RNAiによる遺伝子ノックダウンと

Lisa L. Drake¹, David P. Price², Sarah E. Aguirre¹, Immo A. Hansen¹

¹Biology Department, New Mexico State University, ²Molecular Biology Department, New Mexico State University

パートI -大人のネッタイシマカ蚊のRNAiによる遺伝子ノックダウン。実験の概要については、 図1を参照してください。

1。 dsRNAの合成

1. 関心とコントロールdsRNAの遺伝子に対する特異的dsRNAを合成する。注：私達は3 '特異的cDNA ²の端部と5に接続されたT7プライマー配列を持つ'末端（5'-TAA TAC GAC TCA CTA位置して300から500塩基対の範囲でPCR断片のために開発のプライマーをお勧めしますTAG GG-3 '）。フラグメントの一意性は、BLASTN解析³で確認されるべきである。
2. dsRNAを合成する転写反応のためにT7 RNAポリメラーゼを利用したAmbion社Megascript T7高収率転写キット（Ambion社、試薬のテーブル）を使用します。注：同様の試薬およびキットは、他の利用可能です。
3. dsRNAを精製するために、Megascriptキットとの指示に従って、塩化リチウムを沈殿させる。
4. purificat後イオン、滅菌水でdsRNAペレットを溶解する。マイクロインジェクションのための適切な粘度を確保するために、dsRNAの濃度は2μg/μlを超えないようにしてください。

2。注射の準備

1. シンプルなマイクロインジェクタは、チューブ、はさみ、金属針、1mlの注射器、および1 mlプラスチックピペットチップ（ 図2を参照）を使用して構築することができます。チューブの長さは〜40 cmにカットする必要があります。また、自動化されたマイクロインジェクタなどドラモンドNanojet II ⁴として使用することができます。
   1. 2 mlのスケールマークで注射器の先端（針ハブ）をカットし、プランジャーからゴムプランジャーヘッドを取り外します。
   2. パンチ穴ゴムプランジャーヘッドに金属針を使用して、針ハブに戻るゴムプランジャーヘッドを配置します。
   3. チューブの一端に針ハブを置き、マウスピース（あるいは、10ミリリットルSYとして使用されるもう一方の端に1 mlのプラスチック製のピペットチップを配置ringe）を注入するために必要な空気の圧力を生成するために使用することができます。
2. ゴムプランジャーヘッドの穴にガラスキャピラリー針を配置し、幅は液体が流れるように十分大きくなるように針の先端を切る。注意：針先の最適なサイズは経験的に決定する必要があります - 針の幅が大きすぎる場合は、この針の幅が小さすぎる場合、それが浸透することは不可能になり、外傷や高い蚊の死亡率になります蚊外骨格。
3. 準備されたdsRNAはサンプル中の水没注射針を、口の部分（またはシリンジ）で液体を吸引することにより、注射針に液体サンプルを描画します。注：この手順は 、in vivo利尿アッセイプロトコルでで使用されているPBS緩衝液（下記参照）を含む蚊に注入されているすべての液体試薬のと同じです。

3。蚊を収集し、麻酔

1. コレクション1コレクションバイアルに、バッテリ駆動の吸引とT蚊。コレクションバイアルの上にキャップを置き、蚊を麻酔するためにクリーンなCO ₂パッドの上に瓶を置きます。注：代わりに蚊が氷の上で麻酔をすることができます。

4。蚊インジェクション

1. コレクションバイアルを開き、直接CO ₂パッドの上に蚊を配置し、蚊が麻酔するまで待ちます。
2. すべての男性を破棄します。
3. 注射のための容易なアクセスを可能にするために側に蚊を並べる。
4. 怪我を避けるために、脚や翼によって蚊をつかむ。また、蚊を操作するために微細な絵筆や羽を使用することができます。
5. 第一蚊を注入する準備ができたら、穏やかに鉗子で胸部の片側をサポートしており、胸郭の反対側（ 図2）に針の先端を挿入します。それはキューティクルの薄い部分に注入して針を押して避けるこ​​とをお勧めします胸郭に深くO。
6. 針が配置されたら、蚊に液体を吹く。所望の量は、針で液体のメニスカスを監視することによって決定することができます。特定のボリュームのために必要なミリメートルの数は、ガラスキャピラリー針^（πR2時間）のシリンダー容積を計算することによって決定することができます。一般的に注射に使用されるdsRNAの有効量は1μgです。
7. 液体蚊に注入されたら、慎重に針を撤回。胸郭の外側に大きな液滴の形態の場合、蚊は捨てられるべきです。その後、次の蚊で、このプロセスを繰り返します。

5。蚊の回収·貯留

1. 注入後、ストレージ用のコンテナに蚊を配置します。たとえば、1パイントワックスはメッシュが段ボール蓋で保護されたカバーで（スープカップ）段ボールカップが並ぶ。蓋が公開するカバーメッシュのカットアウト部を有している。一度すべてのMOsquitoesがコンテナ内に配置され、インキュベーションのための環境制御チャンバー内にコンテナを配置し、そのようなメッシュ被覆の上に置かれ、20％ショ糖に浸した綿球などの食料源、で蚊を提供しています。 in vivoで利尿アッセイを実行する前に、各蚊の水和状態を標準化するために12時間の水源のdsRNA注入蚊を奪う。
2. dsRNAを媒介遺伝子ノックダウンの効率は可変にすることができます。遺伝子サイレンシングは、注入後1日を始めることができ、それは注入後⁴ 6日まで続く可能性があります。最大の遺伝子ノックダウンを達成するために最適な時間は、使用されるすべての遺伝子について実験的に決定する必要があります。我々が進む前に、一般的に、我々は、dsRNAの注射後3日待ってください。

パートII -大人のネッタイシマカ蚊の in vivo利尿アッセイでは

注：このプロトコルは、著者によって開発されたと黄熱病の蚊のネッタイシマカ ¹にアクアポリン蛋白質のRNAiによるノックダウンに使用されます。個々の蚊の間でのばらつきを避けるために、蚊は、グループで分析する必要があります。技術的な理由から、我々は、治療ごとに5蚊のグループをお勧めします - 蚊が注射後の尿を排泄し始める前に、最初の体重測定を実行する時間の限られた量があります。

6。蚊を収集し、麻酔

1. 蚊のコレクションの前に、分析精度のバランスを使用してキャップを持つ空のコレクションバイアルの重量を記録します。このバイアルは、後続のすべての測定に使用されます。
2. アスピレーターで体重コレクションバイアルに5メスの蚊を収集します。コレクションバイアル上にキャップを置き、蚊を麻酔するのに数秒のためにCO ₂パッドの上に座らせて。

7。初期重量測定

1. tを取る高精度のバランス上のキャップで蚊を含むコレクションバイアルを配置することにより、5蚊の彼の初期重量測定。
2. 蚊の体重とキャップを使用してコレクションバイアルを取り出し、キャップを持つ空のコレクションバイアルの重量を差し引いて5蚊の群の重量を計算します。
3. コレクションバイアルを開いて、蚊の体重を記録した後、CO ₂のパッドに直接蚊を配置します。蚊は体重測定中に目覚め始めている場合は、それを開いて、パッドの上に蚊を配置する前に数秒間、CO ₂パッドの上にバイアルを設定します。

8。注射の準備

1. RNAiによる遺伝子ノックダウンプロトコルに与えられた指示に従って、マイクロインジェクターを設定します。
2. マイクロインジェクタのガラスキャピラリー針を置き、針の先端を断つように幅がLIQのために十分な大きさです。流れるようにUIDを指定します。
3. 水没PBS緩衝液で針と注射針にバッファを描画するには、このプロトコルに使用するため、所望の量は、それぞれの蚊のためにPBSの1.25μlです。注：この量は女性の蚊⁵で巻き取られる血漿の平均量を模倣しています。

9。蚊インジェクション

1. マイクロインジェクターで簡単にアクセス可能にするために蚊を並べる。
2. 針が配置されたら、蚊にP​​BSバッファを吹く。
3. 液体蚊に注入されると、液滴は、胸郭の外側に形成するかもしれません。この液滴は、慎重に次のステップの前に削除する必要があります。
4. 次の蚊でこの注入プロセスを繰り返します。経験と、蚊の生存率は、注入後ほぼ100％になります。

10。計量蚊

1. 注入後、穏やかにコレクションバイアルに蚊を配置とキャップ。高精度のバランス上のキャップで蚊を含むコレクションバイアルを配置することにより、5蚊の最初の体重測定を行います。
2. キャップ付き蚊やコレクションバイアルの重量を取ることによって、5蚊の群の重量を計算し、キャップを持つ空のコレクションバイアルの重量を減算します。注：蚊はCO ₂麻酔パッドから除去した後、2分以内に尿を排泄し始めるので、それが排 ​​泄を開始する前に体重測定を行うことが重要です。
3. 彼らは尿を排泄し始めます小さな容器に蚊を置きます。

11。二番目以降の体重測定

注：蚊の体重測定が30分間隔で撮影する必要がありますが、これは排泄率に応じて、短いか長い間隔に調整することができます。

1. 30分後、grouを収集キャップと同じコレクションバイアルにアスピレーターで5蚊のp。高精度のバランス上のキャップで蚊を含むコレクションバイアルを配置することにより、蚊の次の重量測定を取る。
2. 測定後、次の30分間、同じ保持容器内の蚊を配置します。
3. 目的の時間のために、このプロセスを繰り返します。

12。決定モスキート排泄率

1. 5蚊の群に注入した液体の総量は、直ちに注入後の重量から蚊の初期重量を差し引くことによって計算することができます。
2. 特定の時点で蚊のグループによって排泄された尿の量は、特定の時点での蚊の重量から蚊の初期重量を差し引くことによって計算することができます。
3. 特定の時点での排泄率は、配当によって計算することができます。鼎液体注入の合計額（ 表1）ことにより、この時点で排泄される尿の量。

13。代表的な結果

RNAiによる遺伝子ノックダウンとin vivoでの利尿アッセイでは、ネッタイシマカ蚊利尿におけるアクアポリンの影響を研究するハンセンラボで使用されている。 ネッタイシマカマルピーギ管で表現されている3つのアクアポリンは蚊^1を制御するために比較して排泄率に大きな影響をノックダウンした。 図4は、利尿アッセイはネッタイシマカとネッタイイエカの間の排泄率を比較するために使用されている実験の代表的な結果を示しています。異なる温度で。

図1。 10蚊EA の RNAi /利尿アッセイのフローチャートを示す。5グループchは、特定の遺伝子のdsRNAを注入されると10蚊の別の5つのグループはコントロールするdsRNAを注入されています。 PBSで200μMHgCl ₂で注入された蚊の別のグループは、ポジティブコントロールとして使用されています。これらの蚊は、注射の前に秤量し、3時間30分間隔で注入した後にされています。

図2。 RNAiによる遺伝子ノックダウンとin vivoでの利尿アッセイでシンプルなマイクロインジェクション装置。A.ガラスキャピラリー針は注射に使用されます。灰色の三角形は、蚊に注入される液体の量を示すために、針に描かれたミリメートル単位で表します。 B. 1 mlシリンジは、マイクロインジェクタを構築するために使用される。白い三角形は、針ハブを表し、黒三角は、シリンジのプランジャに取り付けられたゴム製のプランジャーヘッドを表しています。 Cにマウスピースを接続するためのチューブインジェクタ。マイクロインジェクション装​​置のマウスピースとして使用されているD. 1ミリリットル使い捨てピペットチップ（ブルーチップ）。 E. ADの部品を組み込んだマイクロインジェクション装置は拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。最適な蚊注射部位。A.女性ネッタイシマカ蚊は、胸部に大きなスケールの間にガラスキャピラリー針で注入した。黒いバーはサイズ比較のために1ミリメートルを示しています。 B.雌の蚊の胸部の描画や白い斑点は、蚊外骨格の白鱗を表しています。注射針が貫通スポット間の蚊は、注入時の死亡率を最小限に抑える必要があります。

図4。温度の影響ネッタイイエカおよびネッタイシマカ利尿 ​​上でトゥーレ。利尿アッセイは、異なる温度で、蚊、 ネッタイシマカおよびネッタイイエカの2種を用いて行った。注入後の最初の時間中に排泄率はパーセントで指定します。

in vivoでの利尿アッセイの結果表 1。 ネッタイシマカ 。4にネッタイシマカ雌蚊で行わin vivoでの利尿アッセイ ℃から生データ

使用されるRNAiのプロトコルは、カリフォルニア州リバーサイド^6,7の大学でアレキサンダーRaikhelの研究室で開発され、GarverとDimopoulos ⁴で公開プロトコルに似ていました。このビデオプロトコルに示すように、実験的なアプローチは、 生体内の設定での昆虫利尿に関与する遺伝子を研究するために使用することができます。昆虫の排泄器官、マルピーギ細管では、利尿のための 'シンプルな'のモデル系として研究者の世代の関心を集めている。このオルガンは、 ショウジョウバエのクリアランス⁸との仕事は現在RNAiのような逆遺伝学的方法と他の昆虫種で検討することができますマルピーギ管生理学^9,10に関与する多数の遺伝子を同定した異物に関与している。多くの相同遺伝子は、簡単に様々な昆虫種の¹¹の公開ゲノム配列で同定することができます。三日の古い蚊があるため、この時間ポイで、このプロトコルで使用されていたNT彼らは、血液の食事を取ることが有能になる。

他のいくつかの排泄アッセイが報告されている。古典的なラムゼイアッセイは 、in vitro ¹² の孤立したマルピーギ管で利尿を研究するために使用されています。このアッセイでは、単一の細管は、絶縁されており、近位部が開いている間に遠位部は、生理食塩水の一滴に配置されます。利尿活性は、近位部の末尾に形成した尿液滴の大きさを測定することによって計算されます。ラムゼイアッセイを使用して、1つは、個々のマルピーギ管で尿産生量を測定することができます。私たちの利尿アッセイは、全体の蚊排泄率の測定を可能にし、したがって、ラムゼイアッセイに代わるものではありません。代わりに、両方のアッセイは、一緒に使用する場合は補足情報を提供することができます。

生体排泄アッセイの他はイエバエとネッタイシマカのために開発されました。M.イエバエの研究では含むdフロースルー湿度計¹³による水の損失を測定する。同様の技術は、高精度の湿度チャンバ^14を使用^して排泄率を測定することにより、 ネッタイシマカの利尿を研究するために使用されていました。技術的には上記の技術として要求し、それにもかかわらず、完全な生物のコンテキスト内で排泄率は非常に正確なデータを生成するようにここで紹介するin vivoでの利尿アッセイではありません。

ここで紹介するin vivoで利尿アッセイのための将来のアプリケーションの広い範囲があります。 RNAiのような遺伝学の方法を逆にするだけでなくそれが昆虫利尿に、例えば、シグナル伝達阻害剤等のために、薬の効果を研究するために使用することができます。それはまた、標的昆虫で異物クリアランスの過程を研究するための強力なアッセイである。

さらに、このアッセイを開発しながら我々が対処するという問題がある：a）濃度と注入バッファーの組成物。我々我々は生理ヒトスジシマカのようなこれまでのところ、他のバッファを行った実験のためにPBSを使用した生理食塩水^15は、蚊や他の昆虫より適切であることが判明するかもしれません。 B）特に他の種、非血を吸う昆虫にこの方法を適用しています。このような種を注入することができるバッファの量は経験的にそれぞれの種に決定する必要があります。 C）実験誤差を最小限に抑えます。我々は、注入と測定技術を最適化します。