JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of Developmental Biology

You have subscription access to videos in this collection through your user account.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

1, 2, 2, 1, 1, 3

1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Center for Neural Development and Disease, University of Rochester Medical Center, 3Deptartment of Neurology, Center for Neural Development and Disease, University of Rochester Medical Center

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    نحن هنا وصف طريقة لتصور مباشرة microregional نقص الأكسجة الأنسجة في القشرة الماوس

    Date Published: 2/21/2012, Issue 60; doi: 10.3791/3466

    Cite this Article

    Polesskaya, O., Sun, A., Salahura, G., Silva, J. N., Dewhurst, S., Kasischke, K. Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence. J. Vis. Exp. (60), e3466, doi:10.3791/3466 (2012).

    Abstract

    قدرة الدماغ على العمل بمستويات عالية من الطلب على التمثيل الغذائي يعتمد على امدادات الاوكسجين المستمر من خلال تدفق الدم والأنسجة انتشار الأوكسجين. هنا نقدم لبروتوكول تصور التجريبية والمنهجية لتصور مباشرة microregional نقص الأكسجة الأنسجة والاستدلال التدرجات الأوكسجين حول الوعاء في القشرة الماوس. لأنه يقوم على العلاقة غير الخطية بين الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد (NADH) كثافة مضان الداخلية وضغط الأكسجين الجزئي في الأنسجة، حيث لوحظ الأنسجة NADH مضان يزيد بشكل مفاجئ في مستويات الأكسجين في الأنسجة أقل من 10 مم زئبق 1. نحن نستخدم اثنين من الفوتون الإثارة في 740 نانومتر الذي يسمح لإثارة المتزامنة من جوهري مضان الأنسجة NADH وبلازما الدم يتناقض مع تكساس الأحمر ديكستران. مزايا هذه الطريقة على النهج القائمة تشمل ما يلي: أنه يستفيد من إشارة الأنسجة الذاتية ويمكن أن يؤديها باستخدام معيار ثنائي الفوتون في الدردشة الحيةالشيخوخة المعدات، ويسمح المراقبة المستمرة في المجال الكامل للرأي مع قرار عمق ميكرون 50 ~. علينا أن نبرهن على مناطق أبعد من أنسجة المخ الأوعية الدموية الدماغية تتوافق مع مناطق مستجمعات المياه الضعيفة التي هي الاولى لتصبح ميتة وظيفيا في أعقاب انخفاض نسبة الأوكسجين في الأوعية الدموية. هذا الأسلوب يسمح لأحد أن الأوكسجين صورة القشرية microregional وبالتالي فهو مفيد للنظر في دور غير كافية أو تقييد امدادات الاوكسجين في الأنسجة الأمراض الوعائية العصبية والسكتة الدماغية.

    Protocol

    1. إعداد الحيوان للتصوير

    ملاحظة: نحن نستخدم الفئران C57BL الكبار. ويمكن استخدام السلالات المعدلة وراثيا مختلفة اعتمادا على سؤال البحث. ومما يسهل عملية جراحية الاوعية الدموية الدقيقة وoximetry نبض في الفئران مع فرو أبيض (على سبيل المثال FVB سلالة).

    1. تحضير موقع الجراحة على مقاعد البدلاء. جميع الأدوات الجراحية تحتاج إلى تعقم أو تطهيرها مع الايثانول 70٪.
    2. اضافة الى وجود تحقيق المستقيم، وقياس درجة الحرارة بشكل مستمر الحيوان في جميع أنحاء الجسم الإجراء
    3. تخدير الماوس في البداية باستخدام 5٪ isoflurane. في 15-30 ثانية، عندما الحيوان لا يتحرك، وضعه على لوحة التدفئة (37 درجة مئوية)، وتطبيق قناع الوجه لتقديم مستمر من الهواء تحتوي على 1،3-1،5٪ isoflurane). تأكد من أن هذا الحيوان لا يستجيب لحافز الألم (على سبيل المثال قرصة الذيل).
    4. استخدام هلام المسيل للدموع اصطناعية لتغطية عيون الماوس،، لمنع التعرض للهواء الجاف.
    5. استخدام الحلاقة الكهربائية، وإزالة الشعر وROM الرأس وكلا من الفخذين. تطبق مزيل الشعر (على سبيل المثال نير) في الفخذ لمدة 2 دقيقة، والقضاء بعد ذلك بعناية لإزالة ما تبقى من شعر. وسيتم استخدام هذا الفخذ لoximetry.
    6. تطهير فروة الرأس باستخدام 10٪ محلول البوفيدون اليودي والايثانول 70٪.

