Merking Stem Cells med Ferumoxytol, en FDA-godkjent Iron Oxide nanopartikler

1. Dag 1

1) Plate celler

1. Plate hMSC i en T75 kolbe på en confluency på 80% i minst 18-24 timer før merking. Se tabell 1 for instruksjon for alternative fartøy.

2. Dag 2

2) Utarbeide merking løsning. Dette preparatet vil label én (1) T75 kolbe på 80% confluency med en konsentrasjon på 400 mg Fe / ml. Se tabell 1 for instruksjon for alternative fartøy.

1. Lag en løsning (løsning 1) ved å blande 1 ml serum-frie medier og 93,1 mL av ferumoxytol (lager: 30 mg / ml) i en 15 ml konisk tube.
2. Lag en annen løsning (løsning 2) ved å blande 1 ml serum-frie medier og 7 mL av protamin sulfat (lager: 10 mg / ml) i en andre 15 ml konisk tube.
3. La hver løsning til hvile i 5 minutter.
4. Legg løsninger 1 og 2 sammen. Bland forsiktig den nye merkingen løsningen. La løsningen for å hvile i 5 minutter å tillate USPIO-protamine sulfat komplekser til form.
5. Tilsett 5 ml serum-frie medier til blandede 2 ml SPIO / protamin sulfat-løsning for en endelig volum på 7 ml.

3) Forbered celler for merking

1. Aspirer media fra cellene.
2. Forsiktig vaske cellene gang med 2-3 ml forvarmet Mg / Ca-free D-PBS eller serum-free media for å skylle bort rester av serum proteiner og eller andre medier komponenter som kan svekke kontrastmiddel opptak og merking effektivitet. Aspirer ut skyll væske.

4) Etikett celler

1. Legg hele 7 ml av merking løsning på celler.
2. Plasser cellene inn i en inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ og la cellene å ruge på etiketten løsningen for 4 timer.
3. Legg til 700 mL av FCS til merking løsning av cellene for å oppnå en endelig serumkonsentrasjon på 10%. Serum er lagt til re-etablere beriket miljøet der cellene er vant til, og å bistå i minimizing celledød som kan resultere fra en brå skift til 24 timers eksponering til en serum-fritt miljø.
4. La cellene til å ruge med merking løsningen for ytterligere 20 timer.

3. Dag 3

5) Utarbeide merkede celler

1. Aspirer merking løsning fra celler.
2. Forsiktig skylle celler med 2-3 ml forvarmet Mg / Ca-free D-PBS. Aspirer ut PBS. Det er viktig å bruke Mg / Ca-free PBS som Mg og Ca vil svekke effektiviteten av Trypsin i neste trinn.
3. Tilsett 2 ml forvarmet 0.05% Trypsin til cellene og vippe flasken frem og tilbake for å sikre at hele overflaten av kolbe er dekket med et tynt lag av Trypsin. Plasser cellene i en inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ og la cellene hvile i 5-7 minutter eller til cellene begynner å løsne fra platen. Det kan være nødvendig å bekrefte avløsning under et mikroskop. Banke forsiktig på sidene av kolbe om nødvendig for å facilitate celle-overflate avløsning.
4. Tilsett 4 ml forvarmet komplett media i kolben for å nøytralisere Trypsin. Forsiktig skylle flasken ved pipettering i Trypsin / media / celle-løsning opp og ned flere ganger. Samle hele løsningen i en 15 ml konisk tube. Sentrifuger cellen løsningen på 400 RCF i 5 minutter.
5. Nøye aspirer supernatanten uten å forstyrre cellen pellet. Suspender cellene i 5 ml av media (serum som inneholder eller serum-fri). Sentrifuger cellen løsningen på 400 RCF i 5 minutter.
6. Gjenta cellen vaske beskrevet i trinn 5.5. I sum vil cellene skylles tre ganger for å fjerne rester, gratis kontrastmiddel i media og på overflaten av cellene.
7. Telle celler på dette punktet for å oppnå den mest nøyaktige celletall, som celler vil gå tapt i løpet av forrige vask. Utfør en levedyktighet test av celler. Cellene er nå klar for senere analyse og eller eksperimentell søknad. MR kan utføres med T1-w og T2-w parametre, fordi selv om ferumoxytol er en T2-w kontrastmiddel, ferumoxytol også utstillinger T1 effekter. Representant T2-w MRI parametre som kan brukes til bilde ferumoxytol merkede cellene inkluderer: FSE eller SE_Multislice sekvenser med en TR på 2000-2500 ms og en TE av 60-80 ms. For å få en T1-w image, redusere TE verdi på en FSE eller SE_Multislice sekvens eller bruke en GRE sekvens med høy TR og lav TE. Figur 4 viser et potensial in vivo søknad merket stamcelleforskningen imaging.

Fire. Representant Resultater:

Merkede celler viser en betydelig mørkere eller negativ kontrast effekt på T2-vektet MR-bilder og en lysere eller positiv kontrast effekt på T1-vektet MR-bilder (figur 2). Langsgående MR avbildning og levedyktighet tester utført fem dager etter merking viste ingen signifikant MR signal og ingen signifikant innvirkning på levedyktighet i forhold til umerkede kontroller (data ikke vist).

