Märkning stamceller med Ferumoxytol, en av FDA godkänd järnoxid nanopartiklar

1. Dag 1

1) Plate celler

1. Plate hMSC i en T75 kolv vid en confluency 80% minst 18-24 timmar före märkning. Se tabell 1 för instruktion för alternativa fartyg.

2. Dag 2

2) Förbered märkning lösning. Denna förberedelse kommer etiketten en (1) T75 kolv vid 80% confluency med en koncentration av 400 mikrogram Fe / ml. Se tabell 1 för instruktion för alternativa fartyg.

1. Skapa ett (lösning 1) genom att blanda 1 ml serum-fria medier och 93,1 ìl ferumoxytol (lager: 30 mg / ml) i ett 15 ml koniskt rör.
2. Skapa en andra (lösning 2) genom att blanda 1 ml serum-fria medier och 7 ìl protaminsulfat (lager: 10 mg / ml) i en andra 15 ml koniska rör.
3. Låt varje lösning vila i 5 minuter.
4. Lägg lösningar 1 och 2 tillsammans. Blanda försiktigt den nya märkningen lösningen. Låt lösningen vila i 5 minuter för att tillåta USPIO-Protamin sulfat komplex bildas.
5. Tillsätt 5 ml serum-fria medier till blandade 2 ml SPIO / protaminsulfat lösning för en slutlig volym på 7 ml.

3) Förbered celler för märkning

1. Aspirera media från cellerna.
2. Försiktigt tvätta celler gång med 2-3 ml förvärmda Mg / Ca-free D-PBS eller serum-fria medier att skölja bort rester av serumproteiner och eller andra media komponenter som skulle kunna försämra upptaget kontrastmedel och märkning effektivitet. Sug ut spola vätska.

4) Label celler

1. Lägg hela 7 ml märkning lösning celler.
2. Placera celler i en inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ och låta cellerna att inkubera i märkningen lösningen för 4 timmar.
3. Tillsätt 700 ìl av FCS för märkning lösning av cellerna för att nå en slutlig serumkoncentration på 10%. Serum läggs till återupprätta berikad miljö där cellerna är vana vid, och att hjälpa minimizing celldöd som kan bli följden av en abrupt övergång till 24 timmars exponering för ett serum miljö.
4. Låt cellerna att inkubera med märkning lösningen för ytterligare 20 timmar.

3. Dag 3

5) Förbered märkta celler

1. Sug märkning lösning från celler.
2. Försiktigt spola cellerna med 2-3 ml förvärmda Mg / Ca-free D-PBS. Sug ut PBS. Det är viktigt att använda Mg / Ca-fri PBS som Mg och Ca försämrar effektiviteten av trypsin i nästa steg.
3. Tillsätt 2 ml förvärmda 0,05% Trypsin till cellerna och luta flaskan fram och tillbaka för att se hela ytan på kolven är täckt med ett tunt lager av trypsin. Placera celler i en inkubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ och låta cellerna vila i 5-7 minuter eller tills cellerna börjar lossna från plattan. Det kan bli nödvändigt att bekräfta lossnar under ett mikroskop. Knacka försiktigt på sidorna av kolven om det är nödvändigt för att fagrinden underlättar cellytan lossnar.
4. Tillsätt 4 ml av förvärmda komplett media till kolven för att neutralisera Trypsin. Försiktigt skölja kolven genom att pipettera den Trypsin / media / cell lösningen upp och ner flera gånger. Samla hela lösningen i ett 15 ml koniska rör. Centrifugera cellen lösningen vid 400 RCF i 5 minuter.
5. Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i 5 ml media (serum som innehåller eller serum-fri). Centrifugera cellen lösningen vid 400 RCF i 5 minuter.
6. Upprepa cellen tvätta beskrivs i steg 5,5. Totalt kommer cellerna sköljas tre gånger för att avlägsna rester, gratis kontrastmedel i media och på ytan av cellerna.
7. Räkna celler vid denna punkt för att uppnå den mest exakta celltal, som celler går förlorade under tidigare tvätt. Utför en livskraften test av celler. Celler är nu redo för senare analys och eller experimentella program. MR kan utföras med T1-w och T2-w parametrar, för även ferumoxytol är en T2-w kontrastmedel, utställningar ferumoxytol också T1 effekter. Representant T2-w MRI parametrar som kan användas för att bilden ferumoxytol märkta celler inkluderar: FSE eller SE_Multislice sekvenser med en TR för 2000-2500 ms och en TE på 60-80 ms. Att förvärva en T1-w bild, minska TE värde på en FSE eller SE_Multislice sekvens eller använda en GRE sekvens med hög TR och lågt TE. Figur 4 visar en potential in vivo ansökan märkt stamceller avbildning.

4. Representativa resultat:

Märkta celler visar en betydande mörkare eller negativ kontrast effekt på T2-viktad MR-bilder och en ljusnande eller positiv kontrast effekt på T1-viktade MR-bilder (figur 2). Längsgående MR och tester livskraft utförs 5 dagar efter märkningen visade ingen signifikant MR-signal och ingen betydande inverkan på lönsamheten jämfört med omärkta kontroller (data visas inte).

