل حل. إذا كان جل لا تتبلمر في غضون 30 دقيقة، يمكن زيادة كمية وكالة الأنباء الجزائرية 10٪ وTEMED. مرة واحدة في هلام انتهاء تشغيل، فمن المهم لكسر بعناية ختم الايبوكسي لمنع تمزيق جل رقيق. وذكرت والأسلوب هنا من إعادة استخدام الأشرطة الجل التجارية يمكن ان يوفر تكاليف كبيرة المرتبطة باستخدام SDS-PAGE متكررة. ويمكن إعادة استخدام الأشرطة نفسه لسنوات وليس لدينا أي أدلة على أن الاستخدام المتكرر للكاسيت نفسه يقلل من قابليتها للاستخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد المواد الهلامية متعددة وتخزينها لعدة أسابيع في فيلم البوليستر كيس الحاجز تحتوي على كمية صغيرة من 1X العازلة التي تحتوي على هلام التراص 0،1٪ أزيد الصوديوم.
الاختصارات:
Dithiothreitol (DTT)، ن، ن، ن '، ن'،، tetramethylethylenediamine (TEMED)، اكتب أنا المياه كاشف الصف (IRG-H2O)، ammounium بيرسلفات (APS)، كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)، تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس القاعدة)، N، N'-الميثيلين مكرر، الأكريلاميد (مكرر -الأكريلاميد)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
الكتاب أشكر معهد هوارد هيوز الطبي لعلوم الحياة الجبهة المتحدة للمشاركة في الجائزة إلى AH
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Cassette (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | Available in 2, 5, 10, 12, 15 and 2D wells |
| Plastic Epoxy | Loctite | 108771 | |
| Electrical Tape | Scotch Co. | ||
| 125 mL side arm flask | Pyrex | 5360 | |
| 4X Tris-Base resolving gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 8.7 | ||
| acrylamide | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800173 | |
| 30.8% acrylamide solution | 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide in IRG-H2O | ||
| 10% APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 0.1 g ammonium persulfate in 1 ml IRG-H2O, prepared immediately before use |
| TEMED | Acros Organics | 138450500 | |
| 1-butanol saturated with 1X resolving gel buffer | 5:2 1-butanol to 1X resolving gel buffer | ||
| 4X Tris-Base stacking gel buffer | 1.5 M Tris-base pH 6.8 | ||
| Gel comb | Invitrogen | NC3015 | 15 well, 1.0 mm thickness |
| Impulse Sealer | TEW Electric Heating Equipment | ||
| Heat Sealable Pouch | Kapak/Scotchpak | 1 pint size (6.5" x 8") | |
| Gel storage buffer | 1X stacking gel buffer with 0.1% sodium azide | ||
| Novex SDS Tris-Glycine sample buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running buffer | Invitrogen | LC2675 | 1L of 10X stock: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | |
| Gel Knife | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Safe Stain | Invitrogen | LC6065 |