Figur 1. Skjematisk tidslinje for merking stamceller med jernoksid nanopartikler, ferumoxytol.

Figur 2. MR-bilder av sagittal tverrsnitt thrrough Eppendorf-rør med celler i en celle pellet. A) Umerket kontroller. B) Merket celler demonstrere en signifikant T2 eller negativt kontrastmiddel effekt på T2-vektet FSE eller SE_Multislice bildebehandling og en T1 eller positiv kontrastmiddel effekt på T1-vektede GRE sekvens.

Figur 3. Sagittal tverrsnitt av Eppendorf rør med celler i celle Pellar. Så lite som 10.000 ferumoxytol merkede celler kan oppdages via T2-w MR imaging.

Figur 4. MR visualisering av ferumoxytol-merket stamceller injiseres i murine cerebrale ventriklene. A) Aksial, MR bilde av murine Barin uten injeksjon av USPIO-merket stamceller. B) Aksial, C) koronale og D) sagittal MR bilder skildrer T2, negativ kontrast effekt av USPIO-merket stamceller (hvite piler) injiseres i en murine hjernen.

Tabell 1. Quantity tilpasninger for merking av celler i alternative fartøy.

Bedre effekt av stamcelleforskningen engraftments er kritisk for fremme av regenerativ medisin. En ikke-invasiv visualisering teknikk for stamceller in vivo øker betydelig vår evne til å forstå mekanismene som fører til vellykkede engraftment utfall. Magnetisk merking for MR visualisering, slik som prosedyren vi har vist, gjør in vivo sporing av stamceller med MR imaging. Magnetisk merkede stamceller har tidligere blitt transplantert inn i target vev og har blitt visualisert opp til uker med MR ^7. Langsiktig merking og langsgående bildediagnostikk er mulig på grunn av lysosomal oppbevaring av jernoksid nanopartikler i cellene ^8. Utfordringer, men stemmer overens med langsiktig overvåking av jern merkede celler. En utfordring forbundet med langsgående avbildning av jern merket celler er at så sunne, levedyktige celler sprer kontrastmiddelet er distribuert til daughter celler. Fordeling av kontrastmiddelet til datteren celler er ujevn og resulterer i en markant utvanning av kontrastmiddel over tid. En annen utfordring forbundet med langsiktig overvåking av jern merkede cellene er å skille mellom opprinnelig merket, levedyktige celler fra bosatt fagocytter, slik som makrofager, som kan ha phagocytosed sluppet kontrastmiddel fra opprinnelig merket, døde celler ^fire. Vår gruppe har identifisert forskjeller i langsiktig signal kinetikk av levedyktige og apoptotiske stamcelle transplantasjon, som hadde vært merket med jernoksid nanopartikler annet enn ferumoxytol ^9-11. Fremtidige studier er nødvendig for å fastslå hvorvidt disse prinsippene gjelder også ferumoxytol-merket celle transplantasjon.

Selv i denne studien de potensielle effektene ferumoxytol merking kunne utstilling om differensiering kapasiteten av stamceller ble ikke undersøkt, har tidligere studier vist en SPIO doseavhengig effekt på forskjellertiation kapasitet og SPIO doser som ikke svekker differensiering potensial, foreslå en ferumoxtyol dose som ikke svekker differensieringen kapasitet på stamceller kan også bestemmes ^{12, 13.}

Stor SPIOs (hydrodynamisk diameter> 50 nm) har vært anvendt tidligere for celle sporing følgende stamcelle merking via ulike merking teknikker inkludert enkle inkubering og transfeksjon med electroporation eller transfeksjon agenter som protamin, lipofectin og poly-L-lysin (PLL) ^{3 , 13-16.,} men ikke alltid nødvendig for celle merking med SPIOs, transfeksjon metoder for celle merking har vist seg gunstig for tilrettelegging for merking og økt merking effektivitet ^15. SPIOs som har vært brukt til celle merking, men er ikke lenger blir produsert av kommersielle grunner. Ultrasmall SPIO (USPIO, hydrodynamisk diameter <50 nm) som ferumoxytol, er derimot fortsatt blir produsertmen krever hjelp av en transfeksjon middel for å oppnå effektiv cellulære opptaket ^8. Protamin sulfat er en klinisk anvendelig transfeksjon agent som danner komplekser med USPIOs å lette phagocytic opptaket av kontrastmiddelet av stamceller ^17. Kombinasjonen av FDA-godkjente protamin sulfat med FDA-godkjente USPIO, ferumoxytol, gir mulighet for klinisk oversettelse av stamcelleforskningen sporing teknikker via off-label bruk av denne agenten. Av notatet, har ferumoxytol vist en utmerket sikkerhetsprofil i kliniske studier ^18. Direkte visualisering av det transplanterte cellene via en teknikk som den som demonstrerte ville tillate for en bedre forståelse av hvilke faktorer som fremmer eller forringe vellykket stamceller transplantasjoner og bidra til å identifisere de mest lovende teknikkene for kliniske applikasjoner. Med bruk av klinisk gjeldende celle markører og bildebehandling utstyr er dette avbildningsteknikk i prinsippet lett tilgjengeligtil pasienter som gjennomgår stamcelle transplantasjon.