JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Dutch was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro

1

1Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit artikel,

    Date Published: 1/18/2012, Issue 59; doi: 10.3791/3495

    Cite this Article

    Lewis, P. A. Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro. J. Vis. Exp. (59), e3495, doi:10.3791/3495 (2012).

    Abstract

    Leucine Rich Herhaal Kinase 2 (LRRK2) is een aminozuur 2527 lid van de ROCO familie van eiwitten, het bezit van een complex, multidomein structuur met inbegrip van een GTPase domein (genoemd ROC, voor Ras van complexe eiwitten) en een kinase domein 1. De ontdekking in 2004 van de mutaties in LRRK2 dat de ziekte van Parkinson (PD) veroorzaken resulteerde in LRRK2 zijnde de focus van een grote hoeveelheid van het onderzoek in zijn normale functie en de manier waarop het eiwit mis gaat in de ziekte staat 2,3. Eerste onderzoek naar de functie van LRRK2 gericht op de enzymatische activiteiten 4-6. Hoewel een duidelijk beeld moet nog komen van een consistente verandering in deze als gevolg van mutaties, heeft de gegevens van een aantal groepen gewezen op het belang van de kinase-activiteit van de LRRK2 in celdood gekoppeld aan mutaties 7,8. Recente publicaties hebben gemeld remmers gericht op de kinase-activiteit van LRRK2, waardoor een belangrijk experimenteel instrument 9-11. In het licht van deze gegevens is hetis het waarschijnlijk dat de enzymatische eigenschappen van LRRK2 veroorloven ons een belangrijk venster naar de biologie van dit eiwit, maar of ze zijn potentiële drug targets voor Parkinson is open voor discussie.

    Een aantal verschillende benaderingen zijn gebruikt voor het testen van de kinase-activiteit van LRRK2. Aanvankelijk werden testen uitgevoerd met behulp van epitoop-gemerkte eiwit tot overexpressie gebracht in zoogdiercellen cellijnen en immunogeprecipiteerd, met de testen uitgevoerd met behulp van dit eiwit geïmmobiliseerd op agarose parels 4,5,7. Vervolgens hebben gezuiverde recombinante fragmenten van LRRK2 in oplossing ook gebruikt, bijvoorbeeld een GST gelabeld fragment gezuiverd van insectencellen die residuen bevatten van 970 tot 2527 van LRRK2 12. Onlangs Daniëls et al.. Isolatie van volledige lengte LRRK2 in oplossing van menselijke embryonale niercellen gemeld, maar dit eiwit is niet op grote schaal beschikbaar 13. In tegenstelling, de GST fusie afgeknotte vorm van LRRK2 is commercieel available (van Invitrogen, zie tabel 1 voor details), en biedt een handig hulpmiddel voor het aantonen van een test voor LRRK2 kinase-activiteit. Er zijn verschillende uitgangen voor LRRK2 kinase-activiteit gemeld. Autofosforylatie van LRRK2 zelf, fosforylering van Myeline Basic Protein (MBP) als een generiek kinase ondergrond en fosforylering van een kunstmatig substraat - genaamd LRRKtide, op basis van fosforylering van threonine 558 in Moesin - zijn allen toegepast, evenals een reeks van vermeende fysiologische substraten waaronder α-synucleïne, Moesin en 4-EBP 14-17. De status van deze eiwitten als substraten voor LRRK2 blijft onduidelijk, en als zodanig het protocol hieronder beschreven zal zich richten op het gebruik van MBP als een generiek substraat, en merkt het nut van dit systeem test LRRK2 kinase-activiteit gericht tegen een scala van mogelijke ondergronden.

