Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Lo schema generale di questo protocollo è descritto nella Figura 1.

1. Preparazione soluzione per le curve standard e saggi

1. Preparare 100 mL di una mol / L 2 soluzione di idrossilammina-HCl. Pesare 13,9 g di cloridrato di idrossilammina (MW 69,49 g / mol) e si dissolvono in circa 50 ml di acqua distillata, deionizzata (DDH ₂ O). Regolare il pH a 7,0 con pellet di idrossido di potassio o di una soluzione concentrata. Portare il volume finale a 100 ml. La soluzione può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 30 giorni a 4 ° C per un massimo di 90 giorni.
2. Preparare 100 ml di una soluzione di cloruro ferrico / soluzione di acido cloridrico. Pesare 13,5 g di cloruro ferrico (PM 270,32 g / mol) e si dissolvono in circa 50 mL DDH ₂ O. Aggiungere 41,3 ml di acido cloridrico concentrato (12,1 mol / L) e portare ad un volume finale di 100 mL. La concentrazione finale di cloruro ferrico sarà di 0,5 mol / L e la concentrazione finale di acido cloridrico sarà di 5 mol/ L. La soluzione è conservato a temperatura ambiente.
3. Preparare 100 mL di una mol / L 1,84 soluzione di acido trichoroacetic. Pesare 30,0 g di acido tricloroacetico (MW 163,39 g / mol), si sciolgono in DDH ₂ O e portare il volume finale a 100 ml. La soluzione è conservato a temperatura ambiente.
4. Preparare 5 ml di un mol / L di soluzione 0,1 acetil fosfato. Pesare 0,092 g di fosfato acetil (MW 184,06 g / mol), si sciolgono in DDH ₂ O e portare il volume finale di 5 ml. Aliquota la soluzione ai tubi da microcentrifuga (0,25 ml per provetta) e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Soluzione scongelati dovrebbero essere immessi sul ghiaccio e può essere utilizzata per circa 1 ora. Soluzione di fosfato acetil che è stato scongelato non deve essere ricongelato e riutilizzati.
5. Preparare 5 ml di un mol / 0,1 L soluzione di ADP. Pesare 0,24 g di ADP (MW 472,5 g / mol), si sciolgono in DDH ₂ O, e portare il volume finale di 5 ml. Aliquota della soluzione in tubi microcentrifuga (0,5 ml per provetta) e congelare a -20 ° C finouso. Mantenere soluzione scongelati su ghiaccio fino al momento dell'uso.
6. Preparare 50 mL di una mol / L 1 soluzione di Tris. Pesare 6,06 g di Tris (MW 121,14 g / mol), e si sciolgono in 40 ml DDH ₂ O. Regolare il pH della soluzione a 7,0 con acido cloridrico e portare il volume finale a 50 ml. Soluzione conservare a temperatura ambiente.
7. Preparare 10 mL di una mol / L 1 soluzione di cloruro di magnesio. Pesare 2,03 g di cloruro di magnesio (PM 203,31 g / mol), si sciolgono in DDH ₂ O, e portare il volume finale a 10 ml. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
8. Preparare 25 mL di soluzione di sviluppo mescolando volumi uguali di cloruro ferrico / soluzione di acido cloridrico e la soluzione di acido tricloroacetico. Soluzione di sviluppo deve essere preparato fresco ogni giorno e conservati a temperatura ambiente.

