Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

1. Preparação da cultura de Agrobacterium

1. Agrobacterium cepa GV3101 previamente transformadas com a Gateway compatível BiFC vector pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-SN, cada um contendo uma fusão construção de GI.
2. Inocular a 5 ml YEB cultura (5g L extrato de carne ^-1, 1g L ^-1 extrato de levedura, 5g L ^-1 de peptona, 5g L ^{-1 de} sacarose, 2 mM MgSO _4, pH 7,2) de proteína de fusão BiFC construções transformou Agrobacterium com o seleção antibiótico adequado. Crescer a cultura durante a noite a 28 ° C agitação a 200 rpm.
3. Retire 1 ml da cultura em um tubo de centrifugação estéril de 1,5 ml.
4. Células de pelotas em 1000 g por 10 min em temperatura ambiente, elimine o sobrenadante.
5. Lave o pellet, adicionando 1 ml de mídia infiltração (5 g L ^-1 D-glicose, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na ₃ PO _4, 0,1 mM acetosyringone) ^11. Ressuspender pellet por pipetagem, as células pellet novamente em 1000 g por 10 min.
6. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes.
7. Ressuspender o sedimento em 0,5 ml de mídia infiltração.
8. Medir a absorvância a 600 nm e ajuste final de OD _600-1,0 para 1,2.
9. Alíquota de uma quantidade igual de suspensão de Agrobacterium de cada construção em um tubo ml novo 1.5, vortex por 10 seg. Para uma infiltração única, de 100 L de cada construção é mais do que suficiente.
10. A mistura Agrobacterium está agora pronto para a infiltração.

2. Infiltração

11. N. benthamiana plantas são cultivadas a 21 ° C, com 16 h de luz e 8 h-ciclos escuros. Cinco para as plantas de seis semanas de idade devem ser usadas para a infiltração.
12. Remover as plantas da sala de crescimento e colocar sob a luz branca para 1 h antes infiltratring permitindo que os estômatos de abrir totalmente.
13. Elaborar mistura Agrobacterium ressuspendidos em 1 ml seringa de deslizamento de ponta sem a agulha.
14. Coloque a ponta da seringa contra a parte inferior da folha e suavemente o êmbolo, enquanto apoiando diretamente a parte superior da folha com um dedo. O líquido se difunde através da folha, uma vez que preenche os espaços de ar mesophyllar.
15. Rótulo da área infiltrada com uma caneta marcador para identificação futura.
16. Quando se infiltrar com construções diferentes, certifique-se que quer mudar suas luvas ou limpá-las com álcool a 70% entre infiltrações. Se possível, deixe um espaço nervura central entre as amostras diferentes para evitar a contaminação cruzada.
17. Coloque plantas em uma câmara de crescimento sob condições de crescimento normal.

3. Observação do sinal YFP reconstituído

18. Consumo de um segmento x 5mm 5mm de tecido foliar no interior da zona infiltrada
19. Montagem da amostra, em água, em uma lâmina de vidro, cubra a amostra com uma lamínula e examinar as interações usando um microscópio confocal ou fluorescência.
20. Expressão deve ser monitorada a cada 24 horas desde o momento da infiltração de até 5 dias mais tarde, como sobre a expressão / tráfico pode resultar em proteínas de fusão fluorescentes exibindo vários locais diferentes ao longo de um curso de tempo.

4. Resultados representativos:

Um exemplo de interação proteína-proteína testada por ensaio BiFC é mostrado na Figura 1. AtTHP1 e AtSAC3A Acredita-se que os componentes da Arabidopsis homólogo de levedura TREX-2 complexos. Eles podem interagir com um AtNUP1 nuclearporin e facilitar a exportação de mRNA ^10. AtTHP1 e AtSAC3A foram clonados em pEarlyGate201-YC enquanto AtNUP1 foi clonado em pEarlyGate202-SN. Os construtos foram posteriormente transformadas em GV3101. As três construções foram pareados com 3 combinações possíveis (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) para infiltração. O sinal YFP reconstituído foi observado sob uma LCSM 48 horas após a infiltração. Os sinais foram observados nas células epidérmicas e localizadas na periferia nuclear ou plasma nuclear, o que é consistente com a localização sub-celular destas proteínas. Os controles negativos não mostraram qualquer sinal YFP.

Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componentes mRNA exportação complexo interagem uns com os outros. N. benthamiana folhas, co-transformada com construções de GOI fundido a pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-SN (como indicado), foram fotografadas 48-72 h após a infiltração, usando um microscópio Leica TCS SP2 confocol. Imagens são mostradas como YFP confocal fundidas e brilhantes de campo imagens da epiderme N. células benthamiana folha

Ensaio BiFC é uma ferramenta poderosa para estudar interações protéicas. Ao contrário do ensaio Y2H tradicional, BiFC não só permite a visualização de interações proteína-proteína, mas também fornece mais informações do complexo de proteínas, como sub-celular de localização. Além disso, é possível detectar interações indiretas, desde que as duas proteínas candidato pode ser trazido perto o suficiente por um terceiro parceiro. Como qualquer tecnologia, BiFC tem suas limitações. Devido a necessidade de oxigênio molecular para a formação de fluoróforo, BiFC não pode ser usado em anaeróbios obrigatórios, que não pode sobreviver na presença de oxigênio. Isso limita o uso de BiFC para organismos aeróbios ^6. A formação de complexos fluoróforo é irreversível. Isso evita que as proteínas de interagir com os outros e podem interromper a associação e dissociação dos complexos de proteína em equilíbrio dinâmico ^6. No entanto, essa irreversibilidade também nos permite visualizar interações fracas ou de trânsito. Fragmentos de proteínas fluorescentes têm uma capacidade limitada para associar independente das proteínas a que são fundidos. Deve-se fornecer os controles necessários e numerosas para distinguir entre as interações de proteína verdadeira e falso-positivos ^6. Além disso, como a reconstituição fluoróforo pode ocorrer a uma distância de 7Nm ou mais, de complementação de fluorescência podem indicar tanto uma interação direta ou indireta. É preciso usar outros métodos, como Y2H ou Co-imunoprecipitação para testar a relação de interação exata ^7.

A fim de gerar dados confiáveis, controles apropriados devem ser utilizados para a interpretação dos resultados. Os vetores vazia não deve ser usado diretamente como controles uma vez que contêm o fragmento de gateway típica entre attr1 e attr2 cassetes. Assim, esses vetores vazios não são realmente "vazio". Para ultrapassar este problema, geralmente usamos um par de proteínas não relacionadas fundida ao vetores como controle. Outro problema potencial é a auto-fluorescência das células vegetais, especialmente de plantas velhas ou estressado. Pesquisadores inexperientes deve primeiro olhar para uma amostra da zona de uninfiltrated para se familiarizar com o fundo fluorescente.

Recentemente, métodos mais BiFC baseados foram desenvolvidos para ampliar ainda mais as aplicações do ensaio BiFC a vários aspectos de proteínas, RNA-proteína interações ^12, e hibridização de DNA ^13. Por exemplo, multicolor e BiFC BiFC baseado FRET (BiFC-FRET) de análise têm sido desenvolvidos para identificar e visualizar complexos ternários em células vivas ^14.

A combinação de Gateway e BiFC é uma ferramenta poderosa para os pesquisadores que procuram entender as interações de proteínas em células intactas. As construções usadas no nosso sistema BiFC também pode ser usado para gerar plantas transgênicas estável para visualizar interações proteína mais dinâmico em diferentes tecidos e em vários estágios de desenvolvimento que não podem ser observados no sistema de expressão transiente. Nós incorporamos uma tag HA e uma etiqueta FLAG em nosso vetores BiFC (pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-SN), respectivamente. Esta modificação torna possível para várias aplicações, tais como a jusante western blotting, Co-imunoprecipitação e purificação de afinidade, etc, após a visualização das interações.