Visualisering av Vascular Ca ^{2 +} Signalering Triggade av parakrina Härledda ROS

Reaktiva syreradikaler kan mätas i levande celler med oxidation känsliga färgämnen (1 & 2) eller med hjälp av plasmid sensorer (3 & 4) genom konfokalmikroskopi.

1. Visualisering av cytosolic ROS i J774 celler

1. Väx J774.1 mus monocyte-derived makrofager (10 ⁶ celler / ml) på glas botten 35 mm-rätter (Harvard apparater) för 48 h.
2. Utmana celler med TLR-agonister (2 mikrogram / ml, Lipo-teichoic syra-TLR2 agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 agonist, 1 mikrogram / ml LPS-TLR4 agonist) i 6 timmar vid 37 ° C.
   Obs: Makrofager behandlas på liknande villkor har använts för samarbete kultur modell Ca ^{2 +} mobilisering.
3. Lägg till oxidation känsliga färg H ₂ DCF-DA (Invitrogen) för att ge en slutlig koncentration på 10 nm i ECM (extracellulära mediet: 121 mM NaCl, 5 mm NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mm KH ₂ PO _4, 1,2 mm MgSO _4, 2 mm CaCl _2, 10mM glukos och 2,0% dextran, pH 7,4, alla från Sigma) innehållande 2% BSA till rätter och inkubera celler i 20 minuter innan visualisering i konfokalmikroskopi.
4. Efter färgämne lastning, visualisera celler placeras på en temperaturstyrd skede av en lämplig bildhanteringssystem. Vi använder Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokala Imaging System tillsammans med Argon-jon-laserkälla på en excitation av 488 nm för DCF fluorescens med 40x olja mål ¹³ (Fig. 1A och D).
5. Analysera bilder med ImageJ programvara (1,44), fritt tillgänglig programvara från National Institutes of Health Rasband (, var ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualisering av nerna i J774 celler

1. Väx J774.1 mus monocyte-derived makrofager (10 ⁶ celler / ml) på glas botten 35 mm-rätter (Harvard apparater) för 48 h.
2. Utmana cellerna med TLR ligander att framkalla nerna produktion (2 mikrogram / ml, Lipo-teichoic syra-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mikrogram / ml LPS-TLR4) för 6 h vid 37 ° C.
3. Lägg till mitokondrie-superoxid indikator MitoSOX Röd (Invitrogen) för att ge en slutlig koncentration på 5 mikrometer i ECM innehållande 2% BSA till rätter och inkubera celler för 30 min vid 37 ° C för att möjliggöra lastning av MitoSOX Röd.
4. Efter färgämne lastning, visualisera celler på en temperaturstyrd skede av ett Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokala bildsystem par med Argon-jon-laserkälla på en excitation av 561 nm för MitoSOX Red fluorescens med 40x olja mål (Fig. 1B och E).
5. För styrning experiment, efter färgen lastning lägga PBS eller DMSO (negativ kontroll) eller 2μM Antimycin A (som mitokondriell superoxid generator-positiv kontroll) till celler innan bilden provet som beskrivs i 2,4 (fig 1c).
6. Analysera bilder med ImageJ programvara (1,44).

3. Visualizatiom i cytosoliskt ROS i stabila Hyper-cyto MPMVECs

1. Vi använder pHyPer-CYTO (Evrogen) ett däggdjur uttryck vektor kodar en fluorescerande sensor Hyper som lokaliserar i cytoplasman och specifikt sinnen submicromolar koncentrationen av H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfektera Murine Pulmonell endotelceller i små kärl (MPMVECs) med pHyPer-CYTO vektor med antingen elektroporation eller reagenser transfektion. Vi använder 10 x 10 ⁶ celler och transfektera med 10 mikrog pHyPer-CYTO via elektroporation med BioRad Gene PULSER electroporator system (250V, 500 uF). Kultur MPMVECs i DMEM mediet kompletteras med 10% FBS, oväsentliga aminosyror, endothelial growth komplettera och antibiotika.
   OBS: Efter transfektion, tallrik celler vid låg densitet för att underlätta koloni tillväxt.
3. Byt medium med komplett odlingsmedium kompletteras med 500 mikrogram / ml G418, 48 timmar efter transfektion. Skärm för kloner som har högst andel H yPer positiva celler och passage Hyper positiva kloner för att öka antalet Hyper positiva celler (Fig. 2).
   Observera: Vi använder seriell spädning av celler för klonurvalet av enstaka celler och skärm för stabila celler högt uttrycka Hyper.
4. Grow stabil Hyper-CYTO MPMVECs på 0,2% gelatin bestruket täckglas (80% sammanflödet). Nästa dag utmaning celler med TLR ligander (2 mikrogram / ml, Lipoteichoic syra-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mikrogram / ml LPS-TLR4) för 6 tim vid 37 ° C. Obehandlade celler fungerar som kontroll.
5. Efter behandling, montera täckglas på Attofluor cell kammare (Invitrogen). Tillsätt 1 ml före värmde Hanks balanserad saltlösning (HBSS) till kammaren och placera kammare på en temperaturstyrd skede av Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokala Imaging System. Visualisera och bild fluorescens förändring vid en excitation av 488 nm med 40x olja mål (Fig. 3A och D).
6. Analysera bilder med ImageJ programvara (1,44) (se avsnitt 6).

1. Vi använder pHyPer-dMito (Evrogen) ett däggdjur uttryck vektor kodning mitokondrier riktade Hyper som lokaliserar i mitokondrierna och i synnerhet sinnen submicromolar koncentrationen av H ₂ O _2.
2. Transfektera MPMVECs med pHyPer-dMito och genererar stabila Hyper-dMito MPMVECs följande steg beskrivs i avsnitt 3.2-3.3.
3. Grow stabil Hyper-dMito MPMVECs på 0,2% gelatin bestruket täckglas (80% sammanflödet).
4. Nästa dag utmaning celler med TLR ligander (2 mikrogram / ml, Lipoteichoic syra-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mikrogram / ml LPS-TLR4) för 6 tim vid 37 ° C. Obehandlade celler fungerar som negativ kontroll. Lägg 2μM Antimycin A (mitokondriellt superoxid inducerare-positiv kontroll) innan visualisera prov.
5. Efter behandling, montera täckglas på Attofluor cell kammare (Invitrogen). Tillsätt 1 ml förvärmda Hanks balanserad saltlösning (HBSS) till kammarenoch placera kammare på en temperaturstyrd skede av Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokala Imaging System. Visualisera och bild fluorescens förändring vid en excitation av 488 nm med 40x olja mål (Fig. 3B, C och E).
6. Analysera bilder med ImageJ programvara (1,44) (se avsnitt 6).

5. Co-kultur modell för visualisering av parakrina-derived ROS utlöst Ca ^{2 +} signalering i endotelceller

För visualisering och mätning av ^{[Ca2 +]} i förändringar vi använder en Ca ^{2 +} känsliga fluorescerande färg fluo-4 AM (Invitrogen).

1. Odla MPMVECs på 0,2% gelatin belagt 25mm glas täckglas (80% sammanflödet).
2. Inkubera cellerna odlas på täckglas i rumstemperatur i 30 min i ECM innehållande 2% BSA och 0,003% pluronic syra med 5 mikroM fluo-4 AM (Invitrogen) slutlig koncentration för att möjliggöra lastning av fluo-4 AM. Efter lastning, tvätta cellerna med experimentella imaging-lösning (ECM innehåller 0.25% BSA) som innehåller sulfinpyrazon för att minimera färgning av förlust.
3. Efter lastning fluo-4, montera täckglas på Attofluor cell kammare (Invitrogen). Tillsätt 800μl före värmde experimentella avbildning lösning på kammaren och placera den på en temperaturstyrd skede av Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokala Imaging System.
4. I ett separat rör märka nonactivated eller aktiverade makrofager isolerade från antingen vildtyp eller gp91 ^{phox-/ -} möss (behandlade med LPS för 6 tim) med cell tracker röd CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) i ECM innehållande 2% BSA och 0,003% pluronic syra. Tvätta och resuspendera cellerna med 200μl av experimentell avbildning lösning.
5. Lägg märkta makrofager till fluo-4:00 laddad MPMVECs i kammaren församlingen.
6. Spela in de gröna och röda fluorescens alla 3s i 10-20 minuter med hjälp av Carl Zeiss LSM510 Meta konfokala imaging-system med en Argon-jon-laserkälla med excitation vid 488 och 561 nm för fluo-4 AM och cell-tracker röd fluorescens respectively (Fig.4 AC).
   Obs: Alternativt kan J774.1 cellinje skall användas för att framkalla MPMVECs Ca ^{2 +} mobilisering.
7. Analysera fluo-4 fluorescensintensiteten ändringar med ImageJ programvara (1,44) (se avsnitt 6).

6. Dataanalys med ImageJ programvara

Överföra bilderna från den konfokala systemet som en. LSM-fil för dataanalys. ZEN 2009 och ZEN 2010 programvara som levereras med LSM 510 Meta konfokalmikroskop eller LSM 710 multiphoton konfokalmikroskop sparar respektive filer i. LSM-format. Vi rekommenderar att använda den här personen. LSM filer för bildanalys som original kvalitet bibehålls. Detta filformat kan direkt öppnas i bildanalys programmet Bild J. Följande steg ger ett exempel på kvantitativ analys av en bild. Inga ytterligare insticksmoduler krävs för denna dataanalys.

1. Öppna. LSM eller. TIFF-fil i Image J programmet med Arkiv> Öppna
2. Klicka på fliken BILD> COLOR> Split kanaler och dela den gröna och DIC kanaler. Använd bilden från den gröna kanalen för senare analys.
3. Dubbelklicka och välj "Elliptical borsten val"-fliken och ställ in pixelvärde till 20.
4. För Hyper-CYTO bilder, klicka på en enda cell för att definiera den cirkulära området mätning. Tryck sedan på "M" för att mäta graden av det markerade området. Värdena är kvar i ett nytt resultat fönster.
5. Nästa genom att hålla "Shift" tangenten klicka på en annan cell för att välja ett annat område, följt av att trycka på "M". Intensiteten registreras i resultatfönstret. Upprepa steg 4-5 på 50 olika celler.
6. För Hyper d-mito bilder som pixelvärdet till 10 i den elliptiska pensel valet. Regionen av intresse (ROI) måste manuellt spåras bland annat mitokondrier av särskilda celler.
7. Använda frihand, spår regionen runt mitokondrierna och tryck sedan på "M". Upprepa steg 6-7 på 50 olika celler.
8. Kopiera mig ett värde av resultaten fönstret och klistra in i ett Excel-ark eller någon programvara för att rita resultaten. Vi använder antingen SigmaPlot eller Graphpad PRISM att plotta data som diagrammet.

7. Representativa resultat

Figur 1 visar cytosoliskt och mitokondrie ROS-produktionen på utmaning med TLR ligander. Representant konfokala bilder visar ökning med DCF (cytosolic) och MitoSOX Röd (mitokondrier) fluorescens efter 6 h av stimulering. Fluorescens förändringar normaliserades och uttrycks som faldig förändring.

Figur 2 visar generering av stabila Hyper-cyto och Hyper-dMito endotelceller. Mus endotelceller var transfekterade med pHyPer-CYTO eller pHyPer-dMito plasmid konstruktioner via elektroporation. Celler stabilt uttrycka plasmider valdes med G418 i två veckor. Efter valet var utspädd celler seedade i 96 brunnar. Individuella kolonier var isolerade och avbildat för homogena uttryck.

Figur 4 visar bedömningen av makrofager som härrör ROS inducerad endothelial cytosoliskt Ca ^{2 +} mobilisering. LPS-stimulerade makrofager lades in på lungorna mikrovaskulära endotelceller (PMVEC) som tidigare hade varit laddad med den intracellulära Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} i) indikator dye Fluo-4. Tillämpning av vild typ LPS-aktiverade makrofager framkallat en [Ca ^{2 +]} i stigande PMVECs som var försvagad genom knockout av funktionella NADPH-oxidas (gp91 ^{phox-/ -).}

Figur 1. Visualizatiom av makrofag genereras cellulära ROS och mitokondriella superoxid. J774.1 celler utmanas med TLR2, 3 och 4 ligander (2 mikrogram / ​​ml, Lipoteichoic syra-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mikrogram / ​​ml LPS-TLR4). För 6 h vid 37 ° C. Efter behandling celler var lastade med (A) cellulär ROS indikator (H ₂ DCF-DA, grön fluorescens) eller (B) mitokondriell superoxid indikator (MitoSOX Röd, röd fluorescens). (C) Antimycin En användes som positiv kontroll för mitokondriell ROS produktion. Fluorescensintensitet förändringar bedömdes med hjälp konfokalmikroskopi. (D) och (E) Kvantifiering av Medel Fluorescens förändring.

Figur 2. Schematisk bild för att generera stabila uttryck av endotelceller cytosolic och mitokondrie ROS indikatorer.

Figur 3. V. isualization av endotelceller cytosolic och mitokondrie H ₂ O ₂ nivåer MPMVECs stabilt uttryck (A) Hyper-CYTO eller (B) Hyper-dMito var utmanade med TLR2, 3 och 4 ligander (2 mikrogram / ​​ml, Lipoteichoic syra-TLR2, 10 mikrogram / ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 mikrogram / ml LPS-TLR4) för 6 tim vid 37 ° C. (C) Antimycin En användes som positiv kontroll för mitokondriell ROS produktion. Efter behandlingen var fluorescensintensiteten förändringar utvärderas med hjälp av konfokalmikroskopi. (D) och (E) Kvantifiering av Medel Fluorescens förändring.

Figur 4. Makrofager som härrör ROS framkalla nedsatt endotel Ca ^{2 +} mobilisering. (A) Schematisk representation av endotelceller / makrofager co-kultur-modellen studie. (B) Färskt isolerade murin makrofager från både WT och gp91phox null möss (The Jackson Laboratory) har aktiverats med 1 mikrogram / ​​ml LPS i 6 h. Macrophages var märkta med cell-tracker Red (röd) och läggas in på Fluo-4 laddad PMVECs (grön) för att bedöma parakrina O ₂ ^{• -.} signalering (C) LPS-aktiverade makrofager isolerade från WT möss utlöste stora och snabba Ca ^{2 +} mobilisering i PMVECs jämfört med makrofager från gp91phox null möss. Validering av makrofag aktivering har visats tidigare.

Den metod som beskrivs här tillåter snabb och kvantitativ mätning av reaktiva syreradikaler i levande celler, antingen med hjälp av oxidation känsliga färgämnen eller plasmid sensorer. Agonister av TLRs (Toll-liknande receptorer) är föreningar som stimulerar cellerna via TLRs som finns på cellytan och utlösa nedströms signalvägar ^15. I vårt protokoll, använde vi tre olika TLR-agonister nämligen, Lipo-teichoic syra-TLR2 agonist, Poly (I: C).-TLR3 agonist, LPS-TLR4 agonist som rapporteras att inducera ROS som modellsystem för att demonstrera ROS mätning . Mätning av ROS med oxidanter känslig färg är snabb och kan användas för att mäta olika ROS arter. Användningen av plasmid baserad sensor Hyper upptäcker selektivt H ₂ O ₂ nivåer. H ₂ O ₂ är mer stabil oxidationsmedel och även användning av Hyper CYTO och Hyper-dMito i en stabil cell inställning ger den fördelen framför foto-autooxidation av ROS känsliga fluorescerande färger.Hyper orsakar inte artefaktuella ROS generation och kan användas för detektion av snabba förändringar av H ₂ O _{2-koncentration} i olika cell fack under olika fysiologiska och patologiska tillstånd. Celler stabilt uttrycka Hyper sensorer används för klonurvalet av befolkningen som ger mer tillförlitliga och korrekta mätningar av H ₂ O ₂ nivåer. Viktigt beskriver metoden också att upptäcka och kvantitativ mätning av Ca ^{2 +} mobilisering i levande celler som utlöses av parakrina härrör ROS från närliggande celler, såsom medfödda immunceller. Denna experimentella procedur kombineras med konfokalmikroskopi kan vara mycket användbara för att avslöja viktig tid och rum förändringar i transduktion cell signal händelser i synnerhet i fall där två olika celltyper är inblandade. Men företrädaren experiment som beskrivs i detta dokument är bara ett exempel på den typ av studerade interaktion kan denna teknik lätt endapted att studera cellulära interaktioner mellan flera levande cell typer.