    2. إعداد نافذة مفتوحة الجمجمة الجمجمة

    1. انطلاق 5 مم الذيلية في الجمجمة، وجعل شق في فروة الرأس مع مقص، ودفع سنتيمتر واحد. نقل الجلد إلى الجانبين لفضح الجمجمة.
    2. لإزالة الأغشية على الجزء العلوي من الجمجمة تطبق 10٪ محلول كلوريد الحديديك إلى الجزء العلوي من الجمجمة. يمسح الحل الزائدة، وتتخلص من الأغشية بعيدا مع 45 درجة ملاقط # 5 زاوية. من المهم أن إعداد الموقع بعناية، من أجل ضمان أنه لا يمكن لوحة الرأس بإحكام الجمجمة (خطوات # 4-6).
    3. باستخدام مجهر تشريح، وتحديد مجال الاهتمام. لاحظ أنه ينبغي تجنب الغرز في الجمجمة لأن الجمجمة ج1 كسر لا يمكن التكهن به على طول هذه الخطوط.
    4. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء السريع (على سبيل المثال Locktite 454) حول حواف نافذة لوحة رئيس (الشكل 1). وضع لوحة الرأس في مثل هذه الطريقة التي تتعرض لها المنطقة من اهتمام في الإطار. الضغط الخفيف على لوحة الرأس. تنطبق على كمية صغيرة من الاسمنت الأسنان لتتبلمر الغراء بسرعة. عقد لمدة 10 ثانية في حين أن الصمغ هو البلمره.
    5. تنطبق على كمية صغيرة من الغراء السريع إلى حواف النافذة لاغلاق لوحة الرأس والجمجمة. برغي لوحة رئيس لصاحب الحيوان في نطاق تشريح.
    6. استخدام الحفر الثاني Microtorque وضعت في 6000 دورة في الدقيقة، وقليلا IRF حفر 005، وإزالة جميع الغراء اضافية من الجمجمة والرأس من لوحة. وينبغي إزالة أي الغراء المتبقية على لوحة الرأس، لأنه سوف يتدخل بطريقة أخرى مع المرفق من الغطاء الزجاجي.
    7. تعيين الحفر في 1000 دورة في الدقيقة، والبدء في عمليات الحفر في الجمجمة عن طريق دائرة داخل الرأس نافذة لوحة، وقطره 5 أمتار ~م. استخدام حركات كاسحة ضوء كما لو كنت ترسم بالقلم الرصاص لينة جدا. وقف حفر كل ثانية 20-30 لإزالة الغبار العظام باستخدام الهواء المضغوط.
      ملاحظة: شكل فتحة في الرأس لوحة يسمح بالوصول إضافية لقمة الحفر (على الجراح من اليسار واليمين، وسلم)، والذي يجعل من السهل إنشاء إطار دائري في الجمجمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن اثنين من الثقوب على شكل غريب توفير المساحة المطلوبة لإدراج كلارك، أو قطب كهربائي زجاج كهربائي، في أنسجة المخ تحت النافذة في الجمجمة لقياسات إضافية البولاروجرافي أو الكهربية.
    8. كما تقدم الحفر، يتم تشكيل تحفر حول الجمجمة سليمة في المركز. يجب الحرص على عدم لكزة من خلال الجمجمة ضعيفة، ولكن لجعل هذا الجحر حتى سمك. كن حذرا اضافية حول الأوعية الدموية الكبيرة، لا ينبغي أن يتعرض للخطر، وإذا أمكن، حتى لا تمس.
    9. استخدام واحد "الساق" من ملاقط رقم 3 لرفع ("نفض الغبار قبالة") العظم في وسط النافذة. تطبيق قطرة من artificالاتحاد العالمي للتعليم السائل النخاعي (aCSF) على النافذة.
    10. مسح aCSF باستخدام بلطف زاوية ورقة الأنسجة الرخوة (مثل Kimwipe). وعادة ما تلف دورا في واحدة أو أكثر من المناصب حول حافة النافذة. ابتداء من الساعة واحدة من هذه المواقع، ورفع بلطف ثم إزالة الجافية من سطح الدماغ، وذلك باستخدام 45 درجة زاوية ملاقط # 5. عند اختيار موقع في أي لبدء إزالة الجافية، وتجنب المناطق المتاخمة للالأوعية الدموية الكبيرة. إذا كان النزيف يحدث، وتطبيق قطرة من aCSF والانتظار لمدة 2-3 دقائق لوقف نزيف قاصر على التوقف.
    11. إعداد 0.07٪ منخفضة ذوبان الاغاروز حل في aCSF) إحضار الاغاروز ذاب لدرجة حرارة الجسم. يمحو الفائض من aCSF من سطح الدماغ. صب الاغاروز في النافذة، وتغطي مع شريحة زجاجية. اضغط على الزجاج برفق لإجراء اتصال بين الزجاج واللوحة الرأس، وانتظر 10-20 ثانية حتى الاغاروز صلبة.
    12. الاغاروز إزالة الزائد من الغطاء الزجاجي باستخدام الملقط والناعمة المناديل الورقية.
    13. وضع صغيركمية من الغراء السريع في جميع أنحاء الزجاج لالغراء الزجاج إلى لوحة الرأس. تنطبق على كمية صغيرة من الاسمنت الأسنان ليصلب الغراء (الشكل 1).