    Protocol

    Veiligheid

    Het protocol hieronder beschreven maakt gebruik van ATP gelabeld met radioactief 32 P op de γ fosfaat positie om de kinase-activiteit van LRRK2 te volgen. Het is gebaseerd op de standaard protocollen die worden gebruikt in ons laboratorium, en dus met betrekking tot vele van de stappen in het proces, zoals het uitvoeren van de gels, western blotting et cetera van de materialen en de precieze voorwaarden moeten worden genomen als een gids als de apparatuur en de protocollen gebruikt voor deze processen varieert van laboratorium tot laboratorium. Verbindingen die isotopen die ioniserende straling uitzenden zijn potentieel schadelijk voor de gezondheid van de mens en de strenge regels van toestemming en regelgeving op een institutioneel en nationaal niveau controle over hun gebruik. De experimenten in dit protocol werden uitgevoerd na training in open source-straling te gebruiken aan het University College London en naar aanleiding van de goede laboratoriumpraktijken richtlijnen van de veiligheid diensten op het college (richtlijnen available op http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Gebruik van open source straling mag voorafgaand aan de juiste opleiding en wettelijke goedkeuring worden geprobeerd. De regelgevende instantie die verantwoordelijk is voor open source-straling in het laboratorium onderzoek varieert van land tot land. Voorbeelden hiervan zijn: in het Verenigd Koninkrijk, de Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), in de Verenigde Staten de Nuclear Regulatory Commission ( http:// www.nrc.gov / materialen / miau / regs-gidsen-comm.html ), in Canada de Canadian Nuclear Safety Commission ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), en in Duitsland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). Gebruikers in andere landen moeten bevestigen de plaatselijke regels, voorschriften en vergunningverleners met hun straling veiligheidsfunctionaris. Veiligheidsmaatregelen die relevant zijn voor dit protocol zijn opgemerkt in de tekst, gemarkeerd met de radioactieve klaversymbool ( Symbool 1 ).

    1. Voorbereiden van de kinase reacties

    Symbool 1 Alle reactiemengsels voorbereid in 1,5 ml monster tubes met schroefdop met een O-ring om de verspreiding van radioactiviteit.

    1. Dooi eiwit op het ijs - LRRK2 wild type, D1994A, G2019S.
    2. make-up reactie op het ijs - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul van 10x kinase buffer, aangevuld tot 50μl met water.

    2. Uitvoeren van de test

    Symbool 1 Alle stappen gebruik te maken van 32 P ATP moet pkant in de aangewezen gebieden straling.

    Symbool 1 Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen - onder standaard operationele procedure in ons laboratorium omvatten deze laboratoriumjas, dubbele handschoenen en een veiligheidsbril.

    Symbool 1 Monsters met 32 P ATP moet worden afgeschermd van gebruikers door 6mm Perspex schermen om de blootstelling te minimaliseren.

    Symbool 1 Indien van toepassing, persoonlijke controle apparaten moeten worden gebruikt - binnen de UCL, moet een gecertificeerde open source-straling gebruiker een film badge om de blootstelling aan straling tijdens de experimenten monitoren.

    Symbool 1 Alle experimentele oppervlakken worden beoordeeld voor de radioactieve besmetting voor en na gebruik met behulp van een Geiger teller.

    Symbool 1 Alle potentieel verontreinigde verbruiksmaterialen dient te worden vernietigd in een strikte naleving van de institutionele richtlijnen voor opberging van radioactief afval.

    1. Vóór de start van test, stelt verwarming blokken tot 30 ° C en 100 ° C, respectievelijk
    2. Verwijder de 32 P ATP van -20 diepvries (merk op dat de opslag weer 32 P ATP kunnen variëren, afhankelijk van de leverancier of het type van de gebruikte radioactieve nucleotiden). Symbool 1 voorafgaande scan buitenkant van de verpakking te gebruiken, ontdooien achter plexiglas scherm.
    3. Met reacties op het ijs, voeg 1μl van 32 P ATP elk, samen met 10μM van koude ATP.
    4. Meng goed met een pipet. Symbool 1 Pulse centrifuge te brengen vloeistof naar onderkant van de buis, het minimaliseren van het risico van besmetting.
    5. Verwijder 15μl aliquot voor nul tijdstip eend beëindigen reactie in aliquot door toevoeging van 5μl van 4x SDS sample buffer en denaturatie bij 100 ° C gedurende 10 minuten. Symbool 1 Pulse centrifuge te brengen vloeistof naar onderkant van de buis, het minimaliseren van het risico van besmetting.
    6. Resterende monster geplaatst in verwarmings-blok en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 60 minuten.
    7. 15μl verwijderd 60 minuten tijdstip en de reactie beëindigd door toevoeging van 5μl van 4x SDS sample buffer en denaturatie bij 100 ° C gedurende 10 minuten. Symbool 1 Pulse centrifuge te brengen vloeistof naar onderkant van de buis, het minimaliseren van het risico van besmetting.

