Préparation d'Intact disques intervertébraux Queue bovine pour la culture d'organe

1. La récolte du disque intervertébral

1. Whole queue bovins longueur est obtenue à partir d'un abattoir local, si possible sans la peau car la présence de la peau augmente le risque de contamination (figure 2).
2. Préparer grande planche à découper et préparer la station de travail et des instruments stériles au sommet d'une planche à découper (Fig. 2).
3. Préparer sous le capot de la gaze stérile à flux laminaire stérile humidifié avec du chlorure de sodium à 0,9% contenant du citrate de sodium 55mm et mis dans chaque puits de la plaque de 6 puits.
4. Préparer un bassin et diluer 1:100 solution de Betadine avec de l'eau du robinet.
5. Plonger la queue entière bovine dans un bassin contenant une solution de Bétadine 1% pendant 5 min.
6. Brièvement la queue à sec avec une gaze stérile et le placer sur la station de travail stérile.
7. Retirez délicatement les muscles autour de la queue avec lame de bistouri n ° 22.
8. Hacher l'écart des pièces de la queue qui ne sont pas nécessaires, généralement les deux extrémités de la queue, qui contiennent relativement grandes et très petites entreprisesIVD (Fig. 3).
9. Garniture davantage les muscles et les tendons autour de la DIV en utilisant lame de bistouri n ° 10. Attention à ne pas couper l'anneau externe des disques.
10. Marquer la partie antérieure de l'IVD avec un marqueur de peau chirurgical (cette étape est facultative, elle permet de déterminer le centre de rotation axiale dans notre bioréacteur).
11. Localisez le point de connexion IVD et vertèbres de la queue en se déplaçant doucement. Sentez-vous la frontière entre l'IVD et d'os avec le côté mat de la lame d'un scalpel. Le site de clivage devrait être de 1-2 mm de distance de l'IVD vers la vertèbre. Placez personnalisée fait le porte-lame industrielle sur le site de clivage (Fig. 4).
12. Cleave IVD et vertèbre par martelage sur le dessus du support de lame sur-mesure industrielle (Fig. 3).
13. Répétez de l'autre côté de la connexion IVD vertèbre.
14. Enveloppez isolés DIV avec une gaze stérile humidifié avec du chlorure de sodium à 0,9% contenant du citrate de sodium 55mm.
15. Continuer l'isolement des DIV à l'échantillon numéro désiré (généralement autour de 6 peutêtre récoltés avec un diamètre de 10-20 mm).
16. Connectez le système de lavage à jet (Zimmer, Inc.) Avec une solution stérile de Ringer lactate, 5L sacs sont d'une taille utile (alternativement PBS stérile ou 0,9% de solution saline).
17. Tenir la DIV avec une pince et le jet-lavage des deux côtés de la surface des plateaux vertébraux en utilisant Zimmer Pulsavac jet de lavage du système (Fig. 1C). Le pistolet à jet devrait être tourné sur la surface des plateaux vertébraux à un angle compris entre 30 - 60 ° pendant environ 30s de chaque côté. (Fig. 1 et 7)
18. Mettez la DIV de revenir à la plaque de 6 puits et envelopper avec une gaze humidifiée tout jet de lave un autre échantillon du disque.
19. DIV sont prêts pour la culture d'organes et en aval des applications (par exemple la viabilité cellulaire, le chargement mécanique, la culture d'organes) (Fig. 1D).

2. Les résultats représentatifs

Résultat des mesures pour juger une préparation réussie du disque intervertébral peut être une expérience de diffusion où un colorant fluorescent de faible poids moléculaire (Procion par exemple rouge)est préparée comme une solution à 1% dans PBS ^2. L'IVD est alors maintenu avec au moins 100 ml de solution de colorant et le colorant est alors autorisé à diffuser passivement dans l'IVD pour 24h dans le gonflement libre. L'IVD est alors flash-congelés dans l'azote liquide et ramené à température ambiante et déshydraté par une série de transferts d'acétone (première pré-refroidi dans -80 ° C, puis à -20 ° C, puis 4 ° C et enfin à la température ambiante ). Le disque peut ensuite être intégrées dans le poly-méthyl-acrylate de méthyle (PMMA) et couper avec une lame tranchante pour produire 100 um d'épaisseur des sections. Ces sections peuvent ensuite être consultés par n'importe quel microscope fond clair standard, mais préférentiellement par l'utilisation de la microscopie à fluorescence, depuis Procion Red émet une fluorescence rouge (fig. 5-6). Le trabeculi de la surface osseuse apparaissent très propre après l'étape lavaging jet (Fig. 7).