    3. حقن في الوريد والدم رصد الأوكسجين

    ملاحظة: نحن تستخدم بشكل روتيني في الوريد الفخذي للتطبيق في الوريد من أحمر تكساس بدلا من الوريد الذيل. هذا هو بسبب حقن الوريد الفخذي توفير حقن البلعة آمنة وقابلة للتكرار للصباغة.

    1. تحويل الحيوانية على مدى جزئيا لفضح داخل الفخذ الأيسر. استخدم الشريط لتأمين حيوان في هذا الموقف.
    2. تطبيق فرك مطهر، ثم الإيثانول بنسبة 100٪ على الجلد.
    3. إجراء شق على طول الفخذ الإنسي من الركبة إلى الارتفاق العانة. لينة الأنسجة منفصلة من قبل تشريح حادة باستخدام ملاقط # 5.
    4. ملء محقنة 1ml مع 130 ميكرولتر من الأحمر تكساس (2.5 ملغ / مل). نعلق إبرة جديدة (قياس 30)، وثنيه بعناية على 30 درجة، والحفاظ على ما يصل شطبة. ملء واي إبرةال حل تكساس الأحمر.
    5. تحت المجهر تشريح، أدخل الإبرة في الوريد الفخذي وحقن 100 ميكرولتر من الأحمر ولاية تكساس. إزالة الإبرة، ثم اضغط برفق على المنوال مع الشاش لوقف النزيف.
    6. إغلاق الجلد باستخدام خياطة 4-0.
    7. للمراقبة المستمرة للمكتب التخطيط الاستراتيجي في الدم 2 (لضمان ما يكفي الأوكسجين في الدم) وضع مقياس التأكسج التحقيق في الفخذ الأيمن (من التي تم إزالتها من قبل الشعر).