    3. Immunoblotting de monsters en het analyseren van resultaten

    1. Monsters run op SDS-PAGE
      1. 10 goed 4-12% Bis-tris polyacrilamide gel bereid voor elektroforese gebruik van MOPS lopen buffer.
      2. 20μl van elk monster geladen op gel samen met 7μl van scherpe voorwerpenTain eiwit standaard ladder.
      3. Gel draaien op 160V gedurende 90 minuten, of totdat de kleurstof voorkant heeft bereikt aan het einde van de gel. Symbool 1 Alle vloeistof in contact komt met radio-isotopen moeten worden behandeld als radioactief afval en weggegooid als per institutionele richtlijnen. UCL reglementen staat dat vloeibaar radioactief afval dient te worden vernietigd door de bakken naar beneden aangewezen radioactieve beschikking zinkt met veel water.
    2. Eiwit overgebracht naar PVDF-membraan via western blot
      1. Overdracht buffer voorbereid, 1x Tris Glycine vermeerderd met 20% methanol. (PVDF) membraan en filtreerpapier op maat gesneden corrigeren voor gel en geactiveerd met glaciale methanol in het geval van het membraan of pre-nat met transfer buffer in het geval van het filter papier. Het membraan moet vooraf worden gelabeld met ballpoint inkt om de identificatie van oriëntatie mogelijk te maken. Symbool 1 Gel uit plastic behuizing en overtollige acrylamide verwijderd en afgevoerd als radioactief afval.
      2. De gel moet worden gevormd in een sandwich met het membraan en filter papier, zodat er geen luchtbellen bestaan ​​tussen het membraan en de gel, en vervolgens gerangschikt in de western blot toestel met het membraan tussen de gel en de anode.
      3. Overbrenging plaats op 25V gedurende 16 uur.
    3. Naar aanleiding van eiwit transfer naar PVDF, moet het membraan worden gedroogd bij kamertemperatuur. Ten slotte moet de droge membraan worden geïsoleerd tussen de cellulose-acetaat platen en blootgesteld aan een fosfor scherm of x-ray film om detectie van radioactief gelabelde eiwitten mogelijk te maken. Belichtingstijd kan lopen van enkele uren tot meer dan een week, afhankelijk van de specifieke activiteit van de gebruikte radio-isotoop en het enzym kinetiek van de reactie.
    4. Phosphoscreen gescand / film verwerkt. Bij gebruik van een fosfor-scherm, moet het beeld worden opgeslagen als een hoge-resolutie TIFF-of bitmap-bestand, bij gebruik van film dan is de resulterende transparency moet worden gescand met behulp van een desktop scanner en opgeslagen als een hoge-resolutie TIFF-of bitmap-bestand. Het beeld kan vervolgens worden geanalyseerd in ImageJ, een freeware programma beschikbaar is op de National Institutes of Health website ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).

    4. Representatieve resultaten

    Figuur 1 toont representatieve resultaten voor een test uitgevoerd met behulp van wild-type, G2019S en D1994A LRRK2 met Myeline Basic Protein als een generieke fosfaat acceptor substraat. Autofosforylatie van LRRK2 zichtbaar is ≈ 200kDa, met meerdere bands die gefosforyleerd MBP zichtbaar vanaf 20-40kDa. Let op de afwezigheid van autofosforylatie in de D1994A (kinase dood) baan, en een verhoogde fosforylering als gevolg van de G2019S mutatie. Merk ook op resterende fosforylering van MBP in de kinase doden baan. Dit kan te wijten zijn aan onvolledige verwijdering van de kinase-activiteit van LRRK2 door de D1994A mutant of weerspiegelen de aanwezigheid van of trace vervuilende kinases in de reactie.

    Figuur 1
    Figuur 1.

    Discussion

    Dit artikel beschrijft een eenvoudige protocol voor het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 met behulp van een in vitro systeem. In het belang van de beknoptheid, is dit beperkt tot een een-uur eindpunt template met behulp van een generiek substraat, maar de algemene protocol is van toepassing op een scala van mogelijke substraten en vatbaar voor meer geavanceerde analyses onderzoek naar de kinetiek van de kinase-activiteit van LRRK2 . Dit onderstreept een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van een in vitro systeem voor het kinase gedrag van een eiwit zoals deze te onderzoeken: omdat er volledige controle over de concentraties van het enzym en substraat, is het mogelijk om kinetische gegevens te genereren en K m te berekenen en V max-waarden voor de reactie. Voor meer gedetailleerde kinetische evaluaties of evaluatie van de impact van de vermeende remmers, een hogere doorvoer systeem (zoals dat wordt geboden door het gebruik van de LRRKtide substraat, verkrijgbaar bij Invitrogen) is een superieur alternatief,ve aan de benadering die hier wordt beschreven.

    Het is echter belangrijk, om te erkennen dat het reductionistische model-systeem geleverd door in-vitro-kinase assays is maar een hulpmiddel om de biologie van een kinase en de relaties met potentiële substraten te onderzoeken. Gegevens van assays zoals deze moet worden gebruikt in combinatie met andere benaderingen om een volledig beeld van hoe een kinase zich gedraagt ​​in vitro en in een cellulaire context te krijgen. Zo kan bijvoorbeeld een vermeende substraat gefosforyleerd in vitro worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie om mogelijke phosphosites die vervolgens kan worden gemanipuleerd door gerichte mutagenese (bijvoorbeeld. Omzetten van serine of threonine fosfaat acceptor residuen aan none-fosforyleerbare residuen zoals alanine) de functionele onderzoeken te identificeren de gevolgen van fosforylering ex vivo.

    Een belangrijke overweging bij het ​​interpreteren van gegevens van een in vitro test systeem zoals dit is kans op either type I of type II (vals positief of vals negatief) fouten. De reductionistische karakter van dit systeem helaas beschikt om zowel - in het geval van de voormalige, met een gezuiverde vermeende substraat en gezuiverd kinase in kunstmatig de buurt en bij hoge concentratie (in vergelijking met de cellulaire milieu) kan resulteren in artefactual fosforylatie gebeurtenissen. Omgekeerd veel kinases functie als onderdeel van een complex in het kader van de cel, en vereisen co-factoren voor fosforylatie van een bepaalde ondergrond te voorkomen. Zoals hierboven vermeld, een positief resultaat van fosforylering van een vermeende substraat met behulp van een in vitro test systeem moet vervolgens worden getest in een cellulair systeem om de resultaten te valideren, en een negatief resultaat moet met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.

    In het licht van deze, is het essentieel waar het mogelijk om zowel de positieve en negatieve controles moeten een vergelijkend onderzoek naar de activiteit van uw kinase van belang mogelijk te maken. Zorgvuldige selectie van een positieve control dat een bekende activiteit naar uw eiwit van belang is, samen met een negatieve controle die is waarschijnlijk niet uw vermeende substraat fosforyleren, is zeer waardevol. Een kandidaat controle voor LRRK2 is Receptor interactie kinase 3, die een nauw verwante primaire sequentie moet de kinase domein van LRRK2, maar heeft een heel andere algemene domein structuur 18. Dit is beschikbaar als recombinant eiwit uit Invitrogen en wordt gebruikt als een standaard controle in ons laboratorium.