Paramètres pour une culture d'organe réussie sont d'abord l'absence de contamination, la viabilité des cellules maintenues (fig. 8-9), la hauteur discale etglobale "de l'intégrité du disque", mesurée avec des coupes histologiques et de safranine O / vert rapide tache ou hématoxiline Meyer 3. Nous avons développé des protocoles et des macros publiés ailleurs ^4,5 à tacher les tissus du disque en direct et de balayer la viabilité des cellules en 3D en utilisant un microscope confocal à balayage laser et le kit de coloration vivants / morts (Molecular Probes, Invitrogen, Bâle, Suisse). Nous avons également développé une macro et de routine à effectuer la cellule de comptage automatique pour estimer la viabilité des cellules dans les tissus 3D ou 3D transporteurs utilisant la plateforme NIH ImageJ ^4-6. Protocoles de rechange ont été proposées pour déterminer la viabilité cellulaire des cellules du disque par digestion initiale à l'aide la digestion séquentielle de la matrice extracellulaire en utilisant la pronase et la collagénase de type 2 et ensuite de colorer la suspension cellulaire ^7. Une version antérieure du protocole impliquait une étape d'incubation dans du PBS contenant dix fois plus concentrée de concentration de pénicilline / streptomycine pendant 10 minutes après la récolte des disques d'orgue avant la cuLTURE. Avec l'étape de lavage à jet cette étape devient obsolète puisque cette étape semble bénéfique à des fins de culture.

Figure 1. Vue d'ensemble des étapes méthodologiques pour préparer bovines coccygienne disques intervertébraux avec plateaux intact et une fine couche (1-2mm) de l'os. Vue schématique A) du disque intervertébral (DIV) et ses voies nutritionnelles. B) Procédure à découper la DIV avec un personnalisées porte-lame et une lame industrielle forte. C) étape de lavage Jet pour assurer la viabilité des cellules de haute et de permettre l'échange de nutriments gardant les plateaux et 1-2 mm d'os attachée sur les deux côtés. D) Enfin, la DIV peut être cultivé dans la chambre de spécimens d'un bioréacteur ou être utilisé pour toute application en aval.

Figure 2 TOP:. Pleine longueur de la queue fraîches bovines (idéalement bénéficier du droit àINED dans les 2-3 heures post-mortem afin d'assurer la viabilité cellulaire élevée. En bas: X-ray image d'une queue de bovins âgés de 6 mois environ illustrant l'existence des plaques de croissance (GP), centre secondaire d'ossification, entre les plateaux osseux (PE) et les corps vertébral (VB).

Figure 3. Un Tools) pour disséquer la queue bovins dans des conditions stériles. B) Customized porte-lame pour couper des segments-motionnelle de la queue de l'espèce bovine dans l'action tout en coupant le disque intervertébral. C) Vue latérale de l'personnalisées porte-lame avec une lame standard industriel (Lutz, Allemagne).

Figure 4. Dessin et de l'image de la queue bovins après avoir enlevé le muscle environnant et du ligament illustrant les sites de clivage de couper les segments promotionnelle. Partiel vertèbre doit être "craqué" wie le porte-lame sur-mesure, idéalement 1-2 mm loin de les plateaux cartilagineux pour assurer surface osseuse complète.

Figure 5. Démonstration de l'efficacité du nettoyage de l'étape de jet-lavage avant (A) et après (B). Avis des surfaces osseuses nettoyage des segments du disque intervertébral après la procédure de pulvérisation.

Figure 6. Expérimentation de diffusion gratuite de gonflement du fraîchement préparés excisée disques intervertébraux queue bovin (DIV) laissé pendant 24 heures dans une solution de 1% Procion rouge, démontrant l'effet de blocage par la plaque de croissance. Une radiographie numérique vue sagittale d'un DIV contenant encore la plaque de croissance et une seconde couche de l'image de microscopie à fluorescence de l'os à travers la coupe sagittale explant coccygienne disque intervertébral bovins des plateaux vertébraux cartilagineux et osseux après deux4h de diffusion gratuite. GP: plaque de croissance, 2ndry CO: centre secondaire d'ossification.

Figure 7. Gratuit-gonflement expérience de fraîchement préparés excisée disques intervertébraux queue bovin (DIV) laissé pendant 24 heures dans une solution de 1% Procion rouge, démontrant de nettoyage à jet d'effet du traitement de lavage. Sagittale sections épaisses (~ 100 mm) de diagnostic in vitro excisés bovins avec des plaques de ~ 1,5 mmthick fin osseuses qui ont subi un lavage à jet d'un traitement (à gauche) contrôle sans traitement (droite) un lavage de jet-traitement. Inlet montre le jet, qui a été utilisé par le système plaies Zimmer débridement expériences 24h diffusion libre des bovins explants disque intervertébral en rouge Procion 1%.

