Visualisering af Vascular Ca ^{2 +} Signaling Triggered ved Paracrine Afledte ROS

Reaktive ilt arter kan måles i levende celler ved hjælp af oxidation følsomme farvestoffer (1 & 2) eller ved anvendelse af plasmidet sensorer (3 & 4) af konfokal mikroskopi.

1. Visualisering af cytosole ROS i J774 celler

1. Grow J774.1 musen monocyt-afledte makrofager (10 ⁶ celler / ml) på glasbund 35-mm retter (Harvard apparater) i 48 h.
2. Challenge celler med TLR agonister (2 mg / ml, Lipo-teichoic syre-TLR2 agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 agonist, 1 mg / ml LPS-TLR4 agonist) til 6 timer ved 37 ° C.
   Bemærk: Makrofager behandlet på samme vilkår blev brugt til co-kultur model Ca ^{2 +} mobilisering.
3. Tilføj oxidation-følsomme dye H ₂ DCF-DA (Invitrogen) for at give en endelig koncentration på 10 ìm i ECM (Ekstracellulær medium: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 10mM glucose og 2,0% dextran, pH 7,4, alle fra Sigma), indeholdende 2% BSA til retter og inkuber celler i 20 min før visualisering under konfokal mikroskopi.
4. Efter farvestof lastning, visualisere celler placeret på en temperatur kontrolleret fase af en passende billeddiagnostisk system. Vi bruger Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal imaging-system kombineret med argon ion laser kilde til en excitation af 488 nm for DCF fluorescens bruge 40x olie mål ¹³ (Fig. 1A og D).
5. Analyser billeder med ImageJ software (1.44), frit tilgængelig software fra National Institutes of Health (Rasband, var ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualisering af markedsoperationer i J774 celler

1. Grow J774.1 musen monocyt-afledte makrofager (10 ⁶ celler / ml) på glasbund 35-mm retter (Harvard apparater) i 48 h.
2. Challenge cellerne med TLR ligander til at inducere primære markedsoperationer produktion (2 mg / ml, Lipo-teichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C.
3. Tilføj mitokondrie superoxid indikator MitoSOX Rød (Invitrogen) for at give en endelig koncentration på 5 ìm i ECM indeholdende 2% BSA til retter og inkuberes celler i 30 min ved 37 ° C for at tillade indlæsning af MitoSOX Red.
4. Efter farvestof lastning, visualisere celler på en temperatur kontrolleret fase af et Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal Imaging System par med argon ion laser kilde til en excitation af 561 nm for MitoSOX Red fluorescens hjælp 40x olie mål (Fig 1B og E).
5. For kontrol eksperimenter, efter farvestof lastning tilføje PBS eller DMSO (negativ kontrol) eller 2μM Antimycin A (som mitokondrie superoxid generator-positive kontrol) til celler forud til billede prøven som beskrevet i punkt 2.4 (figur 1C).
6. Analyser billederne ved hjælp ImageJ software (1.44).

3. Visualizatiom af cytosole ROS i stabile Hyper-CYTO MPMVECs

1. Vi bruger pHyPer-cyto (Evrogen) et pattedyr udtryk vektor-kodning en fluorescerende sensor, Hyper, der lokaliserer i cytoplasmaet og specifikt sanser submicromolar koncentration af H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfect murine Pulmonal mikrovaskulære endotelceller (MPMVECs) med pHyPer-CYTO vektor ved hjælp af enten elektroporation eller transfektion reagenser. Vi bruger 10 x 10 ⁶ celler og transfect med 10μg af pHyPer-cyto via elektroporation hjælp BioRad Gene impulsgiver electroporator system (250V, 500 μF). Kultur MPMVECs i DMEM medium suppleret med 10% FBS, uvæsentlige aminosyrer, endotel vækst supplere og antibiotika.
   Bemærk: Efter transfektering, plade celler ved lav tæthed for at lette koloni vækst.
3. Udskift medium med komplet kultur medium suppleret med 500 mg / ml G418, 48 timer efter transfektion. Skærm for kloner, der har højeste andel af H yPer positive celler og passage Hyper positive kloner for at øge antallet af Hyper positive celler (fig. 2).
   Bemærk: Vi bruger seriel fortynding af celler til klonselektion af enkelte celler og skærm for en stabil celler yderst udtrykker Hyper.
4. Grow stabil Hyper-cyto MPMVECs på 0,2% gelatine coated dækglas (80% sammenløb). Næste dag udfordring celler med TLR ligander (2 mg / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C. Ubehandlet celler tjener som kontrol.
5. Efter behandlingen, monter dækglas på Attofluor celle kammer (Invitrogen). Tilsæt 1 ml præ varmede Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) til kammeret og sted i kammeret på en temperatur kontrolleret fase af Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal imaging system. Visualiser og image fluorescens ændre på et excitation af 488 nm med 40x olie mål (Fig. 3A og D).
6. Analyser billeder med ImageJ software (1,44) (se afsnit 6).

1. Vi bruger pHyPer-dMito (Evrogen) et pattedyr vektor kodning mitokondrier målrettet Hyper, der lokaliserer i mitokondrierne og specifikt sanser submicromolar koncentration af H ₂ O _2.
2. Transfect MPMVECs med pHyPer-dMito og generere en stabil Hyper-dMito MPMVECs følgende trin, der er beskrevet i afsnit 3,2-3,3.
3. Grow stabil Hyper-dMito MPMVECs på 0,2% gelatine coated dækglas (80% sammenløb).
4. Næste dag udfordring celler med TLR ligander (2 mg / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C. Ubehandlet celler fungerer som negativ kontrol. Tilføj 2μM Antimycin A (mitokondrie superoxid inducer-positiv kontrol) forud for visualisere prøve.
5. Efter behandlingen, monter dækglas på Attofluor celle kammer (Invitrogen). Tilsæt 1 ml forvarmet Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) til kammeretog sted i kammeret på en temperatur kontrolleret fase af Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal imaging system. Visualiser og image fluorescens ændre på et excitation af 488 nm med 40x olie mål (Fig. 3B, C og E).
6. Analyser billeder med ImageJ software (1,44) (se afsnit 6).

5. Co-kultur model til visualisering af paracrine-afledte ROS udløst Ca ^{2 +} signalering i endotelceller

Til visualisering og måling af [Ca ^{2 +]} i ændringer, vi bruger en Ca ^{2 +} følsomme fluorescerende farvestof Fluo-4 AM (Invitrogen).

1. Dyrk MPMVECs på 0,2% gelatine coated 25mm glas dækglas (80% sammenløb).
2. Inkuber cellerne dyrkes på dækglas ved stuetemperatur i 30 min i ECM indeholdende 2% BSA og 0,003% pluronic syre med 5 m Fluo-4 AM (Invitrogen) endelig koncentration for at tillade indlæsning af Fluo-4 AM. Efter læsning, vask celler med eksperimentelle imaging løsning (ECM indeholdende 0.25% BSA) indeholdende sulfinpyrazon at minimere farvestof tab.
3. Efter læsning Fluo-4, montere dækglas på Attofluor celle kammer (Invitrogen). Tilføj 800μl af præ varmede eksperimentel billeddannelse løsning på kammeret og placere den på en temperatur kontrolleret fase af Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal imaging system.
4. I en separat rør mærke nonactivated eller aktiverede makrofager isoleret fra enten vild-type eller gp91 ^{PHOX-/ -} mus (behandlet med LPS i 6 timer) med celle tracker rød CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) i ECM indeholdende 2% BSA og 0,003% pluronic syre. Vask og resuspender celler med 200μl af eksperimentelle imaging løsning.
5. Tilføj mærket makrofager på Fluo-04:00 indlæst MPMVECs i kammeret forsamling.
6. Optag den grønne og røde fluorescens hver 3'ere i 10-20 min ved hjælp af Carl Zeiss LSM510 Meta konfokal imaging system med en argon ion laser kilde med excitation ved 488 og 561 nm for Fluo-4 AM og celle tracker rød fluorescens respectively (Fig.4 AC).
   Bemærk: Alternativt kunne J774.1 cellelinie bruges til at fremkalde MPMVECs Ca ^{2 +} mobilisering.
7. Analyser Fluo-4 fluorescensintensitet ændringer ved hjælp ImageJ software (1,44) (se afsnit 6).

6. Dataanalyse med ImageJ software

Overfør billederne fås fra konfokale systemet som en. LSM format fil til dataanalyse. ZEN 2009 og ZEN 2010 software der følger med LSM 510 Meta konfokal mikroskop eller LSM 710 multiphoton konfokal mikroskop henholdsvis gemmer filer i. LSM-format. Vi anbefaler at bruge denne indfødt. LSM filer til billedanalyse som original kvalitet bevares. Denne fil format kan åbnes direkte i billedet analyseprogram Billede J. Følgende trin giver et eksempel på kvantitativ analyse af enkelt billede. Ingen ekstra plugins er nødvendige for denne dataanalyse.

1. Åbn. LSM-eller. TIFF-fil i Billede J program ved hjælp af Filer> Åbn
2. Klik på fanen IMAGE> COLOR> SPLIT KANALER og splitter de grønne og DIC-kanaler. Brug billede fra den grønne kanal til efterfølgende analyse.
3. Dobbeltklik og vælg "Elliptical børste valg"-fanen og indstil pixel værdien til 20.
4. For Hyper-cyto billeder, skal du klikke på en enkelt celle til at definere cirkulært område på måling. Tryk derefter på "M" for at måle intensiteten af ​​det valgte område. De værdier er bevaret i et nyt resultater vindue.
5. Næste ved at holde "Shift"-tasten klik på en anden celle for at markere et andet område, efterfulgt af at trykke på "M"-tasten. Intensiteten er optaget i resultatet vinduet. Gentag trin 4-5 på 50 forskellige celler.
6. For Hyper d-Mito billeder, skal du angive pixel værdien til 10 i Elliptical pensel valg. Region of interest (ROI) skal manuelt spores herunder mitokondrier af bestemte celler.
7. Brug frihånd, regionen spore rundt omkring i mitokondrierne, og tryk derefter på "M". Gentag trin 6-7 på 50 forskellige celler.
8. Kopier mig en værdier fra de resultater, vindue og indsæt i et Excel-ark eller noget software til at plotte resultaterne. Vi bruger enten SigmaPlot eller Graphpad PRISM at plotte data som grafen.

7. Repræsentative resultater

Figur 1 viser cytosol og mitokondrier ROS produktion på udfordringen med TLR ligander. Repræsentant konfokal billeder viser stigning på DCF (cytosol) og MitoSOX Rød (mitochondrier) fluorescens efter 6 timers stimulation. Fluorescens ændringer blev normaliseret og udtrykt som fold-ændringen.

Figur 2 viser den generation af stabile Hyper-CYTO og hyper-dMito endothelceller. Mus endotelceller blev transficeret med pHyPer-CYTO eller pHyPer-dMito plasmid konstruerer via elektroporation. Celler stabilt udtrykke plasmider blev udvalgt med G418 i to uger. Efter udvælgelsen blev fortyndet celler seedet i 96 godt plader. Individuelle kolonier blev isoleret og filmede for homogene udtryk.

Figur 4 viser vurderingen af makrofag-afledte ROS induceret endotel cytosole Ca ^{2 +} mobilisering. LPS-stimulerede makrofager blev tilføjet på pulmonal mikrovaskulære endotelceller (PMVEC), der tidligere er blevet lastet med den intracellulære Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} i) indikator dye Fluo-4. Anvendelse af vildtype LPS-aktiverede makrofager fremkaldt et [Ca ^{2 +]} i stigende PMVECs, der blev svækket af knockout af funktionelle NADPH oxidase (gp91 ^{PHOX-/ -).}

Figur 1. Visualizatiom af makrofag genereret cellulære ROS og mitokondrie superoxid. J774.1 celler blev udfordret med TLR2, 3 og 4 ligander (2 mg / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4). For 6 timer ved 37 ° C. Efter behandlingen celler blev lastet med (A) cellulære ROS indikator (H ₂ DCF-DA, grøn fluorescens) eller (B) mitokondrie superoxid indikator (MitoSOX Rød, rød fluorescens). (C) Antimycin A blev brugt som en positiv kontrol for mitokondrie ROS produktion. Fluorescensintensitet ændringer blev vurderet ved hjælp af konfokal mikroskopi. (D) og (E) kvantificering af middel fluorescens forandring.

Figur 2. Skematisk fremstilling af skabe stabile udtryk for endotelceller cytosol og mitokondrie ROS indikatorer.

Figur 3. V. isualization af endothel cytosol og mitokondrier H ₂ O _{2 etager} MPMVECs stabilt udtrykke (A) Hyper-cyto eller (B) Hyper-dMito blev udfordret med TLR2, 3 og 4 ligander (2 mg / ml, Lipoteichoic syre-TLR2; 10μg / ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) for 6 timer ved 37 ° C. (C) Antimycin A blev brugt som en positiv kontrol for mitokondrie ROS produktion. Efter behandlingen blev fluorescensintensitet ændringer vurderes ved hjælp af konfokal mikroskopi. (D) og (E) kvantificering af middel fluorescens forandring.

Figur 4. Makrofag-afledte ROS fremkalde forringet endotelceller Ca ^{2 +} mobilisering. (A) Skematisk fremstilling af endothelceller / makrofag co-kultur model undersøgelse. (B) frisk isolerede murine makrofager fra både WT og gp91phox null mus (The Jackson Laboratory) blev aktiveret med 1 mg / ml LPS i 6 h. Macrophages var mærket med celle-tracker Red (rød) og blevet tilføjet noget Fluo-4 indlæst PMVECs (grøn) til at vurdere paracrine O ₂ ^{• -.} signalering (C) LPS-aktiverede makrofager isoleret fra WT mus udløste store og hurtige Ca ^{2 +} mobilisering i PMVECs forhold til makrofager fra gp91phox null mus. Validering af makrofag aktivering er påvist tidligere.

Metoden beskrives her giver hurtig og kvantitativ måling af reaktive ilt arter i levende celler, enten ved hjælp af oxidation følsomme farvestoffer eller plasmid sensorer. Agonister af TLRs (Toll-lignende receptorer) er stoffer, der stimulerer celler gennem TLRs stede på celleoverfladen og udløse downstream signalveje ^15. I vores protokol, brugte vi tre forskellige TLR agonister nemlig, Lipo-teichoic syre-TLR2 agonist, Poly (I: C).-TLR3 agonist; LPS-TLR4 agonist, som er rapporteret at inducere ROS som et modelsystem til at demonstrere ROS måling . Måling af ROS ved hjælp af oxidanter følsom farvestof er hurtig og kan bruges til at måle forskellige ROS arter. Brugen af plasmid baserede sensor Hyper selektivt detekterer H ₂ O ₂ niveauer. H ₂ O ₂ er mere stabil oxidant og også brugen af Hyper CYTO og Hyper-dMito i en stabil celle indstilling tilføjer den fordel i forhold til foto-autooxidation af ROS følsomme fluorescerende farvestoffer.Hyper forårsager ikke kunstig ROS generation og kan bruges til påvisning af hurtige ændringer af H ₂ O _{2-koncentrationen} i anden celle rum under forskellige fysiologiske og patologiske tilstande. Celler stabilt udtrykke Hyper sensorer anvendes til klonselektion af befolkningen, der byder på mere pålidelige og nøjagtige målinger af H ₂ O ₂ niveauer. Vigtigere er det, denne metode beskriver også påvisning og kvantitativ måling af Ca ^{2 +} mobilisering i levende celler udløst af paracrine afledt ROS fra de omkringliggende celler såsom medfødte immunceller. Denne eksperimentelle procedure kombineret med konfokal mikroskopi kan være meget nyttigt at afsløre vigtige spatio-temporale ændringer i celle-signal transduktion begivenheder specielt i tilfælde, hvor to forskellige celletyper er involveret. Selvom, de repræsentative eksperimenter beskrevet i dette papir er blot ét eksempel på den type af de undersøgte interaktion, kan denne teknik være let endapted at studere cellulære interaktioner mellem flere leve celletyper.