Annotatie van Plant functie van een gen via gecombineerde Genomics, metabolomics en Informatica

Tohge, T., Fernie, A. R. Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics. J. Vis. Exp. (64), e3487, doi:10.3791/3487 (2012).

Gezien het steeds groter aantal model plantensoorten waarvoor complete genoomsequenties beschikbaar zijn en de overvloed van biologische rijkdommen, zoals knock-out mutanten, wilde toetredingen en geavanceerde broedpopulaties, is er een stijgende last voor gen-functionele annotatie. In dit protocol annotatie van planten-gen functie met behulp van gecombineerde co-expressie gen-analyse, is metabolomics en informatica voorzien (figuur 1). Deze benadering is gebaseerd op de theorie van het gebruik van target genen van bekende functie om de identificatie van niet-geannoteerde genen waarschijnlijk betrokken zijn bij een bepaalde metabolische proces, met de identificatie van doelverbindingen via metabolomics. Strategieën worden naar voren gebracht voor de toepassing van deze informatie op de bevolking die door zowel de voor-en reverse genetics benaderingen in weerwil van geen van deze zijn moeiteloos. Door logisch gevolg deze aanpak kan ook worden gebruikt als een benadering van onbekende pieken van nieuwe of specifieke se karakteriserencondary metabolieten in de beperkte weefsels, plantensoorten of stress behandeling, die op dit moment is het belangrijke proces tot het begrijpen van planten metabolisme.

1. Monstervoorbereiding

1. Plantaardige materialen worden geoogst en direct ingevroren.
2. Ingevroren plantaardige materialen gemalen door mixer molen (of mortel) en opgeslagen in Falcon buis of eppendorfbuisje bij -80 ° C.

2. Extraction voor de metaboliet Profiling

1. Aliquot bevroren plantmateriaal in een 2 ml Eppendorf buis.
2. Voeg 5 pi extractiebuffer milligram versgewicht bevroren plantmateriaal.
3. Voeg een metaal (of gilconia) kogel en gehomogeniseerd bevroren poeder met de mixer Mill 2 min bij 25 ls ^-1.
4. Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 rpm.
5. Breng de bovenstaande aan centrifugaalfilter NANOSEP.
6. Centrifugeer 2 min bij 4.000 tpm.
7. Breng de bovenstaande nieuwe Eppendorf buis en bewaren bij -20 ° C tot gebruik.

3. Metaboliet Profilering van LC-MS

1. Stel HPLC en controleer de temperatuur van kolom oven en monsterhouder.
2. Stel MS conditie en controleer de staat van vacuüm-en verwarmings-capillair.
3. Voer m / z kalibratie van MS detector.
4. Overdracht van 50 pi van extracten glazen flesje voor LC-MS.
5. Injecteer 5 ul van extracten naar LC-MS.

4. Data-analyse

1. Configureren Xcalibur of Metalign ⁴ en selecteer de data-analyse te verwerken.
2. Maak een tabel van de gedetecteerde pieken van uw interesse in overeenstemming met de klasse verbindingen in tabel I.
3. Identificeer pieken door co-elutie van standaard verbindingen.
4. Aantekeningen voorzien gedetecteerd pieken met behulp van MS ² analyse, literatuuronderzoek, metaboliet database (figuur 2, ^12,13).

5. Voorspelling van metabolische route

1. Construct een mogelijke ingang met gedetecteerde verbindingen. Voorspelling van pad met piek aantekeningen moet worden gebaseerd op de chemische structuur van de gedetecteerde verbindingens door het voorspellen van het koppelen van enzymatische functies op de metabole route ^13. Het structureren van biosynthetische stappen moeten worden uitgevoerd met nauwkeurige piek annotatie. Maar bepalen gedetailleerde chemische structuur, bijvoorbeeld glycaangedeelte is niet noodzakelijk deze stap, door voorspelling van suiker gedeelte en adductiestand zeer moeilijk te identificeren door MS-analyse. Bepaling van het soort suiker, zoals hexoside en pentoside zullen geïdentificeerd worden door enzymatische assay van suiker donor bij de laatste stap van het project. Meestal bouw van de voorspelling van de weg dient te worden uitgevoerd als kleine molecule is intermediair van grotere moleculen, behalve in de enkele gevallen, zoals uitdroging reactie. Lijst van atomaire molecuulgewicht, bijvoorbeeld 16 m / z tussen-H en-OH groep (oxidatie) 14 m / z (koolstofatoom) voor verschil-OH en-OMe (methylering) en 162 m / z ( MW-H ₂ O) voor hexose (glycosylering), is nuttig voor het voorspellen. Bepaling vanwijziging type met correlatie analyse van weefsels specifieke helpt voorspelling van de metabole route. Database van de algemene metabole route, zoals KEGG database ( http://www.genome.jp/kegg/ ) en PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), is zeer effectief voor het voorspellen van metabole route van uw interesse.

6. Voorbereiding van Gene Lijst met Arabidopsis orthologe Gene ID

1. Download gen ID-lijst van genomische database.
2. Voeg Arabidopsis gen ID van orthologe gen, in het geval van uw doelgroep plant is niet Arabidopsis.
3. Maak een lijst van genen in je pad-of-interest. Annotatie van Arabidopsis pad gegevens en gen-familie gegevens beschikbaar zijn in TAir website ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Als u een lijst opgesteld van Arabidopsis orthologe genen, kunt u vervolgens combine ze.

7. Co-uitgedrukt Gene Analysis

1. Test het bereide gen ID-lijst om de beste database voor je pad zoeken op het controleren van de correlatie met behulp van bekende gen-paren in je pad-of-interest (Tabel II). Als co-expressie database of genexpressie-database zijn niet beschikbaar in de plant van uw interesse, moet Arabidopsis co-expressie-database worden gebruikt met een lijst van Arabidopsis orthologe genen. Bij gerst, rijst kan, populier, tarwe, soja Medicago en co-expressie analyse van plantensoorten worden (Tabel II).
2. Bouw het kader voor uw doelgroep co-expressie netwerk op basis van de aansluitingen van de bekende genen in je pad-of-interest.
3. Voeg gecorreleerde kandidaat-genen (r <0,4 ~ 0,90, binnen de geschatte waarde van de coëfficiënt waarde tussen de aansluitingen van de bekende genen in je pad-of-interest) en controleren hun gen-annotatie in uw predicted families om de aansluitingen van dit netwerk voor het vinden van de beste kandidaat-genen (figuur 3). Drempel van de coëfficiënt de waarde moeten worden gecoördineerd op basis van netwerkstructuur en de dichtheid van gecorreleerde genen.
4. Maak lijst van genen die je in staat bent om in te perken als gespecialiseerde om uw doelgroep pad.
5. Controleer genexpressie van het orgel specifieke kenmerken en stress responsen van uw kandidaat-genen.

8. Integratie van alle informatie naar New Pathways Voorspel

1. Voeg goed gekarakteriseerde genen die zijn voor de zoekopdracht van de co-expressie-analyse gebruikt om de voorspelde metabole route.
2. Controleer ongekarakteriseerde delen in deze route, bijvoorbeeld ongekarakteriseerde enzymatische stappen, transport eiwitten en transcriptiefactoren.
3. Voorspel het meest geschikt gen annotatie voor deze ontbrekende ongekarakteriseerde stappen.
4. Combineer de resultaten van de metaboliet profilering en kandidaat-genen van in silico gene expressie gebaseerd op de voorspelde route.
5. Regel uw kandidaat-genen op het voorspelde pad op basis van gen-functie, bijvoorbeeld, acetyltransferase voor geacetyleerde metaboliet, glycosyltransferase voor glycoside, P450 voor geoxideerd verbinding. Fylogenetische bomen analyse van aminozuursequenties is bruikbaar voor enkele brede genfamilie zoals P450 en glycosyltransferase.
6. Controleer de consistentie van weefsel specifieke kenmerken of stress responsen tussen metaboliet accumulatie en gen-expressie niveau van de kandidaat-genen.
7. Controleer de verbindingen met andere stofwisseling voor het leveren van substraat en stress responsieve genen.

