Visualización de Ca Vascular ^{2 +} Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Especies reactivas de oxígeno se puede medir en células vivas con tintes sensibles a la oxidación (1 y 2) o el uso de sensores de plásmido (3 y 4) por microscopía confocal.

1. Visualización de citosólica de ROS en células J774

1. Crecer J774.1 ratón macrófagos derivados de monocitos (10 ⁶ células / ml) en el fondo de cristal de 35 mm platos (Harvard Apparatus) durante 48 h.
2. Células desafío con agonistas TLR (2 ug / ml, Lipo-teicoicos ácido TLR2 agonista; 10μg/ml, poli (I: C)-agonista TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4 agonistas) durante 6 horas a 37 ° C.
   Nota: Los macrófagos tratados en condiciones similares se utilizaron para el modelo de co-cultivo de Ca ^{2 +} movilización.
3. Añadir el colorante sensibles a la oxidación de H ₂ DCF-DA (Invitrogen) para dar una concentración final de 10 mM de ECM (extracelular medio: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 10mM de glucosa y 2,0% de dextrano, pH 7,4, todos obtenidos de Sigma) que contiene 2% de BSA a los platos y las células se incuban durante 20 minutos antes de la visualización en microscopía confocal.
4. Después de cargar el medio de contraste, visualizar las células colocado en una etapa de control de temperatura de un sistema de imagen adecuado. Utilizamos Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagen confocal, junto con la fuente de iones de argón láser a una excitación de 488 nm para la DCF fluorescencia con objetivo de aceite 40x ¹³ (Fig. 1A y D).
5. Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44), software de libre disposición de los Institutos Nacionales de Salud (Rasband, WS, ImageJ, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU., http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualización de las OPF en células J774

1. Crecer J774.1 ratón macrófagos derivados de monocitos (10 ⁶ células / ml) en el fondo de cristal de 35 mm platos (Harvard Apparatus) durante 48 h.
2. Desafío de las células con ligandos TLR para inducir la producción de OPF (2 ug / ml, Lipo-teicoicos ácido TLR2; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 º C.
3. Añadir mitocondrial de superóxido indicador MitoSOX Roja (Invitrogen) para dar una concentración final de 5 mM de ECM que contiene 2% de BSA a los platos y las células se incuban durante 30 min a 37 ° C para permitir la carga de MitoSOX Roja.
4. Después de cargar el medio de contraste, visualizar las células en una etapa de control de temperatura de un objetivo Carl Zeiss LSM 510 Meta par sistema de microscopía confocal con láser de iones de argón fuente en una excitación de 561 nm para MitoSOX Red de fluorescencia con objetivo 40x de aceite (fig. 1B y E).
5. Para los experimentos de control, después de colorante de carga PBS añadir o DMSO (control negativo) o antimicina A 2μM. (Como el superóxido mitocondrial generador de control positivo) a las células antes de que la imagen de la muestra como se describe en el punto 2.4 (Fig. 1C)
6. Analizará las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44).

3. Visualizatien el citosol de ROS en el establo de la tecnología Hyper-cito MPMVECs

1. Utilizamos pHyPer-cito (Evrogen) una codificación de vector de expresión de mamíferos una hiper sensor fluorescente que se localiza en el citoplasma y, específicamente, la concentración de los sentidos submicromolar de H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfectar murino pulmonar células endoteliales microvasculares (MPMVECs) con pHyPer-cito vector utilizando electroporación o reactivos de transfección. Usamos 10 x 10 ⁶ células y transfección con 10μg de pHyPer-cito a través de electroporación utilizando BioRad Gene Pulser sistema electroporador (250, 500 mF). MPMVECs de cultivo en medio DMEM suplementado con 10% de SFB, aminoácidos no esenciales, suplemento de crecimiento endotelial y antibióticos.
   Nota: Después de la transfección, las células de la placa en baja densidad para facilitar el crecimiento de la colonia.
3. Vuelva a colocar medio con medio de cultivo completo suplementado con 500 mg / ml G418, 48 horas después de la transfección. Pantalla de los clones que tienen el mayor porcentaje de H yper células positivas y el paso de Hyper clones positivos para aumentar el número de hiper células positivas (Fig. 2).
   Nota: el uso de series de dilución de las células de la selección clonal de las células individuales y la pantalla para que las células que expresan muy estable Hyper.
4. Crecer estable Hyper-cito MPMVECs en gelatina 0,2% cubreobjetos recubiertos (80% de confluencia). A continuación las células días reto con ligandos TLR (2 ug / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 ° C. Las células no tratadas como control.
5. Después del tratamiento, montaje de los cubreobjetos en Attofluor células en la cámara (Invitrogen). Añadir 1 ml de solución de pre calentado salina equilibrada de Hanks (HBSS) a la cámara y coloque la cámara en un escenario de temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta System microscopía confocal. Visualizar y cambiar la imagen de fluorescencia a una excitación de 488 nm utilizando objetivo 40x de aceite (Fig. 3 A y D).
6. Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44) (ver sección 6).

1. Utilizamos pHyPer-dMito (Evrogen) un vector de expresión de mamíferos que codifican las mitocondrias-Hyper objetivo que se localiza en la concentración de los sentidos y, específicamente, las mitocondrias submicromolar de H ₂ O _2.
2. MPMVECs transfectar con pHyPer-dMito y creación de empleos estables Hyper-dMito MPMVECs siguientes pasos que se describen en la sección 3.2 a 3.3.
3. Crecer estable Hyper-dMito MPMVECs en gelatina 0,2% cubreobjetos recubiertos (80% de confluencia).
4. A continuación las células días reto con ligandos TLR (2 ug / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 ° C. Las células no tratadas como control negativo. Añadir antimicina 2μM una muestra (dismutasa mitocondrial inductor-control positivo) antes de la visualización.
5. Después del tratamiento, montaje de los cubreobjetos en Attofluor células en la cámara (Invitrogen). Añadir 1 ml de pre-calentado solución salina balanceada de Hanks (HBSS) a la cámaray el lugar de la cámara en un escenario de temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagen confocal. Visualizar y cambiar la imagen de fluorescencia a una excitación de 488 nm utilizando objetivo 40x de aceite (Fig. 3B, C y E).
6. Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44) (ver sección 6).

5. Co-cultivo modelo para la visualización de paracrina derivados de ROS activado Ca ^{2 +} señalización en las células endoteliales

Para la visualización y medición de la [Ca ^{2 +]} i cambios que el uso de Ca ^{2 +} sensibles tinte fluorescente fluo-4 AM (Invitrogen).

1. MPMVECs crecer en 0,2% de gelatina cubreobjetos recubiertos de vidrio de 25 mm (80% de confluencia).
2. Se incuban las células cultivadas en cubreobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos en ECM que contiene 2% de BSA y 0,003% de ácido plurónico con 5 M fluo-4 AM (Invitrogen) concentración final para permitir la carga de fluo-4 AM. Después de cargar, lavar las células con una solución de imágenes experimentales (ECM con 0.25% de BSA), que contiene sulfinpirazona para minimizar la pérdida de tinte.
3. Después de cargar el fluo-4, de montaje en cubreobjetos Attofluor células en la cámara (Invitrogen). Agregar 800μl de pre calentado solución de imágenes experimentales a la cámara y colocarlo en una etapa de control de temperatura de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagen confocal.
4. En una etiqueta del tubo por separado de los macrófagos activados o no activadas aislado de cualquier tipo salvaje o gp91 ^{phox / -} ratones (tratados con LPS durante 6 horas) con la célula de seguimiento de rojo CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) en ECM que contiene 2% de BSA y Pluronic 0,003% de ácido. Lavar y volver a suspender las células con 200μl de solución de imagen experimental.
5. Añadir macrófagos etiquetados a fluo-4 AM cargado MPMVECs en el conjunto de la cámara.
6. Registro de la fluorescencia verde y rojo cada 3 segundos durante 10-20 min con Carl Zeiss LSM510 Meta sistema de imagen confocal con una fuente láser de iones de argón con excitación a 488 y 561 nm de fluo-4 AM y la célula de seguimiento fluorescencia roja respectively (Fig. 4 AC).
   Nota: Como alternativa, J774.1 línea celular podría usarse para producir MPMVECs Ca ^{2 +} movilización.
7. Analizar fluo-4 cambios de intensidad de fluorescencia utilizando el software ImageJ (1,44) (ver sección 6).