Figure 8. Images Live / Dead de projections de piles imagerie confocale (250μm) prélevés bovinsegments e disque intervertébral préparé avec cette méthode de lavage de jet-gardés sous-gonflement libre pour 0 et 14 jours respectivement pour le nucleus pulposus (NP), l'intérieur l'anneau fibreux (IA) et l'anneau fibreux externe (OA). Vert = cellules des cellules vivantes souillé par calcéine AM (acétyl méthylique), les globules rouges = noyau de cellules mortes colorées par éthidium homodimère-1.

Figure 9. Viabilité cellulaire du disque intervertébral par laser microscopie confocale à balayage sur les tissus vivants et de numérisation 3D pile. La viabilité des cellules du noyau pulpeux (NP) et l'anneau de fibrose (AF) au cours des 21 jours-culture sous-gonflement sans condition. (Moyenne ± SEM, n = 6) Les différences statistiques ont été testés à l'aide non-paramétrique de Kruskal-Wallis signé test de la somme parmi les groupes. Des différences significatives ont été trouvées entre 21 jours et tous les autres moments dans NP. Alors que dans les différences significatives ont été trouvées AF entre le jour de 7 àjour 0. (* P <0,05, ** p <0,01).

La première étape pour la culture d'organe réussie est de faire en sorte que l'explant ne doivent pas être contaminés. La queue doit être dépecé avant de commencer la procédure. Toute poils amené dans un laboratoire stérile pourrait être problématique en termes de contamination. La queue bovins devraient idéalement être aussi frais que possible (ce qui affecte la viabilité des cellules initiales). Par ailleurs, l'étape de lavage bétadine est recommandée pour réduire le risque de contamination. Au lieu d'utiliser un porte-lame sur-mesure et un marteau pour séparer les DIV du corps vertébral, ce qui pourrait être effectuée en utilisant une scie à ruban histologique (la lame diamant doit être refroidi avec du PBS ou solution de Ringer pendant la coupe). Méfiez-vous que la scie à ruban, le porte-échantillon et la lame de coupe doit être stérile. La technique démontrée ici ne se limite pas à l'isolement queue bovins IVD, mais peut être étendue à d'autres espèces animales comme les porcins, ovins et lépreux caudale ou d'isolement, même DIV lombaires. Pour DIV hARVEST dans la région où les processus de la colonne vertébrale sont présents, il est important d'enlever tous les premiers procédés.

Les données de la viabilité cellulaire donné dans la figure 9 ont été recueillis en vertu de libre-gonflement pour un maximum de 21 jours et peut être utilisé comme une référence. Cette méthode maintient la viabilité cellulaire pendant 14 jours en vertu de libre-gonflement. La baisse de la viabilité cellulaire de 21 jours pourrait être due à l'absence de charge mécanique qui a été montré pour être important en aidant la diffusion des nutriments à travers les plateaux et pour maintenir la viabilité des cellules du disque ^3. Il sera très probable que la viabilité cellulaire sera encore plus élevé en compression hydrostatique et / ou supplémentaires ^{de 80 à 10} de chargement diurne.

Comme un autre protocole, les disques bovin peut être préparé en enlevant tous les os des vertèbres adjacentes en utilisant une fraise dentaire et juste de quitter les plateaux cartilagineux ^11. Viabilité cellulaire IVD a été maintenu pendant 4 semaines en utilisant cette méthode.Toutefois, dans ce cas de torsion ne peut pas être appliquée d'une manière simple pour les segments motional car il n'y a pas d'os raides disponibles pour "saisir" le disque. Le concave plateaux au lieu d'une des surfaces parallèles sur les deux côtés a également besoin d'un ajustement de la chambre de spécimen dans toute conception de bioréacteur pour tenir compte des différences de profil de chargement ^11. Par ailleurs, l'évaluation de la diffusion de molécules à travers plateaux osseux est également impossible dans ces explants.

Importance de notre travail

• L'utilisation de mono-utilisation des lames industrielles pour découpe des segments intacts disque intervertébral pour la culture d'organe raccourcit le protocole de récolte considérablement par rapport aux protocoles impliquant un avant-étape avec une bande histologique vu. Aussi la structure de l'os trabéculaire n'est pas affectée, comme c'est le cas d'un mouvement de broyage avec un diamant lame de scie.
• Jet-lavaging de la surface osseuse lave-out-sang coagulé très efficace et SIaméliore la viabilité des cellules gnificantly du nucleus pulposus (centre du disque) au cours du temps par rapport aux traités disques intervertébraux.