    4. ثنائي الفوتون التصوير

    ملاحظة: نحن نستخدم Fluoview1000 أوليمبوس نظام التصوير multiphoton (مستقيم) مع الأطياف، الفيزياء MaiTai HP تي الفيمتو ثانية DeepSee: سا الليزر كمصدر للإثارة. للتصوير، ونحن نستخدم × 10 NA 0.45 (زايس C-لامزيغ)، أو 1.05 × 25 NA (أوليمبوس XLPlan N) أهداف مياه الغمر. نحن التقاط صور في 12 بت عمق في القرار 512 × 512 بكسل مع بكسل مدة بقاء من 2 ميكرو ثانية. نحن متحمسون بشكل متزامن NADH وتكساس الأحمر دكستران، في 740 نانومتر، وفلوريتم فصل escence من ضوء الإثارة باستخدام مرآة مزدوج اللون / القريبة من الأشعة تحت الحمراء للحظر الجمع بين مرشح (FF665-Di01؛ FF01-680/SP، Semrock، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) وتنقسم الى مجموعتين القنوات باستخدام مرآة مزدوج اللون (505DCXRU، كروما ، روكينجهام، VT، الولايات المتحدة الأمريكية)، وممر الموجة التي تمت تصفيتها (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). وكانت قوة الليزر قياس بعد الهدف 10-20 ميغاواط للتصوير في طبقة وأنا 20-50 ميغاواط للتصوير في الثانية طبقة.

    1. نقل الماوس على استعداد جراحيا للمرحلة المجهر. أخذ صورة أولية للموقع نافذة الجمجمة باستخدام مشرق الإضاءة في مجال التكبير 4X لاستخدامها كخريطة مرجعية للتسجيل مع تضخم أعلى اثنين من الفوتون angiographies.
    2. التكبير في مجال الاهتمام باستخدام × 10 تكبير. تحديد مساحة من الاهتمام في طبقات القشرة الأول أو الثاني (ما يصل إلى 150 ميكرون تحت سطح حنوني). إذا كان المطلوب تضخم أعلى، واستخدام × 25 هدف
    3. بدء تسجيل سلسلة زمنية (فيقوإعادة 2). نوصي باستخدام متوسط ​​من 3-5 إطارات لزيادة جودة الصورة.
    4. حث نقص الأكسجة بإضافة N2 50٪ إلى الهواء الذي يتنفس الحيوان. وهذا سيرفع مستوى O2 إلى 10٪. تحقق من نقص الأكسجة خلال رصد البيانات مقياس التأكسج.
    5. يستمر لتسجيل سلسلة زمنية من خلال نقص الأكسجة (على سبيل المثال، لمدة 30 ثانية)، وبعد استعادة مستوى عادي O2.
    6. جمع المعطيات اللازمة لحساب توزيع الأوكسجين عن طريق الكشف والقياس وقياس مجال اسطوانات الأنسجة نقص الأكسجة والاوكسيجين حول الأوعية الدموية.

    5. معالجة البيانات

    1. تحديد أسطوانة الأنسجة كروغ ر نصف قطرها ويمكن القيام بذلك يدويا (الشكل 3) عن طريق قياس المسافة بين مركز الأوعية الدموية والحدود التي تم الكشف عن ارتفاع NADH مضان.
    2. بدلا من ذلك، استخدم الحسابية محقق مستقل شبه الآلية تحديد دائرة نصف قطرها R الأنسجة اسطوانة والكحول المركزيةOD ص السفينة التي وصفت سابقا 1 في شكل تكميلي وتلخيصها في قسم مناقشة من هذا البروتوكول.
    3. تحديد منطقة من نقص الأكسجة باستخدام مفتوح الوصول لبرنامج تحليل الصور، على سبيل المثال يماغيج. للقيام بذلك، استخدم إشارة NADH، وتحديد عتبة أن يحدد كثافة عالية NADH المنطقة، ومن ثم قياس المنطقة مع ارتفاع مضان الأنسجة NADH.

    6. ممثل النتائج

    ويبين الشكل 2 شريط فيديو من NADH / تصوير الأوعية الصور خلال نقص الأكسجة عابرة (للاطلاع على نسخة PDF من هذا الشكل، وقد استخدمت اختيار الصور الثابتة). تم تخفيض تركيز الأكسجين مستوحاة من 21٪ إلى 10٪ لمدة 3 دقائق. هذا المستوى من نقص الأكسجة الناجم تجريبيا كافية لإحداث نقص الأكسجة الشديد في قشرة الدماغ. أدى نقص الأكسجة إلى زيادة في مضان NADH، في البداية في المناطق التي كانت أبعد من تدفق الدم في الشرايين. لاحظ النسيج NADH حادالحدود، والتي تمثل الحدود الأنسجة يمكن ملاحظتها من انتشار الأكسجين من دوران الأوعية الدقيقة القشرية. الصورة في ويبين الشكل 3 هندسة حدود انتشار الأوكسجين المحيطة الأوعية الدماغية. فمن الممكن أن نستنتج كروغ بأقطار أسطوانات من هذه الحدود، كما هو موضح سابقا 1.

    الشكل 1
    الشكل 1. (A) الفأر مع نافذة الجمجمة مستعدة للتصوير. (ب) من لوحة الأبعاد الرأس.

    الشكل 2
    الشكل 2. الذاتية NADH مخضر تصور مع اثنين من الفوتون التصوير من خلال نافذة في الجمجمة، ما يقرب من 50 ميكرومتر تحت سطح حنوني. الأوعية الدموية وتصور مع تكساس الأحمر ديكستران. وانخفض الأوكسجين في الهواء المستنشق إلى 10٪ لمدة 3 دقائق، ثم استعادته ل21٪. شريط الحجم: 50μm.

    <IMG ALT = "شكل 3" SRC = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" />
    الشكل 3. الهندسة الحدود مضان NADH. مخطط يبين حدود أصفر من نقص الأكسجة الوظيفية؛ الدوائر الزرقاء تظهر المتوقع المؤكسج (كروغ) اسطوانات. تظهر خطوط زرقاء كعبرة اسطوانة، تظهر الأرقام كعبرة في ميكرومتر.

    Discussion

    ارتفاع القرار المكانية معلومات حول انتشار الأوكسجين المهم لفهم كيفية تنظيم تدفق الدم في الدماغ لتوفير الأوكسجين إلى خلايا المخ، وتلبية الطلب الأيض. التقليدية قياسات الأكسجين البولاروجرافي باستخدام أقطاب الزجاج كلارك على غرار هي الغازية للغاية ويكون القرار المكانية منخفضة 2-3 و كبيرة (مجموعة 2) زمن الاستجابة. حتى الآن الدولة الوحيدة غير الغازية طريقة لقياس ص 2 في أنسجة المخ تروي تفسفر، حيث يبلغ معدل تسوس لجنة التحقيق متحمس يتناسب مع تركيز الأكسجين 4. هذه الطريقة توفر تركيزات الأكسجين دقيقة، ولكن يتطلب صبغة الملكية ومتطورة تقنيا التصوير عمر نظام تفسفر. هنا، نحن يبرهن على وجود بسيط، بساطة النهج الذي يمكن أن تجرى على نظام معيار التصوير ثنائي الفوتون مع قناتين flurescence. نهجنا يستفيد من إشارة الأنسجة الجوهرية 5 (أ)الثاني يتطلب سوى تصور مغاير للدوران الأوعية الدقيقة القشرية. نظرا للزيادة، غير الخطية الثنائية أساسا من مضان NADH في الحد من وظيفيا تركيزات الأكسجين زيادة جوهرية NADH مضان ويلاحظ فقط في المناطق التي توجد فيها نقص الأكسجة أيضي كبير، مما يحد. ملمحة المهم هو أن يتم ملاحظتها مباشرة الحدود الأنسجة من انتشار الأوكسجين من microvessels القشرية بسبب التغيرات شدة على شكل cylindrically من مضان NADH الذاتية. نشير إلى هذه الهياكل واسطوانات كروغ، لأنه تم عرض مفهوم هياكل على شكل cylindrically التي تحدد حجم الاوكسيجين من الأنسجة المحيطة بها وعاء دموي من قبل كروغ أغسطس ولقد تم في الآونة الأخيرة لوحظ تجريبيا باستخدام اثنين من الفوتون NADH التصوير 1. ويمكن جمع كروغ اسطوانات الصور في 3D من خلال اتخاذ Z-كومة من إطارات الصور. فهي بارزة خصوصا في المناطق القريبة من الشرايين اختراق وهم خفة دم مطابقح الشعرية المنضب محيط بالشرين الأنسجة اسطوانات 1،4.

    لتقديم تقرير موضوعي للR الأنسجة كروغ دائرة نصف قطرها أسطوانة (انظر القسم 5.2) ونحن على قياس كثافة بكسل شعاعي القيم داخل شريحة واضحة المعالم بين مركز الاسطوانة والحدود الخارجية باستخدام وظيفة مطلب "improfile". وينبغي اختيار الحدود الخارجية للقطاع لتمديد مع هامش أمان خارج حدود مرئية. لتحسين مستوى إشارة إلى الضجيج averageed نحن على جميع الخطوط الشعاعية اللازمة لتغطية الجزء المرئي الاسطوانة في الخطوات رقم 1. أظهر الناتج الملف متوسط ​​كثافة شعاعي داخل قطعة زيادة حادة والتي تتوافق مع R الأنسجة حدود واضحة. ونحن تناسب وظيفة السيني (على سبيل المثال بولتزمان وظيفة) إلى الوضع كثافة شعاعي المتوسط ​​وتستخدم نقطة انعطاف (المعروف أيضا باسم س 0) كتعريف للبحث. في المقابل 2-Pوكشفت hoton microangiography (تكساس الحمراء) في المقطع العرضي وعاء دموي مركزي الانفرادي في مركز الأسطوانة. ويمكن القطر من الأوعية الدموية المركزية تطبيقها مباشرة لتحديد ص.

    ثنائي الفوتون NADH التصوير يوفر نفس القرار المكانية والتصوير ذات الدقة العالية المتزامنة للmicroangiography القشرية. ميزة هامة لتطبيق الكمي لهذا الأسلوب هو أنه تم قياس ص 50 من الزيادة في مضان NADH أن يكون من 3.4 ± 0.6 ملم زئبق (1) والتي يمكن أن كثافة NADH مضان بوصفها وظيفة من الأنسجة microregional ص 2 صفها رياضيا مع وظيفة السيني. . نظهر أن هذا الأسلوب يسمح احد لتحديد مناطق الدماغ التي هي الأكثر عرضة لنقص الأكسجة (من خلال خفض محتوى الأوكسجين في الهواء الى 10٪). علينا أن نبين أن انتشار الأوكسجين يتبع نمط بسيط حول الوعاء هندسية.

    واحد الحرجةخطوة كال لهذا الأسلوب هو نوعية إعداد نافذة في الجمجمة. وينبغي لعملية جراحية إنتاج أضرار طفيفة حتى لا تعكر صفو تدفق الدم الى منطقة مكشوفة. والقلق هو أنه في التحضير للخطر جراحيا، والقشرة تحت النافذة قد تكون ميتة لتبدأ، ويحول دون أي تجارب ذات مغزى. وينبغي أن يكون نافذة معدة إعدادا جيدا في الجمجمة لديها سليمة الأوعية الدموية الرئيسية والثانوية مع تدفق الدم حية في جميع أنواع السفن وعدم وجود نزيف كبير على طول الحواف. في ظل ظروف normoxic (80-100 مم زئبق PaO2، ​​SP O2 97-99٪) وينبغي لحمة الدماغ يحمل موحد، ومضان NADH متجانس من دون واضح، والبقع الأنسجة مشرق مع مضان NADH مرتفعة.

    ويقتصر ومن بين القيود الأساسية المادية لنهجنا اختراق العمق. ومضان NADH الأخضر والأزرق في الدماغ هو الموهن بسرعة عن طريق امتصاص الهيموغلوبين والتشرذم في نسيج هذه الموجات. حتى مع فتحة عددية عالية (على سبيل المثال 1.05) للمياهأهداف غمر يقتصر حاليا اثنين من الفوتون NADH التصوير لأنني الطبقات القشرية والثاني. هذا القيد المختصة علميا لاستقلاب الطاقة في أو في القرب من المادة البيضاء سوف تختلف على الأرجح من المادة الرمادية. ومع ذلك، فإن التحقيق في الهياكل القشرية العميقة مثل السادس الى الرابع طبقات أو هياكل تحت القشرية مثل مساحات المادة البيضاء أو المخطط وتتطلب استخدام microlenses المتخصصة كما هو موضح في قشرة الماوس في الجسم الحي 6.

    يمكن NADH مقرها قياس حدود انتشار الأوكسجين تكون مفيدة خصوصا عندما يقترن قياسات أخرى مثل تحليلات تبيغ وظيفي، والكشف عن معدلات تدفق شعري 7. على سبيل المثال، يمكن تكييف هذه التقنية لتصور نقص الأكسجة في السكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) نماذج. هندسة بسيطة من انتشار الأوكسجين يسمح لأحد أن يتنبأ التدرج الأوكسجين في سرير الاوعية الدموية الدقيقة تحت الظروف التي تكون فيها كثافة الشعيرات الدموية هي ديمجعد 8 (على سبيل المثال، م 9)، وإلى دراسة ما إذا كانت مناطق أنسجة المخ مع انخفاض الكثافة الشعرية هي في خطر متزايد للتلف بسبب نقص الأكسجة microstrokes. القدرة على صورة microregionally يسمح أيضا واحدة لدراسة الهندسة وحجم microstrokes الأنسجة وتحديد حجم الأنسجة التي يحدث نقص الأكسجة، وكذلك العلاقة بين نقص الأكسجة الأنسجة وموت الخلايا العصبية اللاحقة أو إعادة عرض شعري 10.

    أخيرا، منذ زيادات في مضان NADH الذاتية هي نتيجة مباشرة لضعف الميتوكوندريا الحادة، وهذا الأسلوب يخلق الفرصة لاستخدام NADH التصوير كمراسلة محددة لاستقلاب الطاقة العصبية 11 وكيل لضعف الميتوكوندريا.

    في الختام، واثنين من الفوتون التصوير من مضان NADH الذاتية هو بسيط، وأداة المتساهلة التي يمكن استخدامها لفهم تسليم الأوكسجين والاستهلاك في الدماغ على حد سواء تحت العاديوفي الولايات مرضية.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgements

    نشكر الدكتور Maiken مايكين (جامعة روتشستر المركز الطبي) لتصميم الرأس لوحة. وقد تم دعم العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الجوائز إلى SD (R01DA026325 وP30AI078498 والمنح الأساس لKK (دانا أساس الدماغ وبرنامج Immunoimaging، جمعية القلب الأميركية 0635595T ورابطة ALS [# 1112)]).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Heating pads Beyond Bodi Heat
    Ophthalmic ointment (Artificial tears) Pfizer Pharma GmbH
    Povidone-iodine 10% solution Betadine Puredue Pharma
    Ferric chloride 10% solution
    Cement Stoelting Co. 51456

    Cyanoacrylate 454

    Loctite

    aCSF Harvard Apparatus 597316
    Microtorque II handpiece kit Pearson Assessments R14-0002
    IRF 007 drill bits Fine Science Tools 19008-07
    Forceps #5 Fine Science Tools 11295
    Forceps #5/45 Fine Science Tools 11251-35
    #0 glass coverslip Electron Microscopy Sciences 63750-01
    Photomultiplier tube Hamamatsu Corp. HC125-02
    Ti:Sapphire laser Mai-Tai Newport Corp.

    References

    1. Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
    2. Ndubuizu, O., LaManna, J. C. Brain tissue oxygen concentration measurements. Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).
    3. Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
    4. Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
    5. Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
    6. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
    7. Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
    8. de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
    9. Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
    10. Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter