Visualisatie van vasculaire Ca ^{2 +} Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

Reactive oxygen species kan worden gemeten in levende cellen met behulp van oxidatie gevoelige kleurstoffen (1 & 2) of met behulp van plasmide sensoren (3 & 4) door confocale microscopie.

1. Visualisatie van cytosolisch ROS in J774 cellen

1. Grow J774.1 muis monocyt-afgeleide macrofagen (10 ⁶ cellen / ml) op de glazen bodem van 35 mm gerechten (Harvard Apparatus) voor 48 uur
2. Challenge cellen met TLR-agonisten (2 ug / ml, Lipo-teichoic zuur-TLR2 agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 agonist; 1 ug / ml LPS-TLR4 agonist) voor 6 uur bij 37 ° C.
   Let op: Macrofagen worden behandeld onder vergelijkbare omstandigheden werden gebruikt voor co-cultuur model Ca ^{2 +} mobilisatie.
3. Voeg de oxidatie-gevoelige kleurstof H ₂ DCF-DA (Invitrogen) tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM in ECM (extracellulaire medium te geven: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM MgSO _4, 2 mM _CaCl2, 10mM glucose en 2,0% dextran, pH 7,4; alle verkregen van Sigma) met 2% BSA om gerechten en incubeer cellen voor 20 minuten voor visualisatie onder confocale microscopie.
4. Na het laden van kleurstof, visualiseren cellen geplaatst op een temperatuur gecontroleerde fase van een geschikte beeldvormende systeem. We maken gebruik van Carl Zeiss LSM 510 confocale Meta imaging-systeem in combinatie met Argon-ion laser bron op een excitatie van 488 nm voor het DCF-fluorescentie-gebruik van 40x olie objectieve ¹³ (Fig. 1A en D).
5. Analyseren van beelden met behulp van ImageJ software (1.44), vrij beschikbare software van de National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualisatie van de basis-herfinancieringstransacties in J774 cellen

1. Grow J774.1 muis monocyt-afgeleide macrofagen (10 ⁶ cellen / ml) op de glazen bodem van 35 mm gerechten (Harvard Apparatus) voor 48 uur
2. Daag de cellen met TLR liganden aan MRO productie induceren (2 ug / ml, Lipo-teichoic zuur-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 ug / ml LPS-TLR4) voor 6 uur bij 37 ° C.
3. Voeg mitochondriale superoxide indicator MitoSOX Red (Invitrogen) tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM in ECM met 2% BSA om gerechten en incubeer cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C te laten geven laden van MitoSOX Red.
4. Na het laden van kleurstof, visualiseren cellen op een temperatuur gecontroleerde fase van een Carl Zeiss LSM 510 confocale Meta imaging-systeem echtpaar met Argon-ion laser bron op een excitatie van 561 nm voor MitoSOX Red fluorescentie met 40x olie doelstelling (afb. 1B en E).
5. Voor de controle-experimenten, na het laden van kleurstof toe te voegen PBS of DMSO (negatieve controle) of 2μM Antimycin A (als mitochondriale superoxide generator-positieve controle) naar de cellen voorafgaand aan het imago van de steekproef, zoals beschreven in 2.4 (figuur 1C).
6. Analyseren van de beelden met behulp van ImageJ software (1.44).

3. Visualizatieen van cytosolisch ROS in stabiele Hyper-cyto MPMVECs

1. We maken gebruik van pHyPer-cyto (Evrogen) een zoogdier expressievector codeert voor een TL-sensor Hyper dat lokaliseert in het cytoplasma en in het bijzonder zintuigen submicromolaire concentratie van H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfecteren Murine Pulmonale microvasculaire endotheelcellen (MPMVECs) met pHyPer-cyto vector met behulp van elektroporatie of transfectie reagentia. We maken gebruik van 10 x 10 ⁶ cellen en transfecteren met 10μg van pHyPer-cyto via elektroporatie met behulp van BioRad Gene Puiser electroporator systeem (250V, 500 uF). Cultuur MPMVECs in DMEM medium aangevuld met 10% FBS, niet-essentiële aminozuren, endotheliale groei aan te vullen en antibiotica.
   Let op: Na transfectie, plaat-cellen bij lage dichtheid te kolonie groei te bevorderen.
3. Vervangen door medium met volledige kweekmedium aangevuld met 500 ug / ml G418, 48 uur na transfectie. Scherm voor klonen die hoogste percentage van H hebben Yper positieve cellen en de passage Hyper positieve klonen om het aantal Hyper positieve cellen (Fig. 2) te verhogen.
   Opmerking: Wij gebruiken seriële verdunning van cellen voor klonale selectie van enkele cellen en het scherm voor een stabiele cellen zeer uitdrukken Hyper.
4. Grow stabiele Hyper-cyto MPMVECs op 0,2% gelatine beklede dekglaasjes (80% confluentie). De volgende dag uitdaging cellen met TLR liganden (2 ug / ml, lipoteichoïnezuur-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 ug / ml LPS-TLR4) voor 6 uur bij 37 ° C. Onbehandelde cellen dienen als controle.
5. Na de behandeling, monteer de dekglaasjes op Attofluor cel kamer (Invitrogen). Voeg 1 ml vooraf opgewarmd Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) naar de kamer en plaats de kamer op een temperatuur gecontroleerde fase van Carl Zeiss LSM 510 confocale Meta imaging systeem. Visualiseer en beeld fluorescentie verandering op een excitatie van 488 nm met behulp van 40x olie doelstelling (Fig. 3A en D).
6. Analyseren van beelden met behulp van ImageJ software (1.44) (zie paragraaf 6).

1. We maken gebruik van pHyPer-dMito (Evrogen) een zoogdier expressievector codeert voor mitochondriën-gerichte Hyper dat lokaliseert in de mitochondriën en specifiek zintuigen submicromolaire concentratie van H ₂ O _2.
2. Transfecteren MPMVECs met pHyPer-dMito en het genereren van een stabiele Hyper-dMito MPMVECs volgende stappen beschreven in paragraaf 3.2-3.3.
3. Grow stabiele Hyper-dMito MPMVECs op 0,2% gelatine beklede dekglaasjes (80% confluentie).
4. De volgende dag uitdaging cellen met TLR liganden (2 ug / ml, lipoteichoïnezuur-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 ug / ml LPS-TLR4) voor 6 uur bij 37 ° C. Onbehandelde cellen dienen als negatieve controle. Voeg 2μM Antimycin A (mitochondriale superoxide-inductor-positieve controle) voorafgaande aan het visualiseren van monster.
5. Na de behandeling, monteer de dekglaasjes op Attofluor cel kamer (Invitrogen). Voeg 1 ml van de voorverwarmde Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) aan de kameren plaats de kamer op een temperatuur gecontroleerde fase van Carl Zeiss LSM 510 confocale Meta imaging systeem. Visualiseer en beeld fluorescentie verandering op een excitatie van 488 nm met behulp van 40x olie doelstelling (Fig. 3B, C en E).
6. Analyseren van beelden met behulp van ImageJ software (1.44) (zie paragraaf 6).

5. Co-cultuur model voor visualisatie van paracriene-afgeleide ROS veroorzaakt Ca ^{2 +} signalisatie in endotheelcellen

Voor de visualisatie en meting van [Ca ^{2 +]} i veranderingen die we gebruiken een Ca ^{2 +} gevoelige fluorescente kleurstof fluo-4 AM (Invitrogen).

1. Grow MPMVECs op 0,2% gelatine gecoate 25 mm glas dekglaasjes (80% confluentie).
2. Incubeer de cellen gekweekt op dekglaasjes bij kamertemperatuur gedurende 30 min in ECM met 2% BSA en 0,003% Pluronic zuur met 5 uM fluo-4 AM (Invitrogen) uiteindelijke concentratie om het laden van de fluo-4 AM. Na het laden, wassen cellen met experimentele imaging-oplossing (ECM met 0.25% BSA) met sulfinpyrazon te verven verlies te minimaliseren.
3. Na het laden van fluo-4, monteren dekglaasjes op Attofluor cel kamer (Invitrogen). Voeg 800μl van vooraf opgewarmd experimentele imaging oplossing voor de kamer en plaats het op een temperatuur gecontroleerde fase van Carl Zeiss LSM 510 confocale Meta imaging systeem.
4. In een aparte buis etiket de nonactivated of geactiveerde macrofagen geïsoleerd van zowel wild-type of Gp91 ^{phox-/ -} muizen (behandeld met LPS voor 6 uur) met mobiele tracker rode CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) in ECM met 2% BSA en 0,003% Pluronic zuur. Wassen en cellen resuspendeer met 200μl van experimentele imaging-oplossing.
5. Voeg gelabeld macrofagen op fluo-4 AM geladen MPMVECs in de kamer montage.
6. Noteer de groene en rode fluorescentie elke 3s gedurende 10-20 min met behulp van Carl Zeiss LSM510 Meta confocale imaging-systeem met een Argon-ion laser bron met excitatie bij 488 en 561 nm voor fluo-4 AM en mobiele tracker rode fluorescentie respectively (Fig.4 AC).
   Opmerking: Als alternatief, J774.1 cellijn kan worden gebruikt om MPMVECs Ca ^{2 +} mobilisatie te lokken.
7. Analyseer fluo-4 fluorescentie-intensiteit verandert met behulp van ImageJ software (1.44) (zie paragraaf 6).

6. Data-analyse met behulp van software ImageJ

Breng de foto's verkregen van de confocale systeem als een. LSM formaat bestand voor data-analyse. ZEN 2009 en 2010 ZEN software die bij LSM 510 Meta confocale microscoop of LSM 710 confocale microscoop multifoton slaat respectievelijk bestanden in. LSM-indeling. Wij raden het gebruik van deze inheemse. LSM-bestanden voor beeldanalyse als originele kwaliteit behouden. Dit bestandsformaat kan direct worden geopend in beeldanalyse programma Image J. De volgende stappen zijn een voorbeeld kwantitatieve analyse van enkele afbeelding. Geen extra plugins zijn niet nodig voor deze data-analyse.

1. Te openen. LSM-of. TIFF-bestand in Image J-programma via Bestand> Openen
2. Klik op het tabblad afbeelding> COLOR> SPLIT kanalen en split de groene en DIC kanalen. Gebruik het beeld van het groene kanaal voor verdere analyse.
3. Dubbelklik op en selecteer de 'Elliptical borstel selectie "tab en stel de pixel waarde op 20.
4. Voor Hyper-cyto afbeeldingen, klik op een enkele cel om het cirkelvormige gebied van de meting te definiëren. Druk vervolgens op "M" toets om de intensiteit van het geselecteerde gebied te meten. De waarden worden bewaard in een nieuw venster resultaten.
5. Next by houden "Shift" toets op een andere cel naar een ander gebied, gevolgd door het indrukken van "M" toets te selecteren. De intensiteit wordt opgenomen in het resultaat venster. Herhaal de stappen 4-5 op 50 verschillende cellen.
6. Voor Hyper d-mito beelden, is het de pixel waarde 10 in de elliptische borstel selectie. Regio van belang (ROI) moet handmatig worden getraceerd waaronder de mitochondriën van bepaalde cellen.
7. Met behulp van de vrije hand, spoor de regio van rond de mitochondria en druk vervolgens op "M". Herhaal de stappen 6-7 op 50 verschillende cellen.
8. Kopieer de me een waarden van de resultaten raam en plakken in een Excel-blad of enige software om de resultaten plot. We maken gebruik van zowel SigmaPlot of GraphPad PRISM om de gegevens als grafiek plot.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1 toont cytosolische en mitochondriale ROS productie na uitdaging met TLR liganden. Vertegenwoordiger van confocale beelden tonen verhoging van de DCF (cytosolische) en MitoSOX Red (mitochondriën) fluorescentie na 6 uur van stimulatie. Fluorescentie veranderingen waren genormaliseerd en uitgedrukt als fold veranderen.

Figuur 2 toont het genereren van stabiele Hyper-cyto-en Hyper-dMito endotheelcellen. Muis endotheliale cellen werden getransfecteerd met pHyPer-cyto of pHyPer-dMito plasmide constructen via elektroporatie. Cellen die stabiel tot expressie plasmiden werden geselecteerd met G418 voor twee weken. Na selectie, werden verdund cellen gezaaid in 96 well platen. Individuele kolonies werden geïsoleerd en afgebeeld voor homogene expressie.

Figuur 4 toont de beoordeling van de macrofaag-afgeleide ROS geïnduceerde endotheelcellen cytosolische Ca ^{2 +} mobilisatie. LPS gestimuleerde macrofagen werden toegevoegd aan pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVEC) die eerder waren geladen met de intracellulaire Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} i) indicator kleurstof Fluo-4. Toepassing van de wild-type LPS-geactiveerde macrofagen opgeroepen een [Ca ^{2 +]} i stijging van de PMVECs die werd verzwakt door knock-out van functionele NADPH oxidase (Gp91 ^{phox-/ -).}

Figuur 1. Visualizatieen van macrofagen geproduceerd cellulaire en mitochondriale ROS superoxide. J774.1 cellen werden uitgedaagd met TLR2, 3 en 4 liganden (2 ug / ml, lipoteichoïnezuur-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 ug / ml LPS-TLR4). Gedurende 6 uur bij 37 ° C. Na de behandeling werden de cellen geladen met (A) cellulaire ROS-indicator (H ₂ DCF-DA, groene fluorescentie) of (B) mitochondriale superoxide indicator (MitoSOX rood, rode fluorescentie). (C) Antimycin A werd gebruikt als een positieve controle voor mitochondriale ROS productie. Fluorescentie-intensiteit veranderingen werden beoordeeld met behulp van confocale microscopie. (D) en (E) Kwantificering van de gemiddelde fluorescentie te veranderen.

Figuur 2. Schematische weergave van het genereren van stabiele expressie van endotheliale cel-cytosolische en mitochondriale ROS indicatoren.

Figuur 3. V. isualization van endotheliale cytosolische en mitochondriale H ₂ O ₂ verdiepingen MPMVECs stabiel te drukken (A) Hyper-cyto of (B) Hyper-dMito werden uitgedaagd met TLR2, 3 en 4 liganden (2 ug / ml, lipoteichoïnezuur-TLR2; 10μg / ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 ug / ml LPS-TLR4) voor 6 uur bij 37 ° C. (C) Antimycin A werd gebruikt als een positieve controle voor mitochondriale ROS productie. Na de behandeling werden de fluorescentie-intensiteit verandert beoordeeld met behulp van confocale microscopie. (D) en (E) Kwantificering van de gemiddelde fluorescentie te veranderen.

Figuur 4. Macrofaag-afgeleide ROS te lokken verminderde endotheelcellen Ca ^{2 +} mobilisatie. (A) Schematische weergave van endotheelcellen / macrofagen co-cultuur model te bestuderen. (B) Vers geïsoleerde murine macrofagen van zowel WT en gp91phox null muizen (The Jackson Laboratory) werden geactiveerd door 1 ug / ml LPS voor 6 uur Macrophages werden gemerkt met cell-tracker Red (rood) en toegevoegd aan Fluo-4 geladen PMVECs (groen) tot paracriene O ₂ ^• te beoordelen ^-. signalering (C) LPS-geactiveerde macrofagen geïsoleerd van WT muizen veroorzaakt grote en snelle Ca ^{2 +} mobilisatie in PMVECs ten opzichte van macrofagen uit gp91phox null muizen. Validatie van activering van macrofagen is al eerder aangetoond.

De hier beschreven methode maakt een snelle en kwantitatieve meting van zuurstofradicalen in levende cellen hetzij met behulp van oxidatie gevoelige kleurstoffen of plasmide sensoren. Agonisten van TLR (Toll-like receptoren) zijn verbindingen die de cellen te stimuleren door middel van de TLR's aanwezig op het celoppervlak en leiden tot de stroomafwaartse signaalwegen ^15. In ons protocol, gebruikten we drie verschillende TLR-agonisten te weten, Lipo-teichoic zuur-TLR2 agonist, Poly (I: C). TLR3-agonist; LPS-TLR4 agonist, die worden gerapporteerd aan ROS induceren als een modelsysteem voor de ROS meting aan te tonen . Meting van ROS gebruik oxidanten gevoelige kleurstof is snel en kan worden gebruikt om verschillende soorten ROS te meten. Het gebruik van plasmide-gebaseerde sensor detecteert selectief Hyper H ₂ O ₂ niveaus. H ₂ O ₂ is stabieler oxidant en ook het gebruik van Hyper cyto-en Hyper-dMito in een stabiele cel instelling voegt de voordeel ten opzichte van foto-autooxidation van ROS gevoelige fluorescerende kleurstoffen.Hyper veroorzaakt geen artefactuele ROS generatie en kan gebruikt worden voor de detectie van snelle veranderingen van H ₂ O _{2-concentratie} in verschillende cel-compartimenten onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Cellen die stabiel de uiting van de Hyper-sensoren worden gebruikt voor klonale selectie van de bevolking dat meer betrouwbare en nauwkeurige metingen van H ₂ O ₂ niveaus biedt. Belangrijk is dat deze methode beschrijft ook de detectie en kwantitatieve meting van Ca ^{2 +} mobilisatie in levende cellen veroorzaakt door paracriene afgeleid ROS uit de naburige cellen, zoals aangeboren immuunsysteem cellen. Deze experimentele procedure in combinatie met confocale microscopie kan erg nuttig zijn om belangrijke spatio-temporele veranderingen laten zien in de cel signaaloverdracht gebeurtenissen vooral in gevallen waar twee verschillende celtypen betrokken zijn. Hoewel, de vertegenwoordiger van experimenten beschreven in dit document zijn slechts een voorbeeld van de aard van de onderzochte interactie, kan deze techniek gemakkelijk eendapted om cellulaire interacties tussen de verschillende live-celtypen te bestuderen.