    Ook moet worden opgemerkt dat de commercieel verkrijgbare vorm van LRRK2 de N-terminus van het eiwit ontbreekt en is gelabeld met glutathion-s-transferase en dit moet in aanmerking worden genomen als een potentiële verstorende factor bij het uitvoeren van kinase assays met dit eiwit, de N-terminal van LRRK2 omdat het niet bekend welke rol kunnen spelen in de normale functie van dit eiwit. Als bijvoorbeeld de N-terminale deel van de LRRK2 die afwezig is in het eiwit wordt gebruikt in dit protocolis van cruciaal belang voor de aanwerving van een specifiek substraat voor de kinase domein van LRRK2, dan zal dit een grote invloed op de waargenomen fosforylatie van het substraat in de in vitro systeem zoals hierboven beschreven.

    Zelfs met deze beperkingen, echter het belang gehecht aan biologie van LRRK2 in het onderzoek van Parkinson benadrukt het nut van dit protocol als een waardevol instrument voor het onderzoeken van het gedrag van dit eiwit in een in vitro setting.

    Disclosures

    Geen belangenconflicten verklaard.

    Acknowledgements

    De auteur is een van Parkinson in het Verenigd Koninkrijk Research Fellow (subsidie ​​F1002). Dit werk werd mede ondersteund door de Wellcome Trust / MRC Joint Call in neurodegeneratie award (WT089698) om de ziekte van het Verenigd Koninkrijk van Parkinson Consortium (UKPDC) waarvan de leden van het UCL Institute of Neurology, de Universiteit van Sheffield en de MRC Proteïne Fosforylatie Unit bij de Universiteit van Dundee.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    LRRK2 wild type Invitrogen PV4873
    LRRK2 G2019S Invitrogen PV4881
    LRRK2 D1994A Invitrogen PV6051
    Kinase buffer Cell Signaling Technology 9802S
    MBP Sigma-Aldrich M1891
    32P g ATP PerkinElmer, Inc. BLU002X500UC 500μCi, 30Ci /mMole
    4x LDS sample buffer Invitrogen NP0007
    2-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250
    Protein standards Invitrogen LC5800
    MOPS running buffer Invitrogen NP0001
    Bis-tris acrylamide gel Invitrogen NP0321 4-12% 1mm 10well
    PVDF membrane EMD Millipore IPVH00010
    Transfer buffer Invitrogen NP0006
    Table 1. Reagents
    Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
    Geiger counter Mini Instruments
    SDS PAGE tank Invitrogen
    Transfer tank Invitrogen
    Heat blocks (2) Eppendorf
    Phosphor screen GE Healthcare X-ray film can be substituted
    Phosphor imager GE Healthcare
    Exposure cassette GE Healthcare
    Centrifuge Eppendorf
    Perspex shielding
    1.5ml tubes VWR international Screw top with O ring
    Table 2. Equipment

    References

    1. Lewis, P.A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191, doi:BC20080053 [pii] 10.1042/BC20080053 (2009).
    2. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
    3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
    4. West, A.B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
    5. Gloeckner, C.J., et al. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
    6. Lewis, P.A., et al. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671, doi:S0006-291X(07)00689-4 [pii]10.1016/j.bbrc.2007.04.006 (2007).
    7. Greggio, E., et al. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341, doi:S0969-9961(06)00071-4 [pii] 10.1016/j.nbd.2006.04.001 (2006).
    8. Smith, W.W., et al. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
    9. Deng, X., et al. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205, doi:nchembio.538 [pii] 10.1038/nchembio.538 (2011).
    10. Lee, B.D., et al. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000, doi:nm.2199 [pii] 10.1038/nm.2199 (2010).
    11. Nichols, R.J., et al. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60, doi:10.1042/BJ20091035 (2009).
    12. Anand, V.S., et al. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478, doi:EJB6789 [pii] 10.1111/j.1742-4658.2008.06789.x (2009).
    13. Daniels, V., et al. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315, doi:10.1111/j.1471-4159.2010.07105.x (2011).
    14. Jaleel, M., et al. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J., (2007).
    15. Qing, H., Wong, W., McGeer, E.G., & McGeer, P.L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152, doi:S0006-291X(09)01311-4 [pii] 10.1016/j.bbrc.2009.06.142 (2009).
    16. Imai, Y., et al. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443, doi:emboj2008163 [pii] 10.1038/emboj.2008.163 (2008).
    17. Greggio, E., et al. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
    18. Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T., & Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter