Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema di base della procedura a partire con l'omogeneizzato. Tempo stimato dalla preparazione di estratti cellulari a eluizione di Cam-bound proteine ​​è di circa 6-7 ore.

1. Preparazione del tessuto

1. Iniettare organotipica fettine di ippocampo con un virus che contiene un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse (in questo esempio, proteina fluorescente verde (GFP)-tagged Ng) e permettono di esprimere la proteina dei tessuti durante la notte.
2. Circa 12 a 18 ore dopo l'iniezione virale (a seconda del tempo di espressione virale), si preparano a raccogliere i tessuti. Aggiungere 1 ml di buffer dissezione (glucosio 10mM, KCl 4 mm, 26mm NaHCO3, saccarosio 233mM, 5mm MgCl _2, 1 mM CaCl _2, e 0,1% di fenolo-rosso, gasati con il 5% di CO ₂ 95% O ₂₎ a una piastra di Petri. Trasferimento dei tessuti in coltura / inserto a Petri e aggiungere 2 ml di buffer dissezione, per l'inserto di immergere il tessuto.
3. Raccoltat organotipica tessuto dell'ippocampo (tra 5 e 10 fette) con delicatezza raschiando il tessuto libero della membrana inserire utilizzando un bisturi. In particolare la rimozione di una particolare regione di interesse (ad esempio CA1) è anche un'opzione. Trasferire la sospensione di tessuto in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml utilizzando una pipetta Pasteur invertita.
4. Centrifugare i campioni a 1.500 rcf per 1 min per separare i tessuti dal buffer dissezione. Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet.
5. Per ogni fetta utilizzato, aggiungere 30-60 ml di buffer di omogeneizzazione (150mm NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptina, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antidolore, pepstatina 1μg/mL, e l'1% Triton X -100) al tessuto e omogeneizzare accuratamente con pestello.
6. Al fine di rimuovere i detriti cellulari, centrifugare la omogenato restante a 1.100 rcf per 10 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione evitando la contaminazione da pellet.
7. Prendere il 10% del supernatante come un campione di input (esempio 1). Conservare il surnatante rimanente sul ghiaccio durante la preparazione del CAM-sefarosio perle per l'utilizzo al punto 3.

Nota: Il tessuto usato qui sono organotipica fettine di ippocampo. Tuttavia, si potrebbero usare i neuroni dissociati o qualsiasi altro sistema di coltura cellulare. In tal caso, iniziare a passo 1,4 dopo aver raccolto il fazzoletto di carta nel modo appropriato.

2. Preparazione di perline per pull-down

Nel maneggiare le perline, è importante per salvare le perline e massimizzare l'efficienza delle reazioni, impedendo le perline si secchi ai lati del tubo. Per fare questo, è meglio ruotare il tubo dalla loro parte, permettendo la soluzione per bagnare le perline sulle pareti del tubo, immediatamente prima della centrifugazione.

1. Per ogni pull-down, pipetta 400 ml di sospensione Calmodulina-Sepharose perle in una provetta 2 mL con un relativamente flat-basso per massimizzare la superficie e l'interazione delle soluzioni con le perline durante il vostro incubazione.
2. Centrifugare perline a 21.000 rcf per 30 secondi e rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare le perline.
3. Per lavare le perline, aggiungere 100 ml di buffer di omogeneizzazione rispettivi contenente 2 mM CaCl ₂ a quelli utilizzati per pull-down Ca ^{2 +-CaM} proteine ​​di legame e 2 mM EDTA (un chelante del noto Ca ^{2 +)} per perline abbattimento proteine ​​ApoCaM vincolanti. Battere delicatamente la provetta per risospendere perline e centrifugare a 1500 rcf per 1 min. Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione, facendo attenzione a non disturbare le perline.

Nota: per tutte le fasi di aspirazione, si raccomanda di usare un puntale che ha una apertura multa (ad esempio punte di carico gel) per permettere la rimozione della soluzione senza rimuovere perline.

3. CaM-sefarosio legame delle proteine

1. Dividere il surnatante in due condizioni che contiene un uguale volume. A seconda del vostro stato, aggiungere la giusta quantità di CaCl ₂ o EDTA al surnatante fino a 2 mm per ogni concentrazione.
2. Aggiungi surnatante dal passo 1,7 a perline lavati in buffer di omogeneizzazione corrispondente. Battere delicatamente il tubo per mescolare.
3. Incubare i campioni a 4 ° C per 3 ore su un agitatore. Risospendere perline ogni 30 minuti o giù di lì per aumentare l'efficienza di legame.
4. Provetta da centrifuga contenente campioni e perline a 1500 rcf per 3 min.
5. Prendere 50μL di surnatante come un campione di proteina non legata (campione 2) e rimuovere con attenzione il surnatante per aspirazione e scartare.
6. Lavare perle tre volte come descritto al punto 2.3 Uso 100μL di buffer di omogeneizzazione rispettivi proprietari.

4. Eluizione

1. Aggiungere 50μL di tampone di eluizione (50mM Tris-HCl pH 7,5 e 150mm NaCl) contenente la condizione opposta (10mM Cacl ₂ o 10mM EDTA) ai talloni. Per esempio, i campioni che sono stati omogeneizzati e legato in tampone contenente Ca ^{2 +} vengono eluiti secondo tampone di eluizione contenente EDTA e viceversa.

Opzionale: Il riscaldamento del tampone di eluizione di 37 ° C prima di aggiungere al perline può aumentare il rendimento.

2. Incubare soluzione con perline a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Mescolare le perle picchiettando delicatamente il tubo circa ogni 5 min.
3. Centrifugare perline a 1.500 rcf per 3 minuti e rimuovere con attenzione il 50μL di supernatante per il legato alle proteine ​​(campione 3) per aspirazione. Assicurarsi di non disturbare le perline.
4. Aggiungi il caricamento del buffer proteine ​​a tutti i campioni (ad esempio proteine ​​omogenato, liberi e legati così come quelle ancora legato ai talloni).

Nota: Per massimizzare eluizione (specialmente nel caso di eluizione inefficienti), aggiungere 50μL del buffer di eluizione corrispondente (ad esempio l'aggiunta di buf contenente EDTAfer di perle legate in CaCl ₂₎ per le perle di riscaldamento prima di campioni per eluire le proteine ​​rimanenti legato e ripetere i passaggi descritti in 4,3 per rimuovere le proteine ​​legate rimanenti.

5. SDS-PAGE e Western Blot

Condotta SDS-PAGE e analizzare usando western blot sondando per la proteina di interesse e di sonda per una proteina nota per legare CaM nella condizione opposta come controllo positivo.

6. Rappresentante Risultati

Figura 2B mostra un esempio di Cam-pull-down test di prova il legame di CaM GFP-tagged Ng rispetto al Ng endogena. Per farlo, GFP-Ng è stato sovra-espresso nei nostri organotipica fettine ippocampali durante la notte e il tessuto è stato omogeneizzato. L'omogenato è stato incubato con CaM-sefarosio perline in presenza di entrambi i Ca ^{2 +} o EDTA. Ingresso omogenato mostra che la GFP-Ng è stato espresso oltre che endogene Ng e Ca ^{2 +} / CaM chinasi-dipendenti II(CaMKII). Come previsto in base al legame noto di Ng endogeni (illustrato nella fig. 2A), GFP-tagged Ng è stato eluito in assenza di Ca ^{2 +} (proteina legata EDTA) e non legato alla presenza di Ca ^{2 +} (Fig. 2B) . Al contrario, il controllo, CaMKII, è stato eluito solo in presenza di Ca ^{2 +} (legato alle proteine) ed è stato legato in sua assenza (EDTA). Questo dimostra che le perline CaM erano funziona bene e il elutions erano efficienti. Ancora più importante, questo dimostra che GFP-Ng si lega a ApoCaM in modo simile alla forma endogena, suggerendo che il tag GFP non ha alterato la funzione della nostra proteina ricombinante.

Figura 1. Schema di CaM pull-down assay
(A) omogenato del tessuto è filato giù per rimuovere i detriti cellulari. Circa il 10% del surnatante è preso come un esempio di ingresso (1). Il surnatante rimanente viene diviso in parti uguali per i diversicondizioni ed i reagenti appropriati (CaCl ₂ o EDTA) vengono aggiunti alla prova vincolante in quelle condizioni. Ogni surnatante (contenente CaCl ₂ o EDTA) viene caricato sulla rispettivamente preparato CaM-sefarosio perline e (B) incubato per consentire vincolanti. Proteine ​​non legate vengono rimossi (2) e (C) le proteine ​​legate (3) vengono eluiti fuori delle perle utilizzando tampone di eluizione (EB) contenente la condizione opposta, come l'associazione. La composizione proteica di questi tre campioni di proteine ​​possono essere analizzati mediante SDS-PAGE e analisi Western Blot.

Figura 2. A.) Schema di Ca ^{2 +-dipendente} vincolante CaM e eluizione di pull-down Esempi dosaggio sono dati di due tipi di proteine ​​che legano CaM in Ca ^{2 +-dipendente.} Neurogranin (Ng) rappresenta proteine ​​che si legano apo-CAM e CaMKII rappresenta proteine ​​che si legano a Ca ^{2 +} ricchiCaM. CaM è mostrato nel suo stato dissociato prima dell'incubazione con le proteine ​​omogenato. Una volta incubate in condizioni di alte concentrazioni di Ca ^{2 +} (2 mm) o in presenza di un chelante del Ca ^{2 +,} EDTA (2 mm), le proteine ​​si legano a CaM di conseguenza. Ng lega CaM nella condizione EDTA come non vi è poca o nessuna Ca ^{2 +} presenti, e sarebbe eluiti fuori dal Cam-sefarosio perline in presenza di Ca ^{2 +.} CaMKII, tuttavia, si legano ai CaM in presenza di elevate quantità di Ca ^{2 +} e si dissociano una volta che il Ca ^{2 +} è stato chelati.
B) I risultati di CaM esempio di pull-down test. Questo dato dimostra il risultato finale atteso di un Cam-sefarosio tirare giù con i campioni sondato per Ng e CaMKII. Sia il endogene Ng e GFP-Ng sono presenti nelle corsie di proteine ​​legate a CaM in presenza di EDTA. Ng non è legato quando i campioni sono incubati con CaM in presenza di Ca ^{2 +,} a dimostrazione che Ng lega solo apo-CAM. Il nostro controllo positivo, CaMKII, invece, si lega alla CaM solo in presenza di Ca ^{2 +.}

Il protocollo fornito utilizza CaM-sefarosio perline per indagare il Ca ^{2 +-dipendenza} di CaM proteine ​​leganti. Molte proteine ​​si legano CaM in Ca ^{2 +-dipendente.} Queste interazioni sono di grande importanza dato il numero di proteine ​​che legano CaM e il loro ruolo fondamentale in molte vie di segnalazione. In questo protocollo, Cam-sefarosio perline vengono utilizzate per separare CaM-binding proteins da tessuto omogenato in presenza o in assenza di Ca ^{2 +.} I risultati di questo approccio semplice ulteriormente la comprensione di come le proteine ​​possono interagire con CaM in Ca ^{2 +-dipendente.} Questo approccio si differenzia da una tecnica comunemente utilizzata in studi di legame delle proteine, cromatografia su colonna, nel senso che il Cam-sefarosio perle sono in soluzione, piuttosto che fissato in una matrice.

Evitando l'uso di una colonna è uno dei vantaggi di questo approccio, perché senza la colonna il protocollo è meno tempo, come non c'è need per equilibrare una colonna o aspettare gravità flow-through. Grazie alla virtù della sua efficienza, il CAM di pull-down tessuto richiede molto meno rispetto cromatografia su colonna e semplifica la preparazione dei campioni, come la separazione dei detriti cellulari dal campione di proteine ​​richiede solo una breve centrifugazione per il Cam-sefarosio tirare giù descritti. Colonne richiedono campioni di proteine ​​che sono privi di detriti cellulari, che possono richiedere ulteriori fasi di purificazione. Questo approccio ha dei vantaggi anche rispetto tirare giù altri metodi, come la co-immunoprecipitazione, che richiede un anticorpo contro la proteina esca per la cattura e gli eventuali proteine ​​interagenti nel campione. L'utilizzo di un anticorpo per catturare la proteina esca può essere una limitazione, come le interazioni poveri tra l'anticorpo e la proteina durante l'esperimento può portare ad un inefficiente tirare giù. Questi potenziali problemi vengono evitati con l'uso della descritto CaM-sefarosio pull-down.

Tuttavia, comeil co-immunoprecipitazione e analisi cromatografia su colonna, il Cam-sefarosio pull-down è limitato a ex vivo CaM vincolanti. I risultati ottenuti possono non riflettere la realtà in vivo delle interazioni CaM. Per esempio, modificazioni post-traduzionali impatto spesso le interazioni delle proteine. Questo è il caso di neurogranin, la cui interazione con CaM è impedito da PKC-mediata fosforilazione del suo dominio IQ ^5. Omogeneizzazione dei tessuti potrebbe alterare modificazioni post-traduzionali per esempio consentendo enzimi come la chinasi o fosfatasi per accedere proteine ​​bersaglio che normalmente sarebbe isolata dal enzimi all'interno della cellula. Turbativa di localizzazione e / o compartimentazione potrebbe anche permettere vincolante quando le due proteine ​​normalmente non avrebbe la possibilità di interagire nella cella. Per ridurre al minimo queste reazioni, è importante per conservare tutti i campioni sul ghiaccio tra la preparazione e il caricamento. E 'anche per questo motivo che l'incubazione con le perline è DonE a 4 ° C. Gli inibitori o gli inibitori dell'enzima fosfatasi altro potrebbe anche essere aggiunti al buffer di omogeneizzazione per aiutare a limitare i loro effetti.

