Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

1. Celle di carico con indicatori di calcio

1. Cellule piastra in piatti di 35 millimetri dal fondo di vetro MatTek (o qualsiasi altro fondo di vetro visione camere).
2. In caso di utilizzo primario cappotto miociti delle camere 1 giorno prima con 10μg/ml laminina. Miociti cardiaci piastra (isolata da cani adulti, ratti neonati, o altro organismo) in KB del buffer (K-inversione del buffer Tyrode 35 mmol / L di HEPES, 140 mmol / L di KCl, 8 mmol / L di KHCO _3, 2 mmol / L di MgCl _2, e 0,4 mmol / L di KH ₂ PO _4, pH 7,5) e il cambiamento in modo graduale per M199 media integrato con il 15% di siero fetale bovino e 1% e 0,5% streptamycin gentamicina e incubare a 37 ° C in 5% CO _2.
3. Incubare le cellule con il calcio verde AM (1-5 mM; Molecular Probes) o qualsiasi altro indicatore di calcio desiderato per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Coprire il piatto con un foglio di alluminio per evitare photobleaching del colorante.
4. Lavare le cellule tre volte con Leibovitz15 media con 14mm EGTA (se si esegue esperimenti di calcio) o qualsiasi altro supporto di visualizzazione appropriata.
5. Incubare per altri 30-45 minuti in media Leibovitz15 containing14mM EGTA.
6. Se il test gli effetti di inibitori (ad esempio 10μM U73122 PLC inibitore) vengono aggiunti durante la seconda incubazione.

2. Cellule Microinjecting

1. Cardiomiociti cultura in piatti con fondo trasparente MatTek (o altre camere di linea) per 24 ore.
2. Modificare il medio-fenolo libero Leibovitz-15 con 14 mM EGTA (cardiomiociti devono essere iniettati nel calcio di media liberi, altre cellule può essere iniettato in media contenenti calcio).
3. Preparare la soluzione microiniezione - i nostri studi hanno utilizzato un peptide che elimina Gα _q - interazioni caveolae. Tenete presente che solo una piccola quantità di volume è iniettato nella cellula (~ fl) e così le scorte ragionevolmente concentrato deve essere utilizzato. Abbiamo usato 2 mM di questo peptide, CAV3-patibolo, con DAPI di calcio senza medium. DAPI è un blue colorante che macchia il nucleo e permette l'identificazione di cellule che sono state microiniettati. DAPI non interferisce con la fluorescenza di molti indicatori di calcio. La quantità di DAPI è variabile e generalmente usiamo abbastanza per visualizzare il nucleo (0,5 e 2 mM)
4. Preparare la soluzione di controllo contenente DAPI - il tracciante colorante da solo.
5. Per microiniezioni utilizzare aghi di auto-tirata o disponibili in commercio. Pratica con iniezione colorante per determinare i parametri ago corretta. Prendiamo atto che le cellule differenti possono richiedere diametri ago diverso e pressioni microiniezione.
6. Usare il sistema automatizzato microiniezione, per esempio un NI2 InjectMan con una pompa FemtoJet da Eppendorf. Impostare la pressione di iniezione P _i a 90 hPa, e la compensazione della pressione P _C a 45 hPa. Impostare il tempo t di iniezione a 0,7 s. Regolare i parametri di iniezione come necessità.
7. Effettuare microiniezioni su un microscopio invertito (ad esempio Zeiss Axiovert 200M) dotata di obiettivo lavoro lungo contrasto di fase a distanza (ad esempio fase aerea 40x obiettivo 2).
8. Iniettare le cellule maggior numero possibile in modo rapido. Esaminare le cellule iniettate con il contrasto di fase per selezionare cellule vitali.

3. Co-immunofluorescenza studi

1. Lavare le cellule due volte con PBS e fissare con il 3,7% paraformaldeide per 30 minuti. Se necessario, le cellule possono essere stimolate prima fissazione.
2. Lavare le cellule fissate tre volte con PBS, e incubare con il 0,2% NP40 in PBS per 5 minuti.
3. Blocco con PBS contenente siero di capra al 4% (o altro siero del caso) per 1 ora.
4. Incubare le cellule con l'anticorpo primario ad una diluizione appropriata con siero di capra 1% in PBS per 1 ora.
5. Lavare le cellule per tre volte per 10 minuti con 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 seguita da aggiunta di fluorescenza marcata con anticorpo secondario, come Alexa-Fluor-488 anti-coniglio o Alexa-Fluor-647 anti-topo anticorpo secondario diluito a 1: 1000 1% siero di capra in PBS (notare che quando sondaggio per due diverse proteine ​​gli anticorpi primario deve essere allevato in diverse specie e il secondario deve essere contro le specie corrispondente).
6. Incubare a 37 ° C per 1 ora, lavare tre volte con TBS.
7. Vedi le cellule in TBS buffer o altro supporto di visualizzazione appropriato.

4. Calcio di imaging veloce

1. Usa microscopio confocale a scansione laser (per esempio Fluoview 1000 Olympus).
2. Utilizzare alto obiettivo apertura numerica.
3. Impostare i parametri di acquisizione. Per utilizzare il calcio verde 488 nm di eccitazione e di lunga passare 515 filtri di emissione.
4. Regolare il tempo di pixel - per misurazioni di calcio veloce è impostato a 2 ms / pixel.
5. Impostare lo zoom dell'immagine per raggiungere dimensioni dei pixel di 0,05 - 0,3 micron.
6. Selezionare una linea da una cella di scelta in una determinata regione.
7. Nella finestra di controllo volta selezionate tempo di acquisizione per almeno 1500 scansioni (per ottenere desiderato arco di tempo dila risposta - 1,3 ms / linea produrrebbe 2 secondi).
8. Sfondo registrare la lettura prima della stimolazione.
9. Stimolano le cellule con 5 carbacolo mM ed iniziare immediatamente la registrazione dei dati. Mantenere le cellule in 1 ml di Leibovitz15 media, preparare 10 carbacolo micron di Leibovitz15 e aggiungere delicatamente 1 mL nel piatto

5. Analisi dei dati

1. Estrarre l'intensità per ogni pixel di immagine registrata. Salvare i dati di intensità, come una tabella utilizzando il software Fluoview 1000.
2. Importazione di dati di intensità in SigmaPlot o una simile analisi dei dati di programma e bin i dati in ~ 9-40 cassonetti. Confronta con esperimenti di controllo e il rumore elettronico.

6. Rappresentante dei risultati:

Abbiamo ripreso celle microscopio confocale a scansione laser LSM510 (Zeiss, Jena, Germania) dotato di multi-linea eccitazione laser e un obiettivo apocromatico 40x/1.2 NA immersione in acqua. In fig. 1 (rossa) ci mostrano la distribution caveolae in cardiomiociti adulti canino ventricolare che sono state fissate e colorate con un anticorpo di caveolina-3, che è la maggiore proteina strutturale caveolari in queste cellule ^9. Caveolina-3 è stato immunolabelled con Alexa-647 ed eccitato con la 633-nm linea da un Lui: Ne laser. Le immagini sono state registrate utilizzando LP650 filtro per le emissioni nm. La distribuzione della caveolina-3 è stato confrontato con Gα _q che è stata immunolabeled con Alexa-488 (verde). Alexa-488 è stato eccitato con 488 nm Argon-laser a ioni di linea e l'immagine è stata registrata usando filtro per le emissioni BP505-530nm. In queste misurazioni colocalizzazione, i due fluorofori erano eccitati in maniera sequenziale utilizzando acquisizione Multi Track. Questa procedura riduce al minimo canale di cross-talk. L'analisi dei dati per colocalizzazione è stata eseguita utilizzando il software fornito con AIM Zeiss LSM510-Meta. Come si può vedere, le due proteine ​​sono colocalized.

Per determinare la modalità di accoppiamento tra caveolina-3 e Gα 2 + Verde. Siamo entusiasti del colorante con un laser a ioni argon 488 nm e raccolte le immagini attraverso un filtro LP515 emissioni. Cornici immagine sono stati raccolti a intervalli di 500 ms. Valori di intensità per ogni pixel sono stati estratti utilizzando il software Olympus e ImageJ. La modalità di scansione linea è stata utilizzata per l'analisi quantitativa dei più veloci transienti di Ca ^{2 +} e Ca ^{2 +} scintille. La dimensione dei pixel utilizzati nel presente studio era 0,1-0,3 micron. La line-scan tasso era di circa diverse centinaia di ms per riga. In fig. 2 si mostra una scansione di una linea di Ca ^{2 +} verde-caricato cardiomiociti in cui il pixel dtempo ben è stato di 2 ms, il tempo di linea è stata di 142 ms. L'immagine è composta da 1200 linee.

Ogni riga della scansione corrisponde alla fluttuazione intensità di Ca ^{2 +} verde composto da 71 punti presi in un intervallo di 142 ms, e può essere usato come un rapido read-out per le risposte di calcio. Per esempio, nella fig. 3 si mostrano le attività di Ca ^{2 +} di una singola linea di un individuo cardiomiociti, come misurato da Ca ^{2 +} intensità di fluorescenza verde in funzione del tempo in secondi prima (in alto) e dopo (in basso) l'aggiunta di 5 mM carbacolo che esalta il livello intracellulare di Ca ^{2 +} attraverso Gα _q-PLCβ attività. Quando le linee sono molti media, la stimolazione carbacolo produce un aumento di ~ 1,8 volte a Ca ^{2 +} intensità verde. A causa di variazioni nelle condizioni sperimentali (temperatura ambiente, potenza del laser, la risposta del rivelatore, distribuzioni di tintura, ecc), questo aumento non può essere visto nei singolilinea di scansione. Anche se i valori di intensità (valori asse y) sono simili, è chiaro che la trama carbacolo stimolata sul fondo ha picchi molto più ampia, corrispondente a livelli di calcio più sostenuta, oltre le cime fluttuazione ristretta visto prima stimolazione. Questo aumento ampliamento e relativa intensità oscura piccoli, oscillazioni più lente. Il nostro obiettivo è quello di discriminare meglio fra questi diversi tipi apparente delle fluttuazioni di calcio.

Un altro esempio di queste fluttuazioni calcio veloce è mostrato in fig. 4. Il grafico in alto mostra i dati linea prima per cardiomiociti ventricolari stimolati (rosso) e una media di 3 tracce linea appare in bianco. Per determinare la misura in cui queste fluttuazioni di calcio sono stati mediati da Gα _q - caveoline3 interazioni, abbiamo microiniettati un peptide che destabilizza caveolina-3 - Gα interazioni _q (cioè CAV3 peptide) che elimina il più a lungo di Ca ^{2 +} corrente e questi dati sono mostrati in blu(Notiamo che abbiamo sottratto 500 dal CAV3 intensità peptide modo che le due tracce possono essere meglio discernere).

Abbiamo importato le colonne di dati grezzi dai nostri archivi eccellere in SigmaPlot (Jandel, Inc.) e ha svolto un'analisi istogramma. In questa analisi, il numero di eventi è raggruppate in un numero uguale di scatole (bidoni) per produrre un istogramma. La larghezza di bin rappresenta un intervallo di tempo uguale. Le intensità sono inseriti nel tempo diverso si lega in modo che l'altezza di un bin particolare rappresenta il numero di volte che l'intensità si verifica nella finestra di tempo. Poiché questo tipo di analisi dipende solo raccogliere dati alla velocità di scansione stessa, molte tracce possono essere analizzati contemporaneamente. Inoltre, questa analisi non è sensibile alle differenze nei livelli di tintura, potenza del laser, ecc, e il rumore elettronico e il problema si presenta su scale temporali molto veloce e si vedono solo nei primi 1-2 bidoni.

Il histogra corrispondentems dei dati grezzi in fig. 4 sono mostrati nella parte inferiore della pagina. L'istogramma per le cellule di controllo sono distribuite su un gran numero di contenitori corrispondente a una distribuzione temporale ampio, come rappresentato dalla linea rossa (la linea è per guidare l'occhio e nessun modello si presume). Al contrario, i bidoni per la risposta delle cellule in cui è stato interrotto il _q-CAV3 Gα interazione peptide sono limitati a una distribuzione ristretta bin suggerendo che la presenza di peptidi elimina i flussi più lunga durata. Microiniezione di un peptide di controllo che non interrompe Gα _q-CAV3 produce un istogramma simile a un-iniettato le cellule ^8.

In fig. 5 abbiamo confrontare le fluttuazioni di intensità veloce di Ca ^{2 +} verde in cardiomiociti adulti ventricolare canino (a sinistra) e fresco, cardiomiociti di ratto stimolate neonatale che la mancanza caveolae (a destra). Qui, gli istogrammi corrispondenti delle intensità per un periodo di 3 minuti sono state cestinate a 35 per visualizzare gli eventi di calcio più lento. Si noti che i cardiomiociti neonatali visualizzazione fluttuazioni veloce su una linea di base piatta che mostra la mancanza di lenti Ca ^{2 +} attività, mentre una linea di base più strutturata è visto per le cellule adulte. Queste differenze sono più facilmente visibile negli istogrammi.

Immagini Figura 1. Dei cardiomiociti ventricolari cane adulto che mostra la distribuzione di Gα _q immunolabeled con Alexa-488 dove era eccitato Alexa-488 con 488 nm Argon-laser a ioni di linea e l'immagine è stata registrata usando filtro per le emissioni BP505-530nm. Alto a destra è l'immagine stessa visione la localizzazione di caveolina-3 immunolabeled con Alexa-647, eccitato con la 633-nm linea da un Lui: Ne laser e registrati utilizzando LP650 nm emissione filtro. L'immagine fusa in cui si vede colocalizzazione in arancione è in basso a sinistra con un'immagine estesa a destra.

Figura 2. Immagini di calcio, di cardiomiociti vita canina ventricolare adulti carichi di Ca ^{2 +} Verde. L'immagine è stata scattata su un sistema di microscopia confocale a scansione laser con un obiettivo 40x utilizzando un laser a ioni argon 488 nm ed un filtro per le emissioni LP515. L'immagine è composta da 1200 linee, il pixel tempo di permanenza è stato di 2 ms, e la dimensione dei pixel è stata di 0,1 micron.

Figura 3. Fluttuazioni di intensità superiore di una linea da una traccia di vita canina cardiomiociti ventricolari adulti carichi di Ca ^{2 +} Green e immaginato come descritto, e sotto la stessa cella stimolata dalla carbacolo aggiunta di 5 micron.

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Figura 4. TOP Un esempio di traccia linea da una vita canina cardiomiociti ventricolari adulti carichi di Ca ^{2 +} verde (rossa) preso più di 180 ms in cui viene mostrata la media di 3 tracce come una linea nera, e rispetto a una cella che è stata microiniettati con un peptide che sconvolge Gα _q caveolina-3 associazione (rosso), dove una media di tre tracce è in nero. Notiamo che abbiamo sottratto 400 conteggi intensità dalla serie inferiore di dati per scopi di visualizzazione. I pannelli inferiori sono gli istogrammi corrispondenti dei dati cestinate come descritto nel testo, e dove il numero di bin è arbitraria e il numero di bin (o semplicemente contare) corrisponde alla quantità totale di intensità che bin particolare. Prendiamo atto che le linee linee rossa e blu disegnate nel controllo (a sinistra) e peptide (a destra) sono istogrammi per consentire una più facile identificazione e confronto dei dati e nessun modello è assunto.

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Figura 5. Fluttuazioni di intensità di Ca ^{2 +} verde in cardiomiociti adulti ventricolare canino (a sinistra) e fresco, cardiomiociti di ratto stimolate neonatale che la mancanza caveolae (a destra) ed i loro istogrammi corrispondenti sono riportati di seguito.

Abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare ed isolare i segnali di calcio rapido cardiomiociti viventi. Mentre le condizioni sperimentali di queste misurazioni sono state precedentemente applicata ai sistemi cellulari altri ¹⁰ così come cardiomiociti ^11, l'utilizzo di istogrammi e di analisi bin consente ai dati di molti Ca ^{2 +} eventi da acquisire. Più veloce eventi possono essere facilmente isolate da quelli lenti e modelli adattati a comprendere i meccanismi sottostanti. Cardiomiociti coltura, come molte linee cellulari primarie, può essere difficile. Mentre si pensa generalmente che le misure dovrebbero essere prese subito dopo che le cellule vengono acquisiti, abbiamo trovato che la cardiomiociti adulti canina che abbiamo usato in questo studio solo cominciano a perdere le loro proprietà specifiche dopo 3 giorni. Questo lasso di tempo più lungo permette alle cellule di fissare saldamente al substrato assicurare che le cellule sopravvivono trattamenti potenzialmente letali come microiniezione. Fermo attaccamento è un fattore criticoper il successo di microiniezione.

Abbiamo verificato il ruolo di Gα _q-caveolina 3 associazione in flussi di calcio da microinjecting un peptide che sconvolge la loro interazione. Vorremmo sottolineare che microiniezione deve essere fatto con grande cura per ridurre al minimo i danni delle cellule e la fuoriuscita del contenuto cellulare. Tuttavia, questi rischi devono essere bilanciati con l'uso di aghi di diametro maggiore che sono necessari per fornire una adeguata quantità di materiale in cardiomiociti relativamente grande. L'inclusione di un colorante come DAPI che permette di tenere traccia di quali cellule sono state microiniezione è importante. Come accennato, è importante che per la microiniezione miociti sono immersi in calcio media liberi e che le soluzioni iniettata è libera anche di calcio. Afflusso di calcio extracellulare avvia le contrazioni e la successiva morte delle cellule

Le misure si può essere adattato a altri tipi di cellule, coloranti e laser confocalesistemi di seguire altri eventi cellulare rapida come insoitol 1,4,5 trisphospate e flussi cAMP, anche se il Ca ^{2 +} flussi sono certamente uno dei messaggeri più complesso cellulare. Si dovrebbe essere cauti sulla scelta degli indicatori fluorescenti che non sono facilmente fotodecolorate e hanno una risposta robusta e dinamica fluorescenza modo che le potenze laser a bassa può essere utilizzato. Potenza del laser a bassa sarà anche evitare il riscaldamento locale che potrebbe dar luogo a effetti indesiderati cellulare.