Détection directe de l'activité Acétate de formation de l'acétate kinase Enzyme

Le schéma d'ensemble de ce protocole est présenté dans la figure 1.

1. Préparation de la solution pour les courbes d'étalonnage et dosages

1. Préparer 100 ml d'une 2 mol / L solution d'hydroxylamine-HCl. Peser 13,9 g de chlorhydrate d'hydroxylamine (MW 69.49 g / mol) et dissoudre dans environ 50 ml d'eau distillée-eau déminéralisée (FD ₂ O). Ajuster le pH à 7,0 à l'aide des pastilles d'hydroxyde de potassium ou une solution concentrée. Amener le volume final de 100 ml. La solution peut être conservée à température ambiante pendant jusqu'à 30 jours ou moins 4 ° C pendant jusqu'à 90 jours.
2. Préparer 100 ml de chlorure ferrique / solution d'acide chlorhydrique. Peser 13,5 g de chlorure ferrique (MW 270.32 g / mol) et dissoudre dans environ 50 ml ddH ₂ O. Ajouter 41,3 ml d'acide chlorhydrique concentré (12,1 mol / L) et porter à un volume final de 100 ml. La concentration finale de chlorure ferrique sera de 0,5 mol / L et la concentration finale d'acide chlorhydrique sera de 5 mol/ L. La solution est stockée à température ambiante.
3. Préparer 100 ml d'un 1,84 mol / L de solution d'acide trichoroacetic. Peser 30,0 g d'acide trichloracétique (MW 163.39 g / mol), dissoudre dans le trou DDH ₂ O et porter le volume final de 100 ml. La solution est stockée à température ambiante.
4. Préparer 5 ml d'une 0,1 mol / L solution de phosphate acétyle. Peser 0,092 g de phosphate acétyle (MW 184.06 g / mol), dissoudre dans le trou DDH ₂ O et porter le volume final de 5 ml. Aliquoter la solution à microtubes (0,25 ml par tube) et congeler à -20 ° C jusqu'à utilisation. Solution décongelés doivent être placés sur la glace et peut être utilisé pendant environ 1 heure. Solution de phosphate acétyle qui a été décongelé ne doit pas être recongelé et réutilisés.
5. Préparer 5 ml d'une 0,1 mol / L de solution d'ADP. Peser 0,24 g d'ADP (MW 472.5 g / mol), dissoudre dans le trou DDH ₂ O, et porter le volume final de 5 ml. Aliquoter la solution dans des microtubes (0,5 ml par tube) et congeler à -20 ° C jusqu'àutilisation. Conserver la solution décongelée sur la glace jusqu'à utilisation.
6. Préparer 50 ml d'une 1 mol / L solution de Tris. Peser 6,06 g de Tris (MW 121.14 g / mol), et dissoudre dans 40 ml ddH ₂ O. Ajuster le pH de la solution à 7,0 à l'aide d'acide chlorhydrique et porter le volume final de 50 ml. Conserver la solution à température ambiante.
7. Préparer 10 ml d'une 1 mol / L de solution de chlorure de magnésium. Peser 2,03 g de chlorure de magnésium (MW 203.31 g / mol), dissoudre dans le trou DDH ₂ O, et amener le volume final à 10 ml. Conserver la solution à température ambiante.
8. Préparer 25 ml solution de développement en mélangeant des volumes égaux de la solution acide de chlorure / ferrique chlorhydrique et la solution d'acide trichloracétique. Solution de développement doit être préparé chaque jour et stockés à température ambiante.

2. Préparation d'un courbe standard de phosphate acétyle

1. Une courbe de phosphate acétyl standard est généré en utilisant des quantités connues de phosphate acétyle. Une courbe standard de six à eighpoints de t est approprié. Les normes devraient varier de 0,03 à 0,9 micromoles micromoles pour 300 uL, ce qui correspond à des concentrations finales de 0,1 à 3 mmol / L. Diluer la solution de phosphate acétyl achat d'actions à des concentrations appropriées dans 100 mM Tris solution dans un volume final de 300 ul. Un échantillon témoin sans phosphate acétyl devrait également être préparée.
2. Incuber chaque norme et le contrôle à 37 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 minute.
3. Ajouter 50 uL de la solution de chlorhydrate d'hydroxylamine à chaque norme et le contrôle et mélanger en secouant trois fois. Placez la norme dans un bloc de 60 ° C chaleur et incuber pendant cinq minutes.
4. Ajouter 100 pi de solution de développement aux normes et le contrôle, mélanger en secouant trois fois, et permettre de développer de couleur d'au moins une minute à température ambiante.
5. Centrifugeuse à toutes les normes et le contrôle dans une microcentrifugeuse à 18.000 xg pendant 1 minute.
6. Mesurer les échantillons par spectrophotométrie unet 540 nm en utilisant 1ml cuvettes en plastique, en utilisant la commande comme le blanc pour la spectrophotométrie.
7. Générer une courbe standard en utilisant une analyse appropriée des données et des logiciels graphiques (par exemple Kaleidagraph Synergie de logiciels). Valeurs de R ² de 0,99 ou plus sont souhaitables. Les données sont tracées comme l'absorbance à 540 nm par rapport pmoles de phosphate présents acétyle.

3. Dosage de l'activité kinase Acétate

1. En utilisant les solutions décrites, préparer un mélange réactionnel contenant une concentration finale de 0,1 tampon mol / L Tris, 10 mmol / L de chlorure de magnésium, 5 mmol / L d'ADP, et 2 mmol / L de phosphate acétyle. Un mélange de 10 ml de réaction, il faudra 8,2 ml ddH ₂ O, 1,0 ml de Tris solution, 0,1 ml de solution de chlorure de magnésium, 0,5 mL d'ADP solution, et 0,2 ml solution de phosphate acétyle. Distribuer le mélange réactionnel dans 300 aliquotes de microtubes. Pour la détermination des paramètres cinétiques et optimisation des concentrations de substrat, un substrat peut êtrevariées, et l'autre a tenu à une concentration constante dans les réactions.
2. Pré-incuber les réactions pendant 1 minute à 37 ° C dans un bloc thermique.
3. Ajouter la quantité désirée de l'enzyme à la réaction et de retourner immédiatement le tube dans le bloc 37 ° C chaleur. Inclure également une réaction de contrôle à laquelle aucune enzyme est ajoutée. Si plusieurs réactions sont effectuées, ajouter enzyme pour les tubes à intervalles de temps spécifiques. Soyez sûr de garder trace du temps. (REMARQUE: La quantité d'enzyme pour être utilisé devra être optimisé afin de garantir que tous les phosphates acétyle ou substrat ADP ne sera pas épuisé - voir la section Discussion)
4. Après 5 minutes, ajouter 50 pl de la solution de chlorhydrate d'hydroxylamine à chaque réaction et le contrôle, mélanger, et placer les tubes dans un bloc de 60 ° C chaleur. Si plusieurs réactions sont effectuées, ce qui devrait être fait au même intervalle de temps que l'enzyme a été ajouté.
5. Incuber les réactions et le contrôle pendant 5 minutes à 60 ° C.
6. Ajouter 100 μ L de la solution de développement à chaque réaction et le contrôle, mélanger, et placer dans un rack tube sur la paillasse. Autoriser coloration se développer pendant au moins 1 minute.
7. Centrifuger tous les tubes dans une microcentrifugeuse à 18.000 xg pendant 1 minute.
8. Mesure des échantillons par spectrophotométrie à 540 nm en utilisant 1ml cuvettes en plastique et de déterminer la quantité de phosphates présents acétyl par comparaison à la courbe standard de phosphate acétyle.
9. La quantité de substrat de phosphate acétyl appauvri peut être déterminé en soustrayant la quantité de phosphate acétyl restant après la réaction enzymatique à partir de la quantité de phosphate présent dans l'acétyl l'enzyme de contrôle manquent. Effectuer l'analyse de données en utilisant les données et les logiciels appropriés graphique (par exemple Kaleidagraph Synergie de logiciels). R ² des valeurs supérieures à 0,97 sont souhaitables.

4. Les résultats représentatifs:

Le but de ce test est de mesurer l'activité kinase de l'acétate dans la directeion de la formation d'acétate. Ceci est fait en mesurant la consommation du substrat de phosphate acétyle, car il n'ya pas facile, la mesure directe de la production d'acétate. Phosphate de Acétyl restant après un temps donné lors de la réaction enzymatique est converti en hydroxamate acétyl et par la suite au complexe hydroxamate ferrique, qui a une couleur rougeâtre (figure 2) qui peut être mesurée à 540 nm. La courbe standard comploter absorbance en fonction actuelle micromoles de phosphate acétyle dans les normes est utilisé pour déterminer la quantité de phosphate acétyl restant dans chaque réaction. La courbe standard doit être linéaire par le point zéro. Une courbe représentant la norme montre la figure 3 a une pente de 1,2332 unités d'absorbance par du phosphate présents pmole acétyle et une ^valeur R2 de 0,99, indiquant les données de l'équation linéaire s'adapte bien. L'équation de la forme linéaire à la courbe standard de données est utilisée pour calculer la quantité de phosphate acétyl restant dans la réaction. Le micromolesde phosphate acétyl consommée est déterminée comme étant la différence entre les micromoles de phosphate acétyl présente dans la réaction de contrôle manquent d'enzymes et de l'acétyl micromoles de phosphate restant après la réaction enzymatique.

Purifiée, recombinante M. acétate kinase thermophila a été dosé en utilisant le protocole décrit. Pour l'expérience le montre la figure 4, la concentration d'ADP a été maintenu constant à 5 mmol / L et la concentration de phosphate acétyle dans la réaction a été variée pour déterminer le K _m pour le phosphate acétyle. Comme prévu, cette expérience démontre que l'enzyme suit la norme de Michaelis-Menten-comme la cinétique pour chaque substrat et produit une courbe de saturation hyperbolique lors du traçage d'activité versus concentration de phosphate acétyle. L'apparente K _m de valeur pour le phosphate était de 0,27 acétyl ± 0,01 mmol / L, ce qui se compare favorablement à la valeur publiée K _m de 0,47 ± 0,01 mmol / L utilisant le couplage dedisent ^13.

Le dosage direct peut également être utilisé pour mesurer l'activité des kinases acétate qui utilisent des substrats autres que l'ATP, ce qui n'est pas possible en utilisant le test standard couplé. Recombinant purifié E. acétate kinase ¹⁶ histolytica, qui produit PP _i plutôt que l'ATP dans le sens de l'acétate de formage, a été soumis à ce test en utilisant le phosphate de sodium à la place de l'ADP. La concentration de phosphate de sodium dans la réaction a été maintenu constant à 0,2 mol / L et la concentration en phosphate acétyl était varié. Quant à la M. acétate kinase thermophila, le E. acétate kinase histolytica suivi de Michaelis-Menten-comme la cinétique de phosphate acétyle et une courbe de saturation hyperbolique a été observée (figure 5). L'apparente K _m de valeur pour le phosphate était de 0,50 acétyl ± 0,006 mmol / L. Reeves et Guthrie ¹⁵ a déterminé une valeur de K _m de 0,06 mmol / L pour le phosphate d'acétyle pour l'enzyme native, comment Cependant, leur enzyme a été que partiellement purifiés et leur dosage impliqué quatre enzymes de couplage qui ont également été partiellement purifiés. Ainsi, il est difficile de comparer directement ces valeurs.

Le schéma de protocole

1. Générer une courbe standard de phosphate de l'acétyl
2. Diluer l'enzyme à la concentration désirée
3. Préparer le mélange réactionnel et l'aliquote de 300 ul à microtubes
4. Réactions préincuber à 37 ° C pendant 1 minute
5. Démarrer réactions en ajoutant l'enzyme à des intervalles spécifiques
6. Ajouter hydroxylamine aux mêmes intervalles pour arrêter les réactions et incuber à 60 ° C pendant 5 minutes
7. Ajouter le chlorure ferrique / solution d'acide trichloracétique pour le développement de couleur
8. Centrifuger les tubes à 18.000 xg pendant 1 minute
9. Mesurer l'absorbance à 540 nm
10. Déterminer la quantité de phosphate acétyl consommée par rapport à la courbe standard

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Figure 1. Schéma Protocole

Figure 2. Normes de phosphate acétyle. L'augmentation des concentrations de phosphate ont été acétyl réagi avec de l'hydroxylamine et la couleur a été développé comme décrit. Le contrôle manquent de phosphate acétyle est jaune vif, et les réactions contenant des quantités croissantes de phosphate acétyl sont successivement de couleur plus foncée. Ce changement de couleur est mesurée à 540 nm.

Figure 3. Exemple de courbe de standards acétyl phosphate. Des quantités variables de phosphate ont été acétyl réagi avec la solution d'hydroxylamine et développement de la couleur et l'absorbance a été mesurée à 540 nm. L'absorbance à 540 nm par rapport phosphate de micromoles d'acétyle a été tracée et un ajustement linéaire pour les données ont été appliqués. </ P>

Figure 4. Utilisation du phosphate par l'acétyl M. ATP-production acétate kinase thermophila. L'activité enzymatique a été déterminée dans le sens de la formation d'acétate, en présence de 5 mmol / L d'ADP avec des concentrations variables de phosphate acétyle. Le montant de la consommation de phosphate acétyl a été déterminée comme la différence entre le montant de départ de phosphate acétyle dans la réaction et la quantité de phosphate acétyl restant après la réaction enzymatique. Les analyses ont été effectuées en triple avec barres d'erreur s'affiche.

Figure 5. Utilisation des phosphates acétyl par le PP _i-produisant E. acétate kinase histolytica. L'activité enzymatique dans le sens de la formation d'acétate a été déterminée en présence de 0.Phosphate de sodium 2 mol / L avec des concentrations variables de phosphate acétyle. Le montant de la consommation de phosphate acétyl a été déterminée comme la différence entre le montant de départ de phosphate acétyle dans la réaction et la quantité de phosphate acétyl restant après la réaction enzymatique. Les analyses ont été effectuées en triple avec barres d'erreur s'affiche.

La détection de phosphate acétyle dans ce dosage est tributaire d'une concentration suffisante de chlorhydrate d'hydroxylamine et de la concentration et l'acidité de la solution de chlorure ferrique. Altération du volume d'essai, il faudra reconsidérer ces deux composantes. Les réactions enzymatiques décrites ici ont été réalisées à 37 ° C à la résiliation d'hydroxylamine réalisée à 60 ° C pendant 5 minutes. Cette température élevée est essentielle pour permettre la conversion rapide du phosphate reste acétyle hydroxamate acétyle. Le calendrier de l'étape de développement de couleur et de la mesure de l'absorbance est moins critique, et peut être réalisée en aussi peu que 5 minutes et jusqu'à 15 minutes après l'ajout de la solution d'hydroxylamine. Les échantillons doivent être centrifugés avant de lire l'absorbance, comme l'acidité de l'échantillon peut conduire à la précipitation de l'enzyme et peut produire une lecture faussement élevés en raison de la turbidité, plutôt que changer la couleur réelle.Répartition des réactions développés commencent à se produire après 10-15 minutes.

Les principales complications de ce dosage pour examiner la cinétique enzymatique sont la détermination de la quantité d'enzyme à utiliser et la durée du temps de courir la première étape de la réaction. Ceux-ci doivent être déterminées empiriquement pour chaque enzyme tels que le niveau d'activité n'est pas si élevé que l'ensemble du substrat de phosphate acétyle est consommée. Une attention particulière devrait être accordée à la consommation de phosphate pour cent pour chaque point de l'acétyl réaction dans une courbe cinétique. En général, des concentrations plus faibles de la composante variée sur une courbe cinétique devrait résulter de la consommation de phosphate acétyl jusqu'à 90 pour cent ou légèrement au-dessus, tandis que la consommation de phosphate acétyle à saturer concentrations de substrat devrait avoisiner les 10 pour cent ou un peu moins. Une fois la concentration d'enzyme est optimisé, la gamme de substrats pour la détermination des constantes cinétiques peut alors être déterminée.

Pméthodes pour mesurer l'activité récédent acétate kinase dans le sens de l'acétate de former impliquait l'utilisation de tests couplés. Ces méthodes sont problématiques en ce qui concerne les calculs cinétique due à la dépendance à l'activité de l'enzyme de couplage (s), dont l'analyse des conditions (pH, force ionique, température, etc) peuvent être incompatibles avec les conditions du dosage optimal pour l'enzyme d'intérêt . En outre, l'utilisation d'un dosage direct pour les études avec des inhibiteurs peut éviter les problèmes qui pourraient résulter de l'inhibition des enzymes de couplage. Globalement, ce test devrait être utile non seulement pour l'acétate kinase, mais pour toute enzyme qui utilise le phosphate acétyle ou d'autres substrats acyl activé courte chaîne comme l'acétyl-ou propionyl-CoA, le phosphate propionyle, et de l'acétyl-AMP, qui sont tous des réactifs avec de l'hydroxylamine. Dans ces cas, la courbe standard serait générée avec le substrat acyle approprié au lieu d'avec le phosphate acétyle.