Un controllo positivo è importante per questo esperimento per verificare che non ci sono errori significativi si sono verificati durante l'esperimento. Si può anche garantire che le differenze nelle condizioni erano sufficienti a causare cambiamenti conformazionali nel CAM, permettendo di legare diverse proteine ​​in presenza e in assenza di Ca ^{2 +.} Per esempio, se non c'è segnale per la proteina di interesse, potrebbe essere causa di un errore di carico o altre potenziali errori. Sondaggio per un'altra proteina nota per legare in altre condizioni (come ad esempio CaMKII nell'esempio fornito) può aiutare a risolvere i potenziali errori. Basso Ca ^{2 +} o Ca ^{2 +} chelante (ad esempio EDTA) concentrazioni può anche interferire con i risultati attesi. EDTA è stato utilizzato con successo ma altri chelanti del Ca ^{2 +} (es. EGTA) può essere più efficace se concen ancora più altogli ioni sono inefficaci. Eccessivo CaM-binding protein può anche portare a risultati inaspettati in quanto può saturare la disposizione CaM-sefarosio perline, causando eluizione della proteina quando dovrebbe essere legato. Questo è visto nell'esempio mostrato come una quantità relativamente piccola di GFP-Ng viene eluito nella condizione di EDTA. Quantificazione di proteine ​​prima di incubazione con perline possono contribuire a migliorare questa.

Preparazione e gestione del Cam-sefarosio perle di tutto l'esperimento è anche essenziale per il successo. Sfere possono essere facilmente perse durante l'esperimento, sia inavvertitamente rimosso con supernatante da scartare o bloccato sui lati e parte superiore del tubo 2,0 ml. Ciò può essere evitato utilizzando cautela durante la rimozione di surnatante e garantendo miscelazione immediatamente prima della centrifugazione. Cercate di non lasciare i campioni sedersi tra miscelazione e la centrifugazione in quanto consente CaM-sefarosio perline ad asciugare sui lati del tubo. Come misura precauzionale, perline e risospendere rosoluzione Tate intorno al tubo di perline bagnate immediatamente prima della centrifugazione. Immersione completa dei campioni con le perline sia durante l'associazione e incubazioni eluizione è molto importante. Senza mescolare idoneo del campione con le perline, vincolante e eluizione sarà probabilmente inefficace.

Questo protocollo è versatile e può essere facilmente modificato per altri scopi. L'esecuzione di questo esperimento con proteine ​​o troncato mutate in grado di rivelare informazioni sulla regione (s) e residui di proteine ​​che sono importanti per CaM vincolante e Ca ^{2 +-dipendenza,} se osservati. Nel caso di Ng, siamo stati in grado di dimostrare che GFP-Ng, come la proteina endogena, CaM si lega solo in assenza di Ca ^{2 + 8.} Per esplorare ulteriormente questa funzione di questo legame, diverse mutazioni di questa proteina alterarne la IQ-dominio aiutano a comprendere la natura dell'interazione Ng con CaM così come la funzione di modificazioni post-traduzionali, che alterano questo Interaction. Abbiamo testato l'importanza di Ng-CAM vincolante utilizzando due diversi mutanti: un aspartato phosphomimic al posto di una serina (S36D o Ng-SD) e un QI inferiore-Ng per evitare legame con CaM. Abbiamo inoltre generato un mutante (Ng-SFAW) che ha migliorato legame con CaM, rimanendo legato anche in presenza di Ca ^{2 +.} Infine, abbiamo utilizzato un non-mutante phosphorylatable (Ng-SA) che si lega al CaM in un ^+-dipendente Ca ² simile a endogene Ng ma impedisce la fosforilazione di proteine ​​chinasi C (PKC). Il CAM di pull-down test hanno testato la funzionalità di questi mutanti diversi e ha contribuito a mostrare l'importanza di Ng-CAM obbligatorio in funzione sinaptica ⁸ e come fosforilazione Ng aiuta a mettere a punto plasticità sinaptica ^15.

Inoltre, le proteine ​​che si legano alle proteine ​​leganti CaM potrebbe essere eluiti. Questo potrebbe fornire ulteriori applicazioni di questo test per la determinazione delle proteine ​​che legano indirettamente CaM. Permette lo studio di questi interagiscono altriioni e di altri potenziali effetti a valle di CaM e dei suoi partner vincolanti.

In sintesi, la camma di pull-down saggio offre un modo efficiente ed efficace per indagare Ca ^{2 +-dipendenza} di Cam-proteina. Questo può essere uno strumento importante per studiare le interazioni proteina-CaM e come diverse mutazioni o modifiche possono influenzare queste interazioni. Questo può essere prezioso per esplorare la regolazione del Ca ^{2 +} / CaM vie di segnalazione. Inoltre, possiamo usare questo per esplorare le patologie causate da interruzioni di Ca ^{2 +} / CaM segnalazione.