Labeling stamcellen met Ferumoxytol, een FDA-goedgekeurd ijzeroxide Nanodeeltje

1. Dag 1

1) Plaat-cellen

1. Plaat hMSC in een T75 kolf bij een confluentie van 80% ten minste 18-24 uur voorafgaand aan de etikettering. Zie tabel 1 voor de instructie voor alternatieve schepen.

2. Dag 2

2) Bereid de etikettering oplossing. Deze voorbereiding zal label een (1) T75 kolf bij 80% confluentie met een concentratie van 400 ug Fe / ml. Zie tabel 1 voor de instructie voor alternatieve schepen.

1. Maak een oplossing (oplossing 1) door het mengen van 1 ml serum-vrij medium en 93,1 ul van ferumoxytol (voorraad: 30 mg / ml) in een 15 ml conische buis.
2. Maak een tweede oplossing (oplossing 2) door het mengen van 1 ml serum-vrij medium en 7 pl van protamine sulfaat (voorraad: 10 mg / ml) in een seconde 15 ml conische buis.
3. Kan elke oplossing 5 minuten rusten.
4. Samen toe te voegen oplossingen 1 en 2. Meng de nieuwe etikettering oplossing. Laat de oplossing 5 minuten rusten tot USPIO-pro vergunningtamine sulfaat complexen te vormen.
5. Voeg 5 ml serum-vrij medium om de mixed 2 ml van SPIO / protamine sulfaat oplossing voor een uiteindelijk volume van 7 ml.

3) Bereid cellen voor de etikettering

1. Aspireren van de media uit de cellen.
2. Voorzichtig een keer wassen cellen met 2-3 ml van voorverwarmde Mg / Ca-free D-PBS of serum-vrije media om weg te spoelen resterende serumeiwitten en of andere media componenten die contrastmiddel de opname en de etikettering efficiëntie zouden kunnen aantasten. Aspireren de spoel vloeistof.

4) Label-cellen

1. Voeg de volledige 7 ml van de oplossing voor de etikettering van cellen.
2. Plaats cellen in een incubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ en laat de cellen te incuberen in de etikettering oplossing voor 4 uur.
3. Voeg 700 ul van FCS tot de etikettering oplossing van de cellen tot een uiteindelijke serum concentratie van 10% te bereiken. Serum wordt toegevoegd aan herstel van de verrijkte omgeving, waarvan de cellen zijn gewend, en om te helpen bij minimizing celdood die zou kunnen voortvloeien uit een abrupte verschuiving naar 24 uur blootstelling aan een serum-vrije omgeving.
4. Laat de cellen om incuberen met de etikettering oplossing voor een extra 20 uur.