9. Experimenten voor Gene Identificatie Met behulp van Bio-middelen

1. Controleer de beschikbaarheid van Bioresources biedt om te experimenteren voor de kandidaat-gen identificatie.
2. Voer een experiment voor de identificatie van gen-functie met behulp van biologische rijkdommen, zoals KO mutant bibliotheek en volledige lengte cDNA bibliotheek. Thij experimenten voor functionele identificatie van genen met de voorbereiding van overexpressie planten en knock-out mutanten, enzymatische assay en promotor bindingstest, moeten worden uitgevoerd voor de beste kandidaat genen in je voorspelling. Recombinant eiwit assay voor de karakterisering van eiwit eigenschappen en bereiding van overexpressie planten beter worden uitgevoerd na bevestiging van metabolietenprofiel met KO mutant door het in aanzienlijk langer recombinant eiwit en gen klonen voorbereiden transformatie.

10. Representatieve resultaten

De procedure van de geïntegreerde analyse beschreven in dit protocol heeft vele mogelijkheden, afhankelijk van specifieke experimentele doel en de keuze van biologische en analytische combinaties. Keuze van de procedures en de experimentele opzet moet worden goed uitgevoerd, op basis van uw doelgroep pad, verbindingen en plantensoorten. De integratie strategie beschreven in dit protocol is foc gebruikt op annotatie van plantaardige gen functie en de ontdekking van nieuwe genen functies met een efficiënt gebruik van verschillende bio-en data-bron. Verwachte resultaat is beloofd te voorzien van de enige geval van sluitende voorspelling. Dit feit geeft aan dat als er genoeg bewijzen kunnen niet worden gegeven door combinatie profielen, experiment niet worden gestart. Daarom in alle gevallen kunnen extra voorafgaandelijke zoals gerichte genexpressie door RT-PCR, ondersteunen de voorspelling van genfunctie. Nauwkeurigheid en juistheid van de voorspelling correleert hoger, afhankelijk van kwalitatieve verschil en het aantal van de variatie van combinatie. Daarnaast kunnen goede kandidaten en geldige resultaten alleen afkomstig zijn van nauwkeurige voorspelling van routes. Peak annotatie moet worden uitgevoerd door een combinatie van verschillende manieren, bijvoorbeeld literatuuronderzoek, referentie plantenextract, MS ⁿ analyse, orgel specificiteit en mutant analyse ^13.

1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/>
Figuur 1. Overzicht van de experimentele stroom van gen-annotatie via gecombineerde aanpak. In sommige gevallen, projecten te beginnen met de ontdekking van een nieuwe piek die wordt gedetecteerd in bijzondere voorwaarden of weefsels, en de wens om haar rol te begrijpen binnen het metabolisme. In andere gevallen het doel van het project is genidentificatie of ontdekking van belangrijke regulerende factoren, zoals de transcriptiefactoren. Ontwerp van experiment worden geschaafd een gegevensverzameling die duidelijk verschillen van metabolietniveaus in het doelgebied pad met een breed scala van weefselmonsters van verschillende organen toont, en differentieel gekweekte planten of planten die aan stress, en het onderwerpen van het materiaal metaboliet profilering. Mutanten en transgene planten en QTL onderdak fokmateriaal vertegenwoordigen ook geschikt genetisch materiaal voor deze studies. Voorspelling van nieuwe pad moeten zorgvuldig worden uitgevoerd met nauwkeurigepiek annotatie en combinatie aanpak met verschillende soorten metabolotype zoals orgel effecten en stress responsen op basis van genexpressie gegevens van uw pad-of-interest. In de laatste stap moet metaboliet en transcript profilering uitgevoerd worden die uiteindelijk, in combinatie met in silico analyse van web-middelen en de in vitro karakterisatie van genexpressie via heterologe expressie, leiden tot de bevestiging van het gen kandidaat en opheldering van de functie en positie binnen een metabole route. Afkortingen: QTL, kwantitatieve Trait Loci.

