Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

1. Preparazione della cultura Agrobacterium

1. Tumefaciens ceppo GV3101 precedentemente trasformato compatibile con BiFC Gateway vettore pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN, ciascuno contenente una fusione costrutto di governo indiano.
2. Inoculare un 5-ml YEB (5g L estratto di manzo ^-1, 1g L estratto di lievito ^-1, 5 g L ^-1 peptone, 5g L Saccarosio ^-1, 2mM MgSO _4, pH 7,2) cultura della proteina di fusione BiFC costruisce trasformato con l'Agrobacterium selezione appropriato di antibiotici. Crescere la cultura notte a 28 ° C in agitazione a 200 rpm.
3. Togliere 1 ml di coltura in una provetta sterile 1,5 ml centrifuga.
4. Cellule pellet a 1.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante.
5. Lavare il pellet con l'aggiunta di 1 ml di infiltrazione dei media (5 g L ^-1 D-glucosio, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na ₃ PO _4, 0,1 mM acetosyringone) ^11. Risospendere le sfere pipettando, le cellule pellet di nuovo a 1.000 g per 10 min.
6. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
7. Risospendere il pellet in media da 0,5 ml infiltrazione.
8. Misurare l'assorbanza a 600 nm e regolare finale OD _600-1,0 a 1,2.
9. Aliquota una quantità uguale di sospensione Agrobacterium di ogni costruzione in un nuovo tubo di 1,5 ml, vortex per 10 sec. Per una infiltrazione singole, 100 ml di ogni costrutto è più che sufficiente.
10. La miscela Agrobacterium è ora pronto per l'infiltrazione.

2. Infiltrazione

11. N. benthamiana piante sono coltivate a 21 ° C, con 16-ore di luce e 8-h cicli di buio. Cinque gli impianti di sei settimane di età dovrebbero essere usati per l'infiltrazione.
12. Rimuovere le piante dalla camera di crescita e di luogo in luce bianca per 1 ora prima infiltratring permettendo stomi per aprire completamente.
13. Elaborare risospeso miscela Agrobacterium in un 1 ml slip-siringa senza ago tubercolina.
14. Posizionare la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia e delicatamente spingere il pistone mentre direttamente a sostegno della parte superiore della foglia con un dito. Il liquido si diffonderà attraverso la foglia come si riempie gli spazi d'aria mesophyllar.
15. Etichetta la zona infiltrata con un pennarello per l'identificazione futuro.
16. Per infiltrarsi con diversi costrutti, assicuratevi di cambiare sia i guanti o pulirli con etanolo al 70% tra le infiltrazioni. Se possibile, lasciare uno spazio nervatura centrale tra campioni diversi per evitare la contaminazione crociata.
17. Posizionare le piante in un armadio di crescita in condizioni di crescita normale.

3. Osservazione del segnale YFP ricostituito

18. Accise un segmento di 5mm x 5mm di tessuto di foglie all'interno della zona infiltrata
19. Montare il campione, in acqua, su un vetrino di vetro, coprire il campione con un coprioggetto ed esaminare le interazioni con un microscopio confocale o fluorescenza.
20. Espressione deve essere monitorata ogni 24 ore dal momento di infiltrazione fino a 5 giorni dopo, come sopra espressione / traffico può comportare la visualizzazione di proteine ​​di fusione fluorescenti diversi luoghi nel corso del tempo.

4. Rappresentante dei risultati:

Un esempio di interazione proteina-proteina testato mediante test BiFC è illustrato nella figura 1. AtTHP1 e AtSAC3A si ritiene siano componenti della Arabidopsis omologo di lievito TREX-2 complessi. Possono interagire con un AtNUP1 nuclearporin e facilitare l'esportazione mRNA ^10. AtTHP1 e AtSAC3A sono stati clonati in pEarlyGate201-YC mentre AtNUP1 è stato clonato in pEarlyGate202-YN. I costrutti sono stati successivamente trasformati in GV3101. I tre costrutti sono stati appaiati con 3 possibili combinazioni (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) per l'infiltrazione. Il segnale ricostituito YFP è stata osservata sotto un LCSM 48 ore dopo l'infiltrazione. I segnali sono state osservate nelle cellule epidermiche e localizzato nella periferia nucleare o al plasma nucleare, che è coerente con la localizzazione sub-cellulare di queste proteine. I controlli negativi non hanno mostrato alcun segnale YFP.

Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componenti esportazione mRNA complesso interagire tra loro. N. benthamiana foglie, co-trasformato con costrutti del GOI fusa pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN (come indicato), hanno ripreso 48-72 ore dopo l'infiltrazione, utilizzando un microscopio Leica TCS SP2 confocol. Le immagini sono mostrate come fusi YFP confocale e luminose immagini a campo di epidermica N. benthamiana foglia cellule

Saggio BiFC è un potente strumento per studiare le interazioni delle proteine. A differenza del tradizionale test Y2H, BiFC non solo permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina, ma fornisce anche ulteriori informazioni del complesso proteico come la localizzazione sub-cellulare. Inoltre, è possibile rilevare le interazioni indirette finché le due proteine ​​candidato può essere portato abbastanza vicino da un terzo partner. Come ogni tecnologia, BiFC ha i suoi limiti. A causa della necessità di ossigeno molecolare per la formazione fluoroforo, BiFC non può essere utilizzato in anaerobi obbligati, che non può sopravvivere in presenza di ossigeno. Questo limita l'uso di BiFC per gli organismi aerobici ^6. La formazione del complesso fluoroforo è irreversibile. Questo impedisce che le proteine ​​di interagire con gli altri e può disturbare l'associazione e dissociazione dei complessi proteici in equilibrio dinamico ^6. Tuttavia, questa irreversibilità ci permette anche di visualizzare le interazioni deboli o di transito. Frammenti di proteine ​​fluorescenti hanno una limitata capacità di associare indipendente delle proteine ​​a cui si sono fusi. Si deve fornire i necessari controlli e numerosi di distinguere tra le interazioni proteina vero e falso-positivi ^6. Inoltre, come la ricostituzione fluoroforo può avvenire ad una distanza di 7nm o più, complementazione fluorescenza può indicare sia una interazione diretta o indiretta. Uno ha bisogno di utilizzare altri metodi come Y2H o Co-Immunoprecipitazione per testare l'esatta relazione interazione ^7.

Al fine di produrre dati affidabili, adeguati controlli devono essere utilizzati per l'interpretazione dei risultati. I vettori vuota non dovrebbe essere direttamente utilizzati come controlli in quanto contengono il frammento tipico gateway tra attr1 e attr2 cassette. Così, questi vettori vuoti non sono veramente "vuoto". Per superare questo problema, in genere usiamo un paio di proteine ​​non correlate fuse ai vettori come controllo. Un altro potenziale problema è l'auto-fluorescenza dalle cellule vegetali, in particolare da impianti vecchi o stressato. Investigatori inesperto deve anzitutto esaminare un campione dalla zona uninfiltrated per acquisire familiarità con lo sfondo fluorescenza.

Recentemente, i metodi più BiFC basati sono stati sviluppati per estendere ulteriormente le applicazioni del test BiFC a vari aspetti delle proteine, le interazioni RNA-proteina ^12, e l'ibridazione del DNA ^13. Per esempio, multicolor BiFC e BiFC a base di FRET (BiFC-FRET) test sono stati sviluppati per identificare e visualizzare i complessi ternari nelle cellule viventi ^14.

La combinazione di gateway e BiFC è un potente strumento per i ricercatori cercano di comprendere le interazioni delle proteine ​​in cellule intatte. I costrutti utilizzati nel nostro sistema BiFC può anche essere usato per generare stabile piante transgeniche per la visualizzazione delle interazioni proteina più dinamico in tessuti differenti e in vari stadi di sviluppo che non può essere osservato nel sistema di espressione transiente. Abbiamo inserito un tag HA e un tag FLAG nei nostri vettori BiFC (pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN), rispettivamente. Questa modifica rende possibile per varie applicazioni a valle, come western blotting, Co-Immunoprecipitazione e purificazione di affinità, ecc, dopo la visualizzazione delle interazioni.