3. Dag 3

5) Bereid gelabelde cellen

1. Aspireren de etikettering oplossing van cellen.
2. Voorzichtig spoelen cellen met 2-3 ml van voorverwarmde Mg / Ca-free D-PBS. Aspireren de PBS. Het is belangrijk om Mg / Ca-vrij PBS te gebruiken als de Mg en Ca zal de efficiëntie van Trypsine aantasting in de volgende stap.
3. Voeg 2 ml van de voorverwarmde 0,05% trypsine aan de cellen en kantel de fles heen en weer om het gehele oppervlak van de kolf te waarborgen is bedekt met een dun laagje van trypsine. Plaats de cellen in een incubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ en laat de cellen tot rust voor 5-7 minuten of tot cellen beginnen te los te maken van de plaat. Het kan nodig zijn om onthechting te bevestigen onder een microscoop. Tik zachtjes tegen de zijkanten van de kolf indien nodig facilitate cel-oppervlak van onthechting.
4. Voeg 4 ml van voorverwarmde compleet media om de kolf aan het trypsine te neutraliseren. Voorzichtig spoel de kolf door pipetteren de trypsine / media / cel-oplossing op en neer meerdere malen. Verzamel de gehele oplossing in een 15 ml conische buis. Centrifugeer de cel oplossing bij 400 RCF gedurende 5 minuten.
5. Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet. Resuspendeer de cellen in 5 ml van de media (serum bevat of serum-vrij). Centrifugeer de cel oplossing bij 400 RCF gedurende 5 minuten.
6. Herhaal de cel wassen beschreven in stap 5.5. In totaal zullen cellen worden gespoeld drie keer om resterende, vrij contrastmiddel te verwijderen in de media en op het oppervlak van cellen.
7. Tellen cellen op dit punt om de meest accurate celgetal te bereiken, als cellen gaan verloren tijdens vorige wassen. Voer een levensvatbaarheid test van cellen. Cellen zijn nu klaar voor verdere analyse en of experimentele toepassing. MRI kan worden uitgevoerd met een T1-w en T2-w parameters, want hoewel ferumoxytol is een T2-w contrastmiddel, ferumoxytol ook vertoont T1 effecten. Representatieve T2-w MRI-parameters die gebruikt kunnen worden om de afbeelding ferumoxytol gelabelde cellen zijn onder andere: FSE of SE_Multislice sequenties met een TR van 2000-2500 ms en een TE van 60-80 ms. Tot verwerving van een T1-w beeld, verlagen de TE-waarde op een FSE-of SE_Multislice sequentie of gebruik een GRE sequentie met een hoge en een lage TR TE. Figuur 4 toont een mogelijke in-vivo-aanvraag voor het label stam cell imaging.

4. Representatieve resultaten:

Gelabelde cellen aan te tonen een significant donkerder of negatief contrast effect op de T2-gewogen MR beelden en een helder maken of positief effect op het contrast T1-gewogen MR beelden (figuur 2). Longitudinale MRI en de levensvatbaarheid van tests uitgevoerd 5 dagen na de etikettering geen significante MR-signaal en geen significante invloed op de levensvatbaarheid in vergelijking met ongelabelde controles (gegevens niet getoond) aangetoond.

Figuur 1. Schematische tijdlijn voor het labelen van stamcellen met ijzeroxide nanodeeltjes, ferumoxytol.

Figuur 2. MR beelden van sagittale doorsneden thrrough Eppendorf-buisjes met cellen in een cel pellet. A) Unlabeled controles. B) gelabelde cellen waaruit een significant T2 of negatief contrastmiddel effect op de T2-gewogen FSE of SE_Multislice beeldvorming en een T1 of positief contrastmiddel effect hebben op de T1-gewogen GRE volgorde.

Figuur 3. Sagittale doorsneden van Eppendorf buizen met cellen in cel PELlaat. Zo weinig als 10.000 ferumoxytol gelabelde cellen kan worden gedetecteerd via de T2-w MRI.

Figuur 4. MR visualisatie van ferumoxytol-gelabelde stamcellen geïnjecteerd in muizen-cerebrale ventrikels. A) Axiale, MR beeld van muizen Barin, zonder injectie van USPIO-gelabelde stamcellen. B) Axiale, C) coronale, en D) sagittale MR-beelden beeltenis van de T2, negatief contrast effect van USPIO-gelabelde stamcellen (witte pijlen) geïnjecteerd in een muis hersenen.

Tabel 1. Aantal aanpassingen voor de etikettering cellen in andere schepen.

Verbetering van de effectiviteit van stamcellen engraftments is van cruciaal belang voor de vooruitgang van de regeneratieve geneeskunde. Een niet-invasieve visualisatie techniek voor stamcellen in vivo verhoogt aanzienlijk ons vermogen om de mechanismen die leiden tot een succesvolle innesteling resultaten te begrijpen. Magnetische etikettering voor MR visualisatie, zoals de procedure die wij hebben laten zien, laat in vivo volgen van stamcellen met MRI. Magnetisch gelabelde stamcellen eerder getransplanteerd in doel weefsels en zijn gevisualiseerd tot week met MRI ^7. Op lange termijn etikettering en longitudinale beeldvorming is mogelijk dankzij de lysosomale stapelingsziekten van de ijzeroxide nanodeeltjes in de cellen ^8. Uitdagingen, echter, in overeenstemming met een lange termijn monitoring van ijzer gelabelde cellen. Een van de uitdagingen in verband met longitudinale beeldvorming van ijzer gelabelde cellen is dat als gezonde, levensvatbare cellen woekeren het contrastmiddel wordt verspreid daughter cellen. Verdeling van het contrastmiddel de dochter van cellen is ongelijk en resulteert in een duidelijke verwateringseffect van het contrastmiddel in de tijd. Een tweede uitdaging geassocieerd met lange termijn monitoring van ijzer gelabelde cellen is het onderscheid tussen oorspronkelijk gelabeld, levensvatbare cellen tussen een ingezetene en fagocyten, zoals macrofagen, die mogelijk gefagocyteerd contrastmiddel vrijgelaten uit oorspronkelijk gelabeld, dode cellen ^4. Onze groep heeft aangegeven de verschillen in de lange termijn signaal kinetiek van levensvatbare en apoptotische stamceltransplantaties, die waren gelabeld met ijzeroxide nanodeeltjes anders dan ferumoxytol ^9-11. Toekomstige studies zijn nodig om te bepalen of deze beginselen ook van toepassing op ferumoxytol-gelabelde cel transplantatie.

Terwijl in dit onderzoek naar de mogelijke effecten ferumoxytol herkenbaarheid kan een expositie over de differentiatie capaciteit van stamcellen werd niet onderzocht, hebben eerdere studies aangetoond een SPIO dosisafhankelijk effect op de differendifferentiatie capaciteit en SPIO doses die geen afbreuk doen aan de differentiatie potentieel, wat suggereert, een ferumoxtyol dosis die geen afbreuk doet aan de differentiatie capaciteit van stamcellen kan ook bepaald worden ^{12, 13.}

Grote SPIOs (hydrodynamische diameter> 50 nm) zijn eerder toegepast voor mobiele tracking doeleinden volgende stamcellen etikettering via diverse technieken, waaronder de etikettering eenvoudig incubatie en transfectie met elektroporatie of transfectie middelen zoals protamine, lipofectin en poly-L-lysine (PLL) ^{3 , 13-16.,} Hoewel het niet altijd nodig voor de cel-etikettering met SPIOs, transfectie methoden voor cel-etikettering zijn nuttig gebleken voor het vergemakkelijken van de etikettering en het verhogen van de etikettering efficiency ^15. SPIOs die zijn gebruikt voor cel-etikettering, zijn echter niet meer wordt geproduceerd voor commerciële redenen. Ultrakleine SPIO (USPIO, hydrodynamische diameter <50 nm), zoals ferumoxytol, aan de andere kant nog steeds geproduceerdmaar vereisen de hulp van een transfectie middel om een efficiënte cellulaire opname ^acht te bereiken. Protamine sulfaat is een klinisch toepasbare transfectie-agent die complexen vormen met USPIOs tot fagocytische opname van het contrastmiddel te vergemakkelijken door stamcellen ^17. De combinatie van FDA-goedgekeurde protamine sulfaat met de FDA-goedgekeurde USPIO, ferumoxytol, geeft de mogelijkheid voor klinische vertaling van stamcel-tracking technieken via off-label gebruik van dit middel. Van de nota, heeft ferumoxytol aangetoond een uitstekend veiligheidsprofiel in klinisch onderzoek ^18. Directe visualisatie van de getransplanteerde cellen via een techniek die, zoals aangetoond dat men zou zorgen voor een beter begrip van de factoren die bevorderen of belemmeren een succesvolle stamceltransplantaties en helpen om de meest veelbelovende technieken voor klinische toepassingen te identificeren. Met het gebruik van klinisch toepasbare cel markers en beeldvormende apparatuur, deze beeldvormende techniek is in principe gemakkelijk toegankelijkvoor patiënten die stamceltransplantatie ondergaan.