Figur 1. Schematisk tidsplan för märkning av stamceller med järnoxid nanopartiklar, ferumoxytol.

Figur 2. MR bilder av sagittal tvärsnitt thrrough Eppendorf-rör med celler i en cell pellets. A) Utan etikett kontroller. B) märkt celler visar en betydande T2 eller negativ kontrastmedel effekt på T2-viktad FSE eller SE_Multislice bildbehandling och ett T1-eller positiva kontrastmedel effekt på T1-viktade GRE sekvens.

Figur 3. Sagittala tvärsnitt av Eppendorf-rör med celler i cell PELlåter. Så lite som 10.000 ferumoxytol märkta celler kan upptäckas via T2-w MR.

Figur 4. MR visualisering av ferumoxytol märkt stamceller injiceras i murina cerebrala ventriklarna. A) Axial, MR bild av murina Barin med något tillskott av USPIO märkt stamceller. B) Axial, C) koronalt och D) sagittal MR-bilder som skildrar T2, negativ kontrast effekt USPIO märkt stamceller (vita pilar) injiceras i en murin hjärna.

Tabell 1. Kvantitet anpassningar för märkning av celler i alternativa fartyg.

Att förbättra effektiviteten i engraftments stamceller är avgörande för främjandet av regenerativ medicin. En icke-invasiv visualisering teknik för stamceller in vivo ökar kraftigt vår förmåga att förstå mekanismer som leder till framgångsrik engraftment resultat. Magnetisk märkning för MR visualisering, såsom förfarandet har vi visat, ger in vivo-spårning av stamceller med MR. Magnetiskt märkta stamceller har tidigare varit transplanterats in målvävnad och har visualiserat upp till veckor med MR ^7. Långsiktiga märkning och längsgående bildbehandling är möjligt på grund av det lysosomala lagring av nanopartiklar järnoxid i celler ^8. Utmaningar dock göra stämmer överens med långsiktig övervakning av järn märkta celler. En utmaning i samband med längsgående avbildning av järn märkta celler är att så friska, livskraftiga celler föröka kontrastmedlet distribueras till daughter celler. Fördelning av kontrastmedlet till dotter celler är ojämn och resulterar i en markant utspädningseffekt av kontrastmedlet över tiden. En andra utmaning i samband med långsiktig övervakning av järn märkta celler skilja mellan ursprungligen märkt, livskraftiga celler från inhemska fagocyter såsom makrofager, som kan ha fagocyteras släppt kontrastmedel från ursprungligen märkt, döda celler ^4. Vår grupp har identifierat skillnader i långsiktig signal kinetik av livskraftiga och apoptotiska stamcellstransplantation, som varit märkta med nanopartiklar järnoxid än ferumoxytol ^9-11. Framtida studier behövs för att avgöra om dessa principer också tillämpas på ferumoxytol-märkta cell transplantationer.

Även i denna studie de potentiella effekterna ferumoxytol märkning skulle kunna ställa ut på differentiering kapacitet stamceller har inte undersökts, har tidigare studier visat en SPIO dosberoende effekt på skilldifferentiering kapacitet och doser SPIO som inte försämrar differentiering potential, vilket tyder på en ferumoxtyol dos som inte försämrar differentiering förmåga av stamceller kan också bestämmas ^{12, 13.}

Stora SPIOs (hydrodynamiska diameter> 50 nm) har tillämpats tidigare för ändamål cell spåra efter stamcellstransplantation märkning via olika märkning tekniker inklusive enkel inkubation och transfektion med elektroporation eller transfektion medel såsom protamin, lipofectin och poly-L-lysin (PLL) ^{3 , 13-16.,} men inte alltid nödvändigt för cell märkning med SPIOs, transfektion metoder för cell-märkning har visat sig vara fördelaktig för att underlätta märkning och ökad märkning effektivitet ^15. SPIOs som har använts för cell märkning, dock inte längre produceras av kommersiella skäl. Ultrasmall SPIO (USPIO, hydrodynamiska diameter <50 nm) som ferumoxytol, är däremot fortfarande producerasmen kräver hjälp av en transfektion agent för att uppnå en effektiv cellulärt upptag ^8. Protaminsulfat är en kliniskt tillämplig transfektion agent som bildar komplex med USPIOs att underlätta fagocytiska upptag av kontrastmedlet av stamceller ^17. Kombinationen av FDA-godkända protaminsulfat med FDA-godkända USPIO, ferumoxytol ger potential för klinisk översättning av stamceller spåra tekniker via off-label användning av detta medel. Notera har ferumoxytol visat en mycket god säkerhetsprofil i kliniska prövningar ^18. Direkt visualisering av de transplanterade cellerna via en teknik som visat en skulle möjliggöra en bättre förståelse av de faktorer som främjar eller försämrar framgångsrika transplantationer stamceller och bidra till att identifiera de mest lovande teknikerna för kliniska tillämpningar. Med hjälp av kliniskt tillämpliga cell markörer och bildutrustning, detta är bildteknik i princip, lättillgängligatill patienter som genomgår stamcellstransplantation.