6. Análisis de datos utilizando el software ImageJ

La transferencia de las imágenes obtenidas desde el sistema confocal como un archivo de formato. Lsm para el análisis de datos. ZEN ZEN 2009 y 2010 el software proporcionado con el microscopio confocal LSM 510 Meta o LSM 710 microscopio confocal multifotónica respectivamente guarda los archivos en formato lsm.. Recomendamos el uso de este nativo de archivos. Lsm para el análisis de imagen como la calidad original se mantiene. Este formato de archivo se pueden abrir directamente en la imagen de análisis de imágenes J. programa Los pasos siguientes proporcionan un ejemplo de análisis cuantitativo de una sola imagen. Sin plugins adicionales son necesarios para este análisis de datos.

1. Abierto. Lsm o. TIFF en el programa Image J con Archivo> Abrir
2. Haga clic en la imagen del separador> COLOR> Canales de split y dividir los canales verde y DIC. Utilice la imagen del canal verde para su posterior análisis.
3. Haga doble clic y seleccione la opción "selección elíptica cepillo" y configure el valor de píxel de 20.
4. Para Hyper-cito imágenes, haga clic en una celda para definir el área circular de la medición. A continuación, pulse "M" para medir la intensidad de la zona seleccionada. Los valores se mantienen en una ventana de nuevos resultados.
5. A continuación mediante la celebración de "Shift" haga clic en clave en una celda diferente para seleccionar otra área, seguido de la tecla "M". La intensidad se registra en la ventana de resultados. Repita los pasos 4-5 en 50 células diferentes.
6. Para Hyper d-mito imágenes, establezca el valor del píxel a 10 en la selección pincel elíptico. Región de interés (ROI) se ha trazado de forma manual como la mitocondria de las células en particular.
7. Utilizando mano alzada, la localización de la región de alrededor de la mitocondria y luego pulse "M". Repita los pasos 6-7 en 50 células diferentes.
8. Copia de la me uno de los valores de la ventana de resultados y pegar en una hoja de Excel o cualquier otro software para graficar los resultados. Utilizamos tanto SigmaPlot o GraphPad Prism para representar los datos como un gráfico.

7. Resultados representante

La figura 1 muestra la producción de ROS citosólica y mitocondrial en desafío con ligandos TLR. Representante imágenes confocal muestran un aumento de DCF (citosólica) y MitoSOX Roja (mitocondrias) de fluorescencia después de 6 horas de la estimulación. Cambios de fluorescencia se normalizaron y se expresa como doble cambio.

La figura 2 muestra la generación de estabilidad Hyper-cito y la tecnología Hyper-dMito las células endoteliales. Las células de ratón endotelial fueron transfectadas con pHyPer-cito o pHyPer-dMito plásmido construye a través de electroporación. Plásmidos células que expresan establemente fueron seleccionados con G418 durante dos semanas. Después de la selección, las células diluidas se sembraron en placas de 96 pocillos. Las colonias individuales fueron aislados y la imagen de la expresión homogénea.

La figura 4 muestra la evaluación de los macrófagos derivados de ROS inducida endotelial Ca citosólico ^{2 +} movilización. LPS-estimulado macrófagos se añadieron a las células pulmonares endoteliales microvasculares (PMVEC) que había sido previamente cargada con el Ca ^{2 +} intracelular ([Ca ^{2 +]} i) tinte indicador de Fluo-4. Aplicación de tipo salvaje LPS-macrófagos activados provocó una [Ca ^{2 +]} i aumento de PMVECs que fue atenuada por octavos de final de la NADPH oxidasa funcional (gp91 ^{phox-/ -).}

Figura 1. Visualizatien los macrófagos generados celular ROS y dismutasa mitocondrial. J774.1 células se estimularon con ligandos TLR2, 3 y 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4). Durante 6 horas a 37 º C. Después las células se cargaron con el tratamiento (A) celular ROS indicador (H ₂ DCF-DA, de color verde fluorescente) o (B) Indicador de dismutasa mitocondrial (MitoSOX Red; fluorescencia roja). (C) antimicina A fue utilizado como control positivo para la producción mitocondrial de ROS. Cambios en intensidad de fluorescencia se evaluó mediante microscopía confocal. (D) y (E) La cuantificación de cambio media de fluorescencia.

Figura 2. Representación esquemática de la generación de la expresión estable de citosólica y mitocondrial de las células endoteliales indicadores de ROS.

Figura 3. V. isualization del endotelio citosólica y mitocondrial de H ₂ O ₂ niveles MPMVECs que expresan establemente (A) Hyper-cito o (B) Hyper-dMito fueron desafiados con ligandos TLR2, 3 y 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg / ml, de poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 ° C. (C) antimicina A fue utilizado como control positivo para la producción mitocondrial de ROS. Después del tratamiento, los cambios de intensidad de fluorescencia se evaluó mediante microscopía confocal. (D) y (E) La cuantificación de cambio media de fluorescencia.

Figura 4. Macrófagos derivados de ROS provocan deterioro de las células endoteliales de Ca ^{2 +} movilización. (A) Representación esquemática de las células endoteliales / macrófagos co-cultivo modelo de estudio. (B) recién aislados macrófagos murinos de ambos WT y gp91phox ratones nulos (el laboratorio de Jackson) fueron activadas por 1 mg / ml de LPS durante 6 h. Macrophages fueron etiquetados con células-tracker Red (rojo) y se añade a Fluo-4 PMVECs carga (verde) para evaluar paracrina O ₂ ^{• -.} señalización (C) LPS-macrófagos activados aislado de ratones WT provocó grandes y rápidos de Ca ^{2 +} movilización PMVECs en comparación con los macrófagos de ratones nulos gp91phox. Validación de activación de los macrófagos se ha demostrado anteriormente.

El método aquí descrito permite una medición rápida y cuantitativa de las especies reactivas del oxígeno en las células vivas, ya sea usando tintes sensibles a la oxidación o los sensores de plásmido. Los agonistas de los TLR (Toll-like receptors) son compuestos que estimulan a las células a través de los TLR en la superficie celular y la activación de las vías de señalización hacia abajo ^15. En nuestro protocolo, se utilizaron tres diferentes TLR es decir agonistas, Lipo-teicoicos ácido TLR2 agonista; poli (I: C). TLR3-agonista, agonista TLR4 LPS-que se presentan para inducir ROS como un sistema modelo para demostrar la medición de ROS . La medición de ROS con tintes oxidantes sensible es rápida y puede ser usado para medir la variedad de especies ROS. El uso de Hyper plásmido sensor detecta de forma selectiva basado en H ₂ O _2. H ₂ O ₂ es oxidante más estable y también el uso de Hyper cito y Hyper-dMito en un entorno estable de células que añade la ventaja sobre la foto-autooxidación de ROS tintes fluorescentes sensibles.Hyper no causa artefactos generación de ROS y puede ser utilizado para la detección de cambios rápidos de H ₂ O ₂ concentración en compartimentos celulares diferentes en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Células que expresan establemente los sensores Hyper se utilizan para la selección clonal de la población que ofrece mediciones más precisas y confiables de H ₂ O _2. Es importante destacar que este método también se describe la detección y medición cuantitativa de la movilización de Ca ^{2 +} en las células vivas provocada por paracrina derivados de ROS en las células vecinas, tales como células del sistema inmune innato. Este procedimiento experimental en combinación con la microscopía confocal puede ser muy útil para revelar importantes cambios espacio-temporales en los eventos de transducción de señales celulares, especialmente en los casos en dos diferentes tipos de células están involucradas. Sin embargo, los experimentos representante detallada en este documento son sólo un ejemplo del tipo de interacción estudiada, esta técnica puede ser fácilmente undapted para estudiar las interacciones celulares entre varios tipos de células vivas.