Figuur 2. Werk stroom van combinatievormen aanpak voor piek annotatie. Een procedure voor piek identificatie en annotatie door de standaard verbinding, vergelijking van de wild-type en knock-out mutanten, multi-dimensionale massaspectrometrie van de doel-piek verwijst naar de massa spectra van de zuivere compond uit de databases ^12. Afkortingen: DB, database, KO, knock-out, 1-D, een-dimensionale, 2-D, twee-dimensionale, NMR, nucleaire magnetische resonantie, IR, infra-rood; MS ^n, massa-massa spectrometries.

Figuur 3. Voorbeeld co-regulering netwerk analyse van de anthocyaan pad. Coëxpressie analyses werden uitgevoerd met behulp van de PRIME ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) gebaseerd op de dataset van ATTEDII versie 3 ^8,2 met de Pajek programma ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Positieve correlaties (r <0,5) worden gebruikt om netwerk verbindingen te maken. Rode knoop: twaalf anthocyaan enzymatische genen (At5g13930, CHS, TT4, chalconsynthase, At3g55120, CHI, TT5, chalcon isomeriseren, At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hydroxylase, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoïde 3'-hydroxylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoïde 3 - O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reductase, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidine synthese; At4g14090, A5GT, anthocyaan 5 - O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 "XT, vermeende anthocyaan 3 - O-glucoside 2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyaan 5 - O-glucoside 6'' '- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyaan 3 - O-glucoside 6 "- O - p-coumaroyltransferase) en twee transcriptiefactoren voor anthocyaan productie (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) werd gebruikt voor het zoeken van kandidaat-genen kandidaat-genen werden gevonden door een "kruispunt van de sets" zoeken met een drempelwaarde met een coëfficiënt van r <./ Em >> 0,50 bevraagd door de kruising van de sets door bevraagd alle genen (Veertien anthocyaan biosynthetische genen). Een co-expressie-netwerk, inclusief gecorreleerde kandidaat-genen (68 genen) en bevraagd genen (14 genen), werd opnieuw gebouwd door een "interconnectie van sets" zoeken met r> 0.50 met behulp van de PRIME-database. De output bestanden die zijn geformatteerd met bestand een. 'Net' van de Eerste database en netwerken werden getekend met behulp van Pajek software. Blauwe knooppunt geeft aan kandidaat-genen die correleren met anthocyaan genen.

Tabel I. De belangrijkste secundaire metabolieten in model plantensoorten.

Tabel II. Beschikbaar genexpressie-database voor het in silico co-expressie analyse.

Gezien het feit dat transcriptomics en metabolomics technologieën zijn gebruikt voor enkele jaren het proces van data-integratie voor metabolomics bijgestaan ​​gen annotatie begint meestal met de identificatie van een nieuwe piek vertegenwoordigt een onbekende metaboliet. Dit feit leidt tot de volgende fase, die is het evalueren van kwantitatieve variatie in metaboliet pieken of de nieuwe kandidaat-genen dacht verantwoordelijk te zijn voor hun biosynthese. De strategie beschreven in dit protocol, echter, heeft drie grote problemen i) moeilijke piek annotatie, ii) de complexiteit van de route voorspelling, iii) de resolutie van gen-informatie en de kwaliteit van genexpressie data. Om het eerste probleem tegen te gaan, moet piek annotatie worden uitgevoerd met co-elutie van standaard verbindingen of combinatoriële benadering gebruik te maken van informatie uit MS ⁿ analyse, referentie-extract, mutant-analyse, metaboliet database en literatuuronderzoek (figuur 2, ^12). Voor sWEEDE probleem, pad voorspelling alleen worden verkregen door de juiste piek annotatie. Echter, metaboliet profilering van weefsel specificiteit kan ook ondersteuning piek annotatie, want metaboliet accumulatie moet worden gecorreleerd met het gen uitingen van gerelateerde genen. Daarom combinatie profielen van verschillende weefsels en de groei-omstandigheden kan nuttig zijn voor deze tweede probleem. Het derde probleem met betrekking tot de resolutie van de genetische informatie is afhankelijk van de voortgang van de sequence data. Bij het model plant zonder voltooiing van genoomsequentie, co-expressie analyse met ortholoog genen in andere planten model nuttig. Gedetailleerde aanpassing vergeleken en stamboom analyse aminozuursequentie kan steunen modelorganismen verbinding met andere soorten.

Dit protocol is geschikt voor alle stofwisseling. Het is het meest efficiënt in de analyse van tussen-en secundaire metabolisme die goed worden gekenmerkt te worden onderworpen aan een sterke transcriptionele cCONTROLE ^1,5,11,16. In sommige voorbeelden co-expressie analyse geslaagd worden uitgevoerd zwavel assimilatie genen voor β-oxidatie, vertakte keten aminozuursequentie degradatie, chlorofyl verdeling en lysine katabolisme ³ celwand metabolisme ^10,7 en lichtsignaal cascade ^14. Annotatie van gen-functie via gecombineerde genomics, metabolomics en informatica is niet alleen voor biosynthetische genen en directe regulator van de transcriptie factor, maar ook voor het begrijpen van fysiologische proces en respons (zie voorbeeld figuur 3. ^14).

Het ontwikkelen van deze aanpak van model planten van het gewas soorten, metabole vergelijking van de in plantensoorten is een krachtige aanpak in een aantal algemene stofwisseling. Als bijvoorbeeld dezelfde samenstelling is gedetecteerd in verschillende planten en sommige ortholoog genen zijn gevonden in deze planten, cross species co-expressie analyse met ortholoog genen voorzien strong ondersteuning voor uw voorspelling. Deze benadering kan worden uitgevoerd in Arabidopsis populier, medicago naast belangrijke gewassen, zoals gerst, rijst, tarwe en soja door co-expressie analyse van plantensoorten ⁽⁶ PlaNet: http://aranet.mpimp-golm.mpg . de / ,, ^9, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ , zie voorbeeld ^15).

Geen belangenconflicten verklaard.

Wij danken prof. Kazuki Saito in RIKEN PSC en Dr Bjoern Usadel in MPIMP voor nuttige discussies. TT wordt ondersteund door een beurs van de Alexander von Humboldt Stichting.

1. Aharoni, A., Keizer, L.C.P., Bouwmeester, H.J., Sun, Z.K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H.A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R.C.H., van der Voet, H., Jansen, R.C., Guis, M., Mol, J., Davis, R.W., Schena, M., van Tunen, A.J., & O'Connell, A.P. Identification of the SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays. Plant Cell. 12 647-661 (2000).
2. Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M.Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., & Saito, K. PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics. In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).
3. Araujo, W.L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T.R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I.A., Leaver, C.J., & Fernie, A.R. Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria. Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).
4. De Vos, R.C.H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J.J.B., Bino, R.J., & Hall, R.D. Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nat. Protoc. 2 (2007).
5. Hirai, M.Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O.I., Shibata, D., & Saito, K. Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007.
6. Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F.M., Wilkins, O., Campbell, M.M., Fernie, A.R., Usadel, B., Nikoloski, Z., & Persson, S. PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species. Plant Cell. 23, 895-910 (2011).
7. Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F.M., Bringmann, M., Usadel, B., & Persson, S. Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis. Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).
8. Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., & Ohta, H. ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).
9. Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., & Shibata, D. CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants. Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).
10. Persson, S., Wei, H.R., Milne, J., Page, G.P., & Somerville, C.R. Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).
11. Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., & Saito, K. Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes. Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).
12. Tohge, T. & Fernie, A.R. Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide. Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).
13. Tohge, T. & Fernie, A.R. Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function. Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).
14. Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., & Fernie, A.R. Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation. Plant Signal Behav. 6, In Press, (2011).
15. Tohge, T., Ramos, M.S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., & Fernie, A.R. Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole. Plant Physiol. Epub ahead of print, PMID: 21949213 (2011).
16. Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., & Saito, K. Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.