Detektion av protein interaktioner i Plant använder gateway Kompatibel komplettering Bimolecular Fluorescence (BiFC) System

1. Beredning av Agrobacterium kultur

1. Agrobacterium stam GV3101 förvandlas tidigare med Gateway kompatibel BiFC vektor pEarleyGate201-YC och pEarleyGate202-yn, var och en innehåller en blandning konstruktion av Indiens myndigheter.
2. Inokulera en 5-ml Yeb (5g L ^-1 Nötkött extrakt, 1g L ^-1 jästextrakt, 5g L ^-1 Peptone, 5g L ^-1 Sackaros, 2mm MgSO _4, pH 7,2) kultur BiFC fusionsprotein konstruerar förvandlas Agrobacterium med lämplig antibiotika val. Odla kulturen över natten vid 28 ° C skaka vid 200 rpm.
3. Ta 1 ml av kulturen i en steril 1,5 ml centrifugrör.
4. Pellets celler vid 1000 g under 10 minuter vid rumstemperatur, kassera supernatanten.
5. Tvätta pelleten genom att tillsätta 1 ml infiltration media (5 g L ^-1 D-glukos, 50 mm MES (Sigma), 2 mM Na ₃ PO _4, 0,1 mM acetosyringone) ^11. Resuspendera pellet genom att pipettera, pellets cellerna igen vid 1000 gi 10 min.
6. Upprepa tvättningen två gånger till.
7. Återsuspendera pelleten i 0,5 media ml infiltration.
8. Mät absorbansen vid 600 nm och justera sista OD ₆₀₀ till 1,0 to 1.2.
9. Fördela en lika stor mängd Agrobacterium upphängning för varje bygga in i ett nytt 1,5 ml rör, vortex i 10 sek. För en enda infiltration är 100 mikroliter av varje bygga mer än tillräckligt.
10. Den Agrobacterium blandningen är nu redo för infiltration.

2. Infiltration

11. N. benthamiana växter som odlas vid 21 ° C, med 16-timmar ljus och 8-timmars mörker cykler. Fem till sex veckor gamla växter bör användas för infiltration.
12. Ta bort växter från tillväxt rum och plats under vitt ljus i 1 tim innan infiltratring låta klyvöppningarna till helt öppen.
13. Upprätta återsuspenderade Agrobacterium blandningen i en 1-ml-slip-spets tuberkulin spruta utan nål.
14. Placera toppen av injektionssprutan mot undersidan av bladen och försiktigt pressa kolven samtidigt som direkt stöder den övre sidan av bladet med ett finger. Vätskan kommer att spridas genom bladet så det fyller mesophyllar luftrum.
15. Märk infiltrerade området med en tuschpenna för framtida identifiering.
16. När infiltrera med olika konstruktioner, se till att antingen byta handskar eller rengöra dem med 70% etanol mellan infiltreringar. Om möjligt, lämna en HUVUDNERV utrymme mellan olika prover för att förhindra korskontaminering.
17. Placera växterna i en tillväxt skåp under normala odlingsbetingelser.

3. Observation av den rekonstituerade YFP signalen

18. Punktskatter en 5 mm x 5 mm segment av bladvävnad inom infiltrerat zonen
19. Montera prov, i vatten, på ett glas objektglas, täck över provet med ett täckglas och undersöka samspelet med hjälp av en konfokala eller fluorescensmikroskop.
20. Uttrycket bör kontrolleras var 24 timmar från det att infiltrationen upp till 5 dagar senare som över uttryck / människohandel kan resultera i fluorescerande fusionsproteiner visa flera olika platser under en tidsperiod.

4. Representativa resultat:

Ett exempel på protein-protein växelverkan testade av BiFC-analysen visas i figur 1. AtTHP1 och AtSAC3A tros vara delar av Arabidopsis homolog av jäst TREX-2 komplex. De kan interagera med en nuclearporin AtNUP1 och underlätta mRNA exporteras ^10. AtTHP1 och AtSAC3A var klonade in pEarlyGate201-YC medan AtNUP1 var klonade in pEarlyGate202-yn. De konstruerar därefter förvandlades till GV3101. De tre konstruktioner var paras ihop med 3 möjliga kombinationer (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) för infiltration. Den rekonstituerade YFP signalen observerades under ett LCSM 48 timmar efter infiltration. De signaler som observerades i epidermala celler och lokaliserade i de nukleära periferin eller kärnvapen plasma, vilket överensstämmer med sub-cellulära lokalisering av dessa proteiner. De negativa kontrollerna visade ingen YFP signal.

Figur 1. Arabidopsis TREX-2 mRNA export komplexa komponenter interagerar med varandra. N. benthamiana löv, tillsammans förvandlas med konstruktioner av Indiens smält till pEarleyGate201-YC och pEarleyGate202-YN (som anges), var avbildas 48-72 h efter infiltration, med hjälp av en Leica TCS SP2 confocol mikroskop. Bilderna visas som slås samman konfokala YFP och ljus-fält bilder av epidermala N. benthamiana blad celler

BiFC-analysen är ett kraftfullt verktyg för att studera protein interaktioner. Till skillnad från den traditionella Y2H analysen BiFC inte bara tillåter visualisering av protein-protein växelverkan, men ger också mer information om proteinkomplex som sub-cellulära lokalisering. Dessutom är det möjligt att upptäcka indirekt interaktion så länge som de två kandidaten proteiner kan föras tillräckligt nära med en tredje partner. Precis som alla teknik, har BiFC sina begränsningar. På grund av kravet på molekylärt syre för fluoroforen bildning, kan BiFC inte användas i obligat anaeroba bakterier, som inte kan överleva i närvaro av syre. Detta begränsar användningen av BiFC att aeroba organismer ^6. Bildandet av fluoroforen komplex är oåterkallelig. Detta förhindrar att proteiner från samspela med andra och kan störa föreningen och avståndstagande av protein komplex i dynamisk jämvikt ^6. Men gör detta irreversibilitet oss också att visualisera svaga eller transitering interaktioner. Fluorescerande proteinet fragment har en begränsad förmåga att associera oberoende av de proteiner som de är smält. Man måste tillhandahålla nödvändiga och många kontroller att skilja mellan sant och falskt positiva proteininteraktioner ^6. Också, som fluoroforen beredning kan uppstå på ett avstånd av 7nm eller mer, kan fluorescens komplettering tyda på antingen direkt eller indirekt interaktion. Man måste använda andra metoder såsom Y2H eller Co-Immunoprecipitation att testa exakt interaktionsvillkor ^7.

För att generera tillförlitliga uppgifter, bör korrekta kontroller användas för tolkning av resultaten. Den tomma vektorer bör inte direkt användas som kontroller som de innehåller den typiska gateway fragment mellan attR1 och attR2 kassetter. Således är dessa tomma vektorer egentligen inte är "tomma". För att lösa detta problem använder vi vanligtvis ett par oberoende proteiner smält till vektorer som en kontroll. Ett annat potentiellt problem är auto-fluorescerar från växtceller, speciellt från gamla eller stressade växter. Oerfarna utredare ska först titta på ett prov från uninfiltrated zonen att bekanta sig med bakgrunden fluorescerar.

Nyligen har mer BiFC-baserade metoder utvecklats för att ytterligare utöka tillämpningar av BiFC analys för olika aspekter av proteiner, RNA-protein växelverkan ^12, och DNA-hybridisering ^13. Till exempel, flerfärgad BiFC och BiFC-baserade FRET (BiFC-FRET assay) har utvecklats för att identifiera och visualisera ternära komplex i levande celler ^14.

Kombinationen av Gateway och BiFC är ett kraftfullt verktyg för forskare som vill förstå protein interaktioner i intakta celler. De konstruktioner som används i våra BiFC Systemet kan också användas för att generera stabila transgena växter att visualisera mer dynamisk protein interaktioner i olika vävnader och vid olika utvecklingsstadier som kanske inte observeras övergående uttryck system. Vi har bildat en HA-tagg och en flagga tagg i vår BiFC vektorer (pEarleyGate201-YC och pEarleyGate202-YN), respektive. Denna ändring gör det möjligt för olika nedströms applikationer såsom Western blotting, Co-Immunoprecipitation och samhörighet rening, osv, efter visualisering av interaktioner.