2. Preparazione di una curva standard acetil fosfato

1. Una curva standard acetil fosfato è generato con quantità note di acetil fosfato. Una curva standard da sei a eighpunti di t è adatto. Gli standard deve variare da 0,03 a 0,9 μmoles μmoles per 300 ml, che è correlato alla concentrazione finale da 0,1 a 3 mmol / L. Diluire la soluzione madre acetil fosfato alle concentrazioni appropriate soluzione a 100 mM Tris in un volume finale di 300 ml. Un campione di controllo senza fosfato acetil dovrebbe anche essere preparati.
2. Incubare ciascun standard e il controllo a 37 ° C in un blocco di calore per 1 minuto.
3. Aggiungere 50 ml di soluzione di cloridrato di idrossilammina per ciascuno standard e il controllo e mescolare agitando tre volte. Posizionare lo standard in un blocco di calore 60 ° C e incubare per cinque minuti.
4. Aggiungere 100 ml di soluzione di sviluppo per gli standard e il controllo, mescolare agitando tre volte, e permettere sviluppare il colore per almeno un minuto a temperatura ambiente.
5. Centrifuga tutti gli standard e il controllo in una microcentrifuga a 18.000 xg per 1 minuto.
6. Misurare i campioni spettrofotometricamente unot 540 nm utilizzando cuvette 1 ml di plastica, utilizzando il controllo come il bianco per spettrofotometria.
7. Generare una curva standard utilizzando appropriate analisi dei dati e software grafici (Kaleidagraph ad esempio, il software Synergy). R ² valori di 0,99 o superiori sono desiderabili. I dati sono riportati come assorbanza a 540 nm contro μmoles del presente acetil fosfato.

3. Test per l'attività acetato chinasi

1. Utilizzando le soluzioni descritte, preparare una miscela di reazione contenente una concentrazione finale di 0,1 mol / L di tampone Tris, 10 mmol / L di cloruro di magnesio, 5 mmol / L ADP, e 2 mmol / L acetil fosfato. A 10 ml di miscela di reazione richiede 8,2 mL DDH ₂ O, 1,0 ml soluzione Tris, 0,1 ml di soluzione di cloruro di magnesio, 0,5 ml di soluzione di ADP, e 0,2 ml di soluzione di fosfato acetil. Distribuire la miscela di reazione in 300 microlitri aliquote ai tubi microcentrifuga. Per la determinazione dei parametri cinetici e di ottimizzazione delle concentrazioni di substrato, un substrato può esserevaria e l'altra presso una concentrazione costante nelle reazioni.
2. Pre-incubazione le reazioni per 1 minuto a 37 ° C in un blocco di calore.
3. Aggiungere una quantità desiderata di enzima per la reazione e restituire immediatamente il tubo per il 37 ° blocco C di calore. Includono anche una reazione di controllo a cui non enzima viene aggiunto. Se le reazioni sono diverse eseguiti, aggiungere enzima per i tubi ad intervalli di tempo specifici. Assicurati di tenere traccia del tempo. (NOTA: la quantità di enzima da utilizzare dovranno essere ottimizzati per assicurare che tutte le acetil-fosfato o substrato ADP non sarà esaurito - vedi sezione Discussione)
4. Dopo 5 minuti, aggiungere 50μl della soluzione di cloridrato di idrossilammina per ogni reazione e il controllo, mescolare, e posto i tubi in un blocco di calore 60 ° C. Se le reazioni sono diverse corso di esecuzione, questo deve essere fatto a l'intervallo di tempo stesso l'enzima è stato aggiunto.
5. Incubare le reazioni e il controllo per 5 minuti a 60 ° C.
6. Aggiungere 100 &mu, L della soluzione di sviluppo per ogni reazione e il controllo, mescolare, e posto in un rack tubo sul banco di laboratorio. Lasciar sviluppare il colore per almeno 1 minuto.
7. Centrifugare tutte le provette in una microcentrifuga a 18.000 xg per 1 minuto.
8. Campioni di misura spettrofotometricamente a 540 nm utilizzando cuvette 1 ml di plastica e determinare la quantità di fosfati presenti acetil rispetto alla curva standard di acetil fosfato.
9. La quantità di substrato acetil fosfato impoverito può essere determinato sottraendo la quantità di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica dalla quantità di acetil-fosfato presenti nel controllo enzima mancante. Effettuare l'analisi dei dati utilizzando i dati e software appropriati grafici (Kaleidagraph ad esempio, il software Synergy). R ² valori superiori a 0,97 sono desiderabili.

4. Rappresentante dei risultati:

Lo scopo di questo saggio è quello di misurare l'attività chinasi di acetato in direttaione della formazione di acetato. Questo viene fatto attraverso la misurazione del consumo del substrato acetil fosfato, in quanto non vi è facile, la misura diretta per la produzione di acetato. Acetil fosfato che rimane dopo un certo tempo durante la reazione enzimatica viene convertito in acetil hydroxamate e, successivamente, al complesso hydroxamate di ferro, che ha un colore rossastro (Figura 2) che può essere misurato a 540 nm. La curva standard tracciando assorbanza contro μmoles acetil fosfato presenti nelle norme viene utilizzato per determinare la quantità di fosfato acetil rimanente in ogni reazione. La curva standard deve essere lineare attraverso il punto zero. Una curva rappresentativa di serie mostrato in Figura 3 ha una pendenza di 1,2332 unità di assorbanza per μmole presenti acetil fosfato e di un valore ² R di 0,99, indicando i dati approssima l'equazione lineare bene. L'equazione per la misura lineare ai dati curva standard viene utilizzato per calcolare la quantità di fosfato acetil rimasti nella reazione. Il μmolesdi fosfato acetil consumato è determinato come differenza tra il μmoles di acetil fosfato presenti nella reazione di controllo carente dell'enzima e la μmoles di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica.

Purificato, ricombinante M. chinasi acetato thermophila è stato analizzato utilizzando il protocollo descritto. Per l'esperimento mostrato nella Figura 4, la concentrazione di ADP si è tenuta costante a 5 mmol / L e la concentrazione di fosfato acetil nella reazione è stata variata per determinare la _m K per l'acetil fosfato. Come previsto, questo esperimento dimostra che l'enzima segue standard di Michaelis-Menten-come cinetica per ogni substrato e prodotto una curva iperbolica di saturazione durante la stampa in funzione della concentrazione di attività acetil fosfato. L'apparente K valore _m per acetil fosfato è stata di 0,27 ± 0,01 mmol / L, che confronta favorevolmente alla pubblicazione valore K _m di 0,47 ± 0,01 mmol / L utilizzando l'accoppiata comedire ^13.

Il test diretto può essere utilizzato anche per misurare l'attività delle chinasi acetato che utilizzano supporti diversi da ATP, che non è possibile con il test standard di accoppiamento. Ricombinante purificata E. histolytica acetato chinasi ^16, che produce _i PP piuttosto che ATP in acetato che formano la direzione, è stato sottoposto a questo test utilizzando fosfato di sodio al posto di ADP. La concentrazione di fosfato di sodio nella reazione si è tenuta costante a 0,2 mol / L e la concentrazione di fosfati acetil è stato variato. Per quanto riguarda il M. thermophila chinasi acetato, la E. chinasi acetato histolytica seguito Michaelis-Menten-come cinetica per acetil fosfato e una curva di saturazione iperbolica è stato osservato (Figura 5). L'apparente K valore _m per acetil fosfato è stato 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves e Guthrie ¹⁵ ha determinato un valore di K _m di 0,06 mmol / L per fosfato acetil per l'enzima nativo; come mai, il loro enzima è stato solo parzialmente purificato e la loro analisi coinvolti quattro enzimi di accoppiamento che erano anche solo parzialmente purificato. Così, è difficile confrontare direttamente questi valori.

Schema di protocollo

1. Generare una curva standard acetil fosfato
2. Diluire enzima alla concentrazione desiderata
3. Preparare la miscela di reazione e aliquota 300 ml per tubi da microcentrifuga
4. Reazioni Preincubare a 37 ° C per 1 minuto
5. Avviare le reazioni con l'aggiunta di enzimi ad intervalli di tempo specifici
6. Aggiungi idrossilammina agli stessi intervalli di fermare le reazioni ed incubare a 60 ° C per 5 minuti
7. Aggiungi cloruro ferrico / soluzione di acido tricloroacetico per lo sviluppo del colore
8. Centrifugare i tubi a 18.000 xg per 1 minuto
9. Misurare l'assorbanza a 540 nm
10. Determinare la quantità di fosfato acetil consumato dal confronto con la curva standard

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Figura 1. Protocollo Scheme

Figura 2. Standard acetil fosfato. Concentrazioni crescenti di fosfato sono stati acetil reagito con idrossilammina e il colore è stato sviluppato come descritto. Il controllo manca acetil fosfato è giallo brillante, e le reazioni contenenti quantità crescenti di acetil-fosfato sono successivamente di colore più scuro. Questo cambiamento di colore è misurato a 540 nm.

Figura 3. Esempio di curva standard acetil fosfato. Quantità variabili di acetil-fosfato sono stati reagito con idrossilammina e la soluzione di sviluppo del colore e assorbanza è stata misurata a 540 nm. L'assorbanza a 540 nm contro μmoles acetil fosfato è stato tracciato e una misura lineare ai dati è stato applicato. </ P>

Figura 4. Utilizzo di fosfato acetil dalla ATP-produzione M. thermophila acetato chinasi. Attività enzimatica è stata determinata nella direzione della formazione di acetato in presenza di 5 mmol / L ADP con concentrazioni variabili di acetil fosfato. La quantità di fosfato consumato acetile è stato determinato come differenza tra l'importo iniziale di acetil-fosfato nella reazione e la quantità di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica. I saggi sono stati eseguiti in triplice copia con barre di errore visualizzato.

Figura 5. Utilizzo di fosfato acetil dal PP _i produttori di E. histolytica acetato chinasi. Attività enzimatica in direzione della formazione di acetato è stato determinato in presenza di 0.2 mol / L di fosfato di sodio, con concentrazioni variabili di acetil fosfato. La quantità di fosfato consumato acetile è stato determinato come differenza tra l'importo iniziale di acetil-fosfato nella reazione e la quantità di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica. I saggi sono stati eseguiti in triplice copia con barre di errore visualizzato.

Il rilevamento di fosfato di acetile in questo saggio dipende da una concentrazione sufficiente di cloridrato di idrossilammina e la concentrazione e l'acidità della soluzione di cloruro ferrico. Alterazione del volume test richiederà riconsiderazione di entrambi questi componenti. Le reazioni enzimatiche qui descritti sono stati eseguiti a 37 ° C con la cessazione idrossilammina eseguita a 60 ° C per 5 minuti. Questa temperatura più alta è fondamentale per consentire la rapida conversione del restante acetil fosfato di hydroxamate acetil. I tempi della fase di sviluppo del colore e la misura di assorbanza è meno critica, e può essere eseguita in meno di 5 minuti e fino a 15 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di idrossilammina. I campioni devono essere centrifugati prima di leggere l'assorbanza, in quanto l'acidità del campione può portare alla precipitazione di enzima e può produrre una lettura falsamente elevati a causa della torbidità, piuttosto che cambiare colore effettivo.Ripartizione delle reazioni sviluppate inizieranno a verificarsi dopo 10-15 minuti.

Le principali complicazioni di questo test per l'esame cinetica enzimatica sono la determinazione della quantità di enzima da utilizzare e l'intervallo di tempo per eseguire il primo passo della reazione. Questi devono essere determinati empiricamente per ciascun enzima in modo tale che il livello di attività non è così alta che tutti i substrato acetil fosfato è consumato. Particolare attenzione dovrebbe essere data al consumo acetil fosfato per cento per ogni punto di reazione in una curva cinetica. In generale, concentrazioni più basse della componente varia su una curva cinetica dovrebbe portare a consumo acetil fosfato fino al 90 per cento o leggermente al di sopra, mentre il consumo di fosfato acetil a concentrazioni del substrato saturare dovrebbero avvicinarsi il 10 per cento o poco meno. Una volta che la concentrazione di enzima è ottimizzato, la gamma di substrato per la determinazione delle costanti cinetiche possono essere determinati.

Previous metodi per misurare l'attività della chinasi acetato nel acetato di formazione direzione comportato l'utilizzo di test accoppiati. Questi metodi sono problematiche relative al calcolo cinetica dovuta alla dipendenza l'attività dell'enzima del giunto (s), le cui condizioni di test (pH, forza ionica, temperatura, ecc) possono essere incompatibili con le condizioni ottimali per il dosaggio degli enzimi di interesse . Inoltre, l'uso di un test diretto per gli studi con inibitori possono evitare i problemi che potrebbero derivare dalla inibizione degli enzimi di accoppiamento. In generale, questo test dovrebbe essere utile non solo per la chinasi acetato, ma per qualsiasi enzima che utilizza l'acetil fosfato o altri substrati attivati ​​breve catena acilica come acetil-o propionil-CoA, propionil fosfato e acetil-AMP, che sono reattivi con idrossilammina. In questi casi, la curva standard sarebbe stato generato con il substrato acil appropriato anziché